Dieselin pakokaasujen altistuminen muuttaa seeprakalan aivojen neurodegeneraatioon liittyvien verkkojen ilmenemistä, osa 1

Abstrakti

Neurodegeneratiiviset sairaudet ovat suurin vammaisuuden aiheuttaja maailmassa, mutta niiden etiologiat ovat suurelta osin vaikeaselkoisia. Geneettiset tekijät voivat aiheuttaa vain vähäisen riskin useimpiin näistä sairauksista, mikä viittaa siihen, että ympäristötekijöillä on merkittävä rooli näiden sairauksien kehittymisessä.

Neurodegeneratiiviset sairaudet tarkoittavat sairautta, joka aiheuttaa aivosolujen rappeutumista eri syistä. Yleisiä ovat Alzheimerin tauti, Parkinsonin tauti, Huntingtonin tauti jne. Nämä sairaudet vaikuttavat aivojen hermosoluihin, mikä johtaa aivotoiminnan heikkenemiseen ja oireisiin, kuten muistiin, ajatteluun ja käyttäytymisen muutoksiin.

Meidän ei kuitenkaan tarvitse menettää positiivista asennettamme näiden sairauksien takia. On monia tapoja auttaa potilaita parantamaan muistia ja lievittämään oireita. Tarkastellaanpa joitain näistä menetelmistä:

Harkitse ensin fyysistä harjoittelua. Tutkimukset osoittavat, että fyysinen aktiivisuus parantaa aivojen verenkiertoa ja lisää kemikaalien, kuten dopamiinin ja endorfiinien, vapautumista, jotka auttavat suojaamaan ja parantamaan hermosolujen toimintaa. Samaan aikaan liikunta voi myös auttaa vähentämään ongelmia, kuten ahdistusta, masennusta ja unettomuutta, jolloin potilaiden elämä on miellyttävämpää.

Toiseksi, ylläpitää sosiaalisia suhteita. On myös erittäin tärkeää, että sosiaaliset verkostomme ovat tiiviisti yhteydessä toisiinsa liittyviin aivoalueisiin, ja sosiaalinen vuorovaikutus voi paitsi vähentää stressiä, myös parantaa aivojen terveyttä lisäämällä onnellisuutta, torjumalla masennusta ja paljon muuta.

Lopuksi syö hyvin ja nuku tarpeeksi. Näillä molemmilla puolilla voi olla merkittäviä vaikutuksia aivojen terveyteen. Hyvän ruokavalion ei tarvitse sisältää vain riittävästi ravintoaineita, vaan sen on myös vältettävä toistuvaa sokerin, tyydyttyneiden rasvojen ja kolesterolin kulutusta. Lisäksi riittävä uni voi auttaa torjumaan muistiongelmia eri vaiheissa, erityisesti sairauksia, kuten Alzheimerin tautia.

Lyhyesti sanottuna neurodegeneratiiviset sairaudet eivät tarkoita elämän odotusten luopumista. Positiivista asennetta säilyttäen on myös tarpeen ottaa käyttöön tieteellisiä ja tehokkaita menetelmiä elämänlaadun parantamiseksi. Lisää naurua ja enemmän auringonpaistetta auttavat sinua pysymään terveenä. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistia, ja Cistanche deserticola voi parantaa muistia merkittävästi, koska Cistanche deserticola on perinteinen kiinalainen lääkeaine, jolla on monia ainutlaatuisia vaikutuksia, joista yksi on parantaa muistia. Cistanche deserticolan teho johtuu sen sisältämistä useista aktiivisista ainesosista, mukaan lukien tanniinihappo, polysakkaridit, flavonoidiglykosidit jne. Nämä ainesosat voivat edistää aivojen terveyttä monin eri tavoin.

Napsauta Tiedä 10 tapaa parantaa muistia

Pitkäaikainen altistuminen ilmansaasteille on äskettäin todettu lisäävän Alzheimerin ja Parkinsonin taudin riskiä, ​​mutta sen vaikutuksen molekyylimekanismeja ei tunneta hyvin.

Dieselin pakokaasuhiukkasuutteelle (DEPe) altistuneet seeprakalat johtavat toimintahäiriöön autofagiaan ja hermosolujen menetykseen. Täällä altistimme seeprakalan alkiot DEPe:lle ja suoritimme heidän aivoistaan ​​korkean suorituskyvyn proteomisia ja transkriptomisia ilmentymisanalyysejä tunnistaaksemme ilmansaasteiden aiheuttamat patogeeniset reitit. DEPe-hoito muutti useita biologisia prosesseja ja signalointireittejä, jotka ovat tärkeitä hermostoa rappeutuville prosesseille, mukaan lukien ksenobioottinen aineenvaihdunta, fagosomien kypsyminen ja amyloidin prosessointi. Suurin geeniekspression induktio indusoi Cyp1A:ssa (yli 30--kertainen).

Tämän ilmentymismuutoksen merkitys vahvistettiin estämällä induktio käyttämällä CRISPR/Cas9:ää, mikä johti dramaattiseen herkkyyden lisääntymiseen DEPe-toksisuudesta, mikä vahvisti, että Cyp1A-induktio oli kompensoiva suojamekanismi.

Nämä tutkimukset tunnistivat häiriintyneitä molekyylireittejä, jotka voivat myötävaikuttaa hermoston rappeutumissairauksien patogeneesiin. Viime kädessä ilmansaasteiden molekyyliperustan määrittäminen lisää hermoston rappeutumisen riskiä auttaa kehittämään sairauksia modifioivia hoitoja.

Avainsanat

Ilmansaasteet · Dementia · Parkinsonin tauti · Alzheimerin tauti · Transkriptomiikka · Proteomiikka.

Johdanto

Ilmansaasteet vaikuttavat merkittävästi kuolleisuuteen, ja se liittyy hengityselinten sairauksiin, sydänsairauksiin, aivohalvaukseen, keuhkosyöpään ja diabetekseen. Uusi epidemiologinen näyttö tukee yhteyttä ilmansaastealtistumisen ja hermostoa rappeutuvien sairauksien, mukaan lukien Alzheimerin ja Parkinsonin taudin (AD ja PD) kehittymisen välillä (Fu et al. 2019). On vähän tutkimusta, jossa tutkitaan mekanismeja, joilla ilmansaasteet voivat lisätä AD- ja PD-riskiä, ​​mutta muutamat olemassa olevat tukevat syy-yhteyttä (Fu et al. 2019).

Proteiiniinkluusioiden kerääntyminen aivoihin on hermoston rappeutumishäiriöiden yleinen ominaisuus, ja se on todennäköisesti yleinen reitti, joka johtaa hermosolujen toimintahäiriöihin ja kuolemaan. Esimerkiksi amyloidi-beeta (A-beta) ja tau -rakenteiden muodostuminen ovat AD- ja -synukleiini (-syn) -aggregaattien tai Lewy-kappaleiden patologisia tunnusmerkkejä inPD:ssä (Ross ja Poirier 2004; Woulfe 2008).

Muutokset proteostaasissa näyttävät ainakin osittain olevan näiden aggregaattien muodostumisen taustalla, mutta tarkat mekanismit ovat vielä tuntemattomia ja voivat vaihdella yksilöillä riippuen geneettisistä ja ympäristöllisistä riskitekijöistä. Tiedämme, että A-betaor -syn:n lisääntynyt ilmentyminen tai vähentynyt hajoaminen voi johtaa AD:hen ja PD:hen (Bostancıklıoğlu2019; Johnson et al. 2019).

Muita yleisiä neurodegeneratiivisten sairauksien piirteitä ovat tulehdus ja oksidatiivinen stressi. Aktivoitunut mikroglia, keskushermoston tulehdussolut, voidaan helposti havaita AD- ja PD-aivojen ruumiinavauksissa, ja ne todennäköisesti myötävaikuttavat hermosolujen rappeutumisen patogeneesiin (Kannarkat et al. 2013). Tämän tulehduksen ja mahdollisesti mitokondrioiden toimintahäiriön uskotaan johtavan oksidatiiviseen stressiin, jota arvostetaan myös ruumiinavauksilla tehdyissä aivoissa (Picca et al. 2020).

Suurin osa ilmansaasteita ja hermoston rappeutumista koskevista mekanistisista tutkimuksista on tähän mennessä keskittynyt tulehdukseen (Jayaraj ym. 2017). Ilmansaasteet näyttävät lisäävän sekä keskushermoston tulehdusta että oksidatiivista stressiä eläinten ja ihmisten aivoissa (Calderón-Garcidueñas ym. 2004, 2007, 2008a, b ja c; Levesque et al. 2011a, b, 2013; Moultonand Yang 2012; Mumaw et al.; 2017; Yokota et al. 2013a, b).

Erityisen kiinnostavia ovat havainnot, joiden mukaan ilmansaasteet lisäävät joidenkin tulehdusgeenien ilmentymistä hiirten hajupolttimoissa (OB), aivoalueella, jossa PD-patologia havaitaan sairauden varhaisessa vaiheessa (Levesque et al. 2011a, b; Yokota et al. 2013a). . Tulehduksia havaittiin myös kaupungeissa asuvilla koirilla verrattuna maaseudulla asuviin, ja kirjoittajat arvelivat, että nämä muutokset johtuivat korkeasta ilmansaasteesta (Calderón-Garcidueñas et al. 2003).

Samat kirjoittajat ehdottivat myös, että -syn kerääntyi kaupungeissa asuvien ihmisten aivoihin ilmansaasteiden vuoksi (Calderón-Garcidueñas ym. 2004, 2008a,b). Hiljattain tehdyssä seeprakalamallilla tehdyssä tutkimuksessa DEPe:lle altistumisen raportoitiin aiheuttavan neurotoksisuutta ja merkittävän hermosolujen määrän vähenemisen häiritsemällä autofagiaa (Barnhill et al. 2020).

DEPe sisältää monia ilmansaasteiden myrkyllisiä komponentteja ja sitä käytetään yleisesti altistumisen mallintamiseen soluviljelyjärjestelmissä (Costa ym. 2014; Hesterberg ym. 2010; Levesque ym. 2011b). Autofagia on välttämätön solunsisäinen mekanismi väärin laskostuneiden proteiinien ja vaurioituneiden organellien poistamiseksi ja hävittämiseksi.

Täsmällinen autofaginen aktiivisuus on todellakin välttämätöntä solujen homeostaasille, ja neuronien dysfunktionaalinen autofagia johtaa muuttuneeseen eloonjäämiseen ja neurodegeneraatioon (Kesidou et al. 2013). Monissa näistä tutkimuksista on selvät rajoitukset, mutta ne kaikki viittaavat siihen, että ilmansaastealtistus lisää AD:n riskiä. ja PD. Ymmärryksemme mekanismeista, joilla saastuminen lisää tätä riskiä, ​​on rajallinen, mutta erittäin hienojakoiset hiukkaset ja useat ilmansaasteen komponentit voivat päästä aivoihin joko suoraan hajutulpan kautta keuhkojen kautta verenkierron kautta (Kilian ja Kitazawa 2018).

Nämä hiukkaset koostuvat hiilidioksidin ytimestä ja adsorboituneista yhdisteistä, kuten polysyklisistä aromaattisista hiilivedyistä, metalleista, nitraateista, sulfaateista ja muista alkuaineista, ja ne muodostavat merkittävän osan ilmansaasteita erityisesti kaupunkialueilla. Monet näistä yhdisteistä ovat osallisena oksidatiivisessa stressissä ja soluissa. myrkyllisyys lisää uskottavuutta ilmansaasteiden ja neurodegeneraation syy-yhteydelle.

Yksityiskohtaiset monialaiset tutkimukset, mukaan lukien solu- ja eläinmallit, voivat antaa käsityksen sairauksien syistä ja ohjata tulevia terapeuttisia lähestymistapoja (Cannon ja Greenamyre 2011). In vivo -tutkimuksiin käytetyistä malliorganismeista Danio rerio (seeprakala) on tehokas malli toksikologian, molekyyligenetiikan, toksikogenomiikan ja lääkekehityksen tutkimiseen.

Useimmat biologiset reitit ovat erittäin konservoituneita selkärankaisilla, ja suurimmalla osalla ihmisen toiminnallisista geeneistä on homologeja seeprakaloissa (Vaz et al. 2018). Lisäksi seeprakalan alkiot kehittyvät nopeasti ja itsenäisesti, mikä mahdollistaa analyysin missä tahansa halutussa kehitysvaiheessa. Nämä ominaisuudet yhdessä nopean lisääntymisen ja alhaisten kasvatuskustannusten kanssa tekevät seeprakalasta suotuisan mallin ympäristöaltistuksen myrkyllisten vaikutusten tutkimiseen.

Taudin patogeneesin taustalla olevien molekyylimekanismien ymmärtämiseksi paremmin on kehitetty laaja valikoima korkean suorituskyvyn geeniekspression profilointimenetelmiä. Massaspektrometriaan perustuva proteomiikka ja korkean suorituskyvyn RNA-sekvensointi ovat erityisen lupaavia kiinnostavien biologisten reittien tunnistamisessa. Näitä tekniikoita on käytetty laajalti ymmärtämään solu- ja eläinmallien vastetta ympäristön ärsykkeisiin (Duan ym. 2017; García-Estrada ym. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková ym. 2012).

Tässä tutkimuksessa olemme jatkaneet ilmentymisanalyysejä DEPe-hoidon vaikutuksista seeprakalojen päiden proteomi- ja transkriptioprofiileihin. Pääosin aivokudoksesta koostuvien näytteiden eristäminen mahdollisti kudosspesifisempien profiilien saamisen ja muista kudoksista peräisin olevien vaikutusten minimoimisen. Kuvaamme tässä muuttuneita geenien ilmentymistä ja proteiiniprofiileja useissa reiteissä, jotka liittyvät hermoston rappeutumiseen DEPe-altistuneiden seeprakalojen päissä. Nämä tulokset tarjoavat uusia näkemyksiä mahdollisista mekanismeista, joilla ilman saastuminen lisää AD- ja PD-riskiä.

materiaali ja metodit

Kalojen hoito ja CRISPR/Cas{0}}välitteinen geneknockdown

Kaikki tutkimukset hyväksyttiin UCLA:n eläinoikeuskomiteassa. Seeprakaloja (AB) kasvatettiin valostimulaatiolla 1 tunnin ajan, ja yhteensä 200 munaa inkuboitiin 24 tuntia 28 asteessa. Tuloksena saadut alkiot dekoriasoitiin pronaasissa (2 mg/ml) ja käsiteltiin joko DEPe:llä (Standard Reference Materials, NIST, Gaithersburg, MD) lopullisessa pitoisuudessa 20 ug/ml tai vehikkelillä 5 päivään hedelmöityksen jälkeen (DPF).

Tämä konsentraatio valittiin, koska se johti hermosolujen katoamiseen, kuten aiemmin on raportoitu, mutta ilman merkittävää kuolleisuutta (Barnhillet al. 2020). Cyp1A knockdown -kala valmistettiin seuraavasti. Käyttämällä työkaluja, jotka ovat saatavilla osoitteessa http://crispr.mit.edu, CRISPR RNA (Cyp1A-crRNA) ) suunniteltiin sopivien PAM-kohtien sijainnin perusteella Cyp1A-geenin ensimmäisessä eksonissa.

Paras malli ostettiin IDT DNA:lta (www.idtdna.com) yhdessä standardin CRISPR-Cas9 tracrRNA:n kanssa. Cyp1Agenen ja tracrRNA:n crRNA suspendoitiin erikseen uudelleen 10 mM Tris-EDTA:han, jolloin saatiin 100 µM lopullinen pitoisuus. Sitten tracrRNA yhdistettiin crRNAin 1 x dupleksipuskurin (100 mM kaliumasetaatti; 30 mM HEPES, pH 7,5; IDT DNA) kanssa, jolloin saatiin 10 µM lopullinen pitoisuus. Seosta kuumennettiin 95 asteeseen 5 minuutin ajan kiehuvassa vesihauteessa ja jäähdytettiin hitaasti huoneenlämpötilaan komplementaaristen nukleotidisekvenssien incrRNA ja tracrRNA pariutumisen mahdollistamiseksi ja funktionaalisen ohjaus-RNA:n (gRNA) muodostumisen mahdollistamiseksi.

3 µl:n tilavuus pariutettua gRNA:ta yhdistettiin sitten samaan tilavuuteen luovuttajan yksijuosteista DNA:ta (ssDNA; 200 µM) kuin templaattisekvenssi mutantille Cyp1A. 3 ug Cas9-nukleaasia (IDT) 1 x injektiopuskurissa (5 mM KCl; 0,1 M natriumfosfaatti, pH 6,8) lisättiin seokseen lopullisen CRISPR/Cas9-ribonukleoproteiini (Cyp1A-RNP) -kompleksien muodostamiseksi.

Scramble RNP:n (SC-RNP) valmistamiseksi spesifinen Cyp1A-crRNA korvattiin kaupallisella Scramble-crRNA:lla ilman kohdetta genomissa. Nämä kaikkien tässä työssä käytettyjen oligonukleotidien sekvenssit on lueteltu lisätaulukossa 1. Munat injektoitiin stereomikroskoopilla noin 3 nl:lla RNP-injektioseosta.

Suoritettiin viisi biologista rinnakkaisinjektiota (jokainen kopio sisälsi 400–600 munaa, joihin oli injektoitu Cyp1A-RNP ja 100–200 injektoitua SC-RNP:tä), ja kaikki mikroinjektiot tehtiin 60 minuutissa. Munat laitettiin 100 mm:n muovisiin petrimaljoihin ja inkuboitiin 28 asteessa munavedessä. Alkioiden eloonjäämisastetta seurattiin jopa 7 päivää.

Kuvia eloon jääneistä kaloista tarkasteltiin epämuodostumien pisteytyksen varalta. Jokainen toukka pisteytettiin sokkoutettuna 4 kehitysepämuodostuman havaitsemiseksi, mukaan lukien pään epämuodostumat, hännän epämuodostumat, sydämen turvotus ja keltuaisen turvotus. Toukat, joilla oli kaikki 4 epämuodostumaa, saivat arvosanan 4, kun taas normaalisti kehittyvät toukat saivat arvosanan 0. Merkittävien erojen arvioimiseen käytettiin tilastollista T-testiä.

For more information:1950477648nn@gmail.com