Pyroptoosin säätelijöiden ja kasvaimen immuuni-mikroympäristön kattava analyysi kirkassoluisessa munuaissolukarsinoomassa

Lisätietoja: ottaa yhteyttätina.xiang@wecistanche.com

Abstrakti

Tausta: Yhä useammat todisteet ovat osoittaneet, että pyroptoosi voi säännelläkasvaimen immuuni-mikroympäristö(AIKA) vaikuttaa kasvaimen kehittymiseen. Erittäin immunogeenisenä kasvaimena kirkassoluinen munuaissolusyöpä (ccRCC) voi hyötyä immunoterapiasta, mutta siihen liittyvä pyroptoositutkimus ccRCC:n AIKANA on edelleen puutteellinen.

Menetelmät: Saatavilla olevat TCGA- ja GEO-tietokannoista peräisin olevat tiedot analysoitiin pyroptoosin eri ilmentymisprofiilien tunnistamiseksi ccRCC:ssä ja normaaleissa kudoksissa, ja pyroptoosin säätelijöiden korrelaatio TIME:n kanssa arvioitiin cCRCC:ssä.

Tulokset: Konsensusklusterointianalyysin mukaan alatyyppien kaksi erilaista ilmentymistasoa tunnistettiin vaikuttavan potilaan ennusteeseen, ja ne liittyivät histologiseen kasvainvaiheeseen ja luokkaan. Immuunisolut laskettiin CIBERSORT-algoritmilla. Korkeampia infiltroituneita B-soluja, jotka olivat naiiveja, T-soluja CD4-muistia lepääviä, NK-soluja lepääviä, monosyyttejä ja makrofageja havaittiin klusterissa 1, kun taas korkeampia infiltroituneita CD8- ja T-solujen, T-follikulaaristen auttajasolujen ja Tregien tasoja havaittiin klusterissa 2. Geenijoukon rikastusanalyysi osoitti, että klusteri 2 oli rikastunut useilla immuunijärjestelmään liittyvillä reiteillä, mukaan lukien JAK-STAT-signalointireitti. Lisäksi kahdeksan immuunitarkistuspisteen yli-ilmentyminen liittyi ccRCC:n kehitykseen, erityisesti klusterissa 2. Neljänä potentiaalisena keskeisenä pyroptoosin säätelijänä AIM2, CASP5, NOD2 ja GZMB vahvistettiin ccRCC:ssä RT-qPCR-analyysillä ja vahvistettiin edelleen HPA-tietokanta. Lisäpan-syöpäanalyysi viittasi siihen, että nämä neljä pyroptoosin säätelijää ilmentyivät eri tavalla ja liittyivät aikaan useissa syövissä.

Johtopäätös: Tämä tutkimus tarjosi kattavan kuvan pyroptoosin säätelijöistä ccRCC:n AIKANA, mikä saattaa tarjota potentiaalista arvoa immunoterapiolle.

Avainsanat: Kirkassoluinen munuaissolusyöpä, Pyroptoosi, Kasvaimen immuuni-mikroympäristö, Immuunitarkistuspisteet, Immunoterapia

Napsauta oppiaksesi, että herbasistorit hoitavat munuaisten toimintaa

Tausta

Munuaissolusyöpä(RCC) on yleisin aikuisten pahanlaatuinen kiinteä munuaiskasvain, ja se muodostaa noin 3 prosenttia kaikista aikuisten pahanlaatuisista kasvaimista ja 90 prosenttia munuaisten pahanlaatuisista kasvaimista[1]. Tällä hetkellä RCC:n aiheuttamien kuolemantapausten määrä maailmanlaajuisesti on ylittänyt 1,00,000 vuosittain, ja sairastuvuus ja kuolleisuus lisääntyvät 2-3 prosentin nopeudella joka 10. vuosi. [2]. WHO:n RCC-patologisen luokituksen vuoden 2004 version mukaan selkeäsoluisen munuaissolusyövän (ccRCC) ilmaantuvuus on noin 70 prosenttia [3]. Vaikka kirurginen resektio on edelleen paras hoito ccRCC:lle, tällä hetkellä ei ole tehokasta postoperatiivista adjuvanttihoitoa, eikä ccRCC ole herkkä sädehoidolle ja kemoterapialle. Kirjallisuuden mukaan 20-40 prosentilla potilaista uusiutuminen leikkauksen jälkeen [4]. Koska ccRCC on erittäin immunogeeninen kasvain, se voi hyötyä immunoterapiasta.

Pyroptoosi on eräänlainen ohjelmoitu solukuolema, johon liittyytulehduspatogeenisten mikro-organismien infektion tai muiden haitallisten signaalien laukaisemana [5]. Pyroptoosille on pääasiassa ominaista solujen turpoaminen, hajoaminen ja sytoplasmisen sisällön vapautuminen. Asianmukainen pyroptoosi on isännälle tärkeä mekanismi vastustaa vieraiden patogeenisten mikro-organismien aiheuttamaa infektiota. Liiallinen pyroptoosi on kuitenkin haitallista tai jopa kohtalokasta isännälle. Yhä useammat tutkimukset ovat osoittaneet, että pyroptoosilla on myös tärkeä rooli kasvainten kehittymisessä [6]. Pyroptoosi luo kasvaimia estävän ympäristön vapauttamalla tulehdustekijöitä. Pyroptoosi voi kuitenkin myös heikentää elimistön immuunijärjestelmää kasvainsoluja vastaan ​​ja kiihdyttää kasvainten kasvua eri syövissä. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että pyroptoosin tehokas proinflammatorinen vaikutus liittyy kasvaimen immuuni-mikroympäristön säätelyyn [7]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että pyroptoosilla on tärkeä rooli kasvaimen kehittymisessä ja kasvainten vastaisessa prosessissa. Pyroptoosin vaikutus ccRCC:n ennusteeseen on kuitenkin epäselvä. Kattava ymmärrys ccRCC:n pyroptoosista puuttuu edelleen, mukaan lukien pyroptoosin säätelijöiden ja kasvaimen immuuni-mikroympäristön välinen ylikuuluminen.

Tässä tutkimuksessa suoritimme kattavan retrospektiivisen analyysin, joka perustui The Cancer Genome Atlas (TCGA) -tietokantaan ja Gene Expression Omnibus -tietokantaan (GEO) arvioidaksemme pyroptoosin vaikutusta AIKAAN ja tutkimme edelleen pyroptoosin ja yksittäisen TIME:n välisiä taustamekanismeja. konsensusklusterianalyysiin perustuvat luonnehdinnat. Lisäksi tämä tutkimus vahvisti myös pyroptoosin ja immuunijärjestelmän kuuman tarkistuspisteen ilmentymisen välisen suhteen.

Materiaalit ja menetelmät

Tiedonkeruu ja differentiaalilausekkeen tunnistaminen

RNA-sekvensointitiedot (RNA-seq) 539 ccRCC-kudoksesta ja 72 normaalistamunuainenkudokset sekä vastaavat kliiniset piirteet TCGA-tietokannasta (https://portal.gdc.cancer.gov/) saatiin. GSE46699- ja GSE53757-tiedot GEO-tietokannasta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) kerättiin ja niitä käytettiin pyroptoosin säätelijän ilmentymisen arvioimiseen. Lisäksi yliopistolta saatiin TCGA-pan-syöpägeenien ilmentymistiedot 33 pahanlaatuisen kasvaimen tyypistä ja vastaavaa kliinistä tietoa, kuten mRNA:n (RNAss) ja DNA-metylaatioon (DNAss) sekä immuunialatyyppeihin perustuvat stemness-pisteet. Kalifornian Santa Cruzin tietokanta (UCSC Xena, http://xena.ucsc.edu/). 37 pyroptoosisäätelijää on esitetty lisätiedostossa 4: Taulukko S1 ja ne on poimittu aikaisemmista tutkimuksista [8, 9]. Käyttämällä "limma"-pakettia yli kaksinkertaiset muutokset ja väärän havaintosuhteen (FDR, säädetty p-arvo)<0.05 is="" considered="" differential="" gene="" expression.="" the="" immunohistochemistry="" (ihc)="" staining="" images="" of="" pyroptosis="" regulators="" in="" normal="" kidney="" and="" tumor="" tissues="" were="" analyzed="" and="" obtained="" from="" the="" hpa="" database="" (http://www.proteinatlas.org/).to="" compare="" the="" expression="" between="" normal="" and="" tumor="" samples,="" all="" tissues="" were="" selected="" using="" the="" same="">

Konsensusklusterointi

Yksimuuttujaa Cox-regressioanalyysiä käytettiin pyroptoosin säätelijöiden erottamiseen R-paketin "selviytymis" p-arvon kautta<0.05). consensus="" clustering="" was="" performed="" to="" explore="" the="" potential="" molecular="" subtype="" between="" the="" bca="" patients="" using="" the="" r="" package"consensus="" cluster="" plus".="" the="" cluster="" count="" (k)="" was="" set="" from="" 1="" to="" 9,="" and="" the="" best="" optimal="" k="" value="" was="" selected="" for="" further="">

Kasvaimen immuuni-mikroympäristön arviointi

CIBERSORTia, LM22-immuunigeenin allekirjoitukseen perustuvaa analyysityökalua, käytettiin ccRCC:n kasvaimen immuuni-infiltraatiotasojen arvioimiseen. Algoritmi ajettiin 1000 permutaatiolle ja ccRCC-näytteelle ulostulolla P<0.05 were="" selected="" for="" further="" analysis.="" the="" "estimate"="" package="" in="" r="" was="" used="" to="" evaluate="" the="" immune="" score="" and="" the="" stromal="" score.="" moreover,="" 8="" com-mon="" immune="" checkpoint="" genes,="" including="" pd-1,="" pd-l1,="" pd-l2,="" ctla4,="" siglec15,="" tigit,="" tim3,="" and="" lad3,="" were="" extracted="" and="" evaluated="" for="" their="" correlations="" with="" pyroptosis="" regulators="" in="">

Toiminnallinen rikastusanalyysi

Gene Ontology(GO) -analyysi ja Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -signalointireittianalyysi suoritettiin käyttämällä "cluster Profiler" -pakettia R:ssä. Lisäksi suoritettiin Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) erojen tunnistamiseksi joukossa. geenit, jotka ilmentyvät kahden klusterin välissä KEGG-reitin rikastamisessa. Permutaatioiden määrä suoritettiin 1000 kertaa

jokainen analyysi ja reitit säädetyllä p-arvolla<0.05 and="" q="" values=""><0.05 were="" considered="" statistically="">

Lääkevasteen ennustaminen

Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) -tietokannasta (https://www.cancerrxgene.org/) saatujen tietojen perusteella laskettiin ccRCC:n kemoterapeuttiset herkkyydet. Kolme yleistä kliinistä lääkettä valittiin ennustamaan kemoterapeuttista vastetta, ja R-pakettia "pRRophetic" käytettiin arvioimaan kemoterapeuttista vastetta, joka määritettiin puolet suurimmasta estävästä pitoisuudesta (IC50).

Solulinjat ja RT-qPCR-analyysi

Ihmisen ccRCC-solulinjat, 786-O ja Caki-1, toimitti Haixiang Shen, ja normaalin ihmisen munuaiskuoren epiteelisolulinjan, HK-2, toimitti Yanhong Ma.RPMI 1640-elatusainetta (Gibco), jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla (FBS, Gibco), käytettiin solujen viljelemiseen. Ja kaikkia soluja viljeltiin 37 asteessa 5 prosentin hiilidioksidilla. Kokonais-RNA:t uutettiin soluista Trizol Kitillä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ensimmäinen juoste (cDNA) käänteistranskriptoitiin ja sitä käytettiin templaattina qPCR-analyysissä, kuten aiemmin on kuvattu [10]. Pyroptoosin säätelijöiden (AIM2, NOD2, GZMB ja CASP5) ilmentymistasot mitattiin käyttämällä SYBR Green qPCR Kit -sarjaa (Takara, Japani). Geeninimi ja alukesekvenssit on lueteltu lisätiedostossa 5: Taulukko S2. Kaikkien geenien mRNA-tasot normalisoitiin GAPDH:ksi (endogeeninen normalisointiviite).

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä R-ohjelmistoa (http://www.R-project.org, versio 4.0.3), PERL-ohjelmointikieltä (versio 5.32.1.1, https://www.perl. org /), ja GraphPad Prism 8.0. Korrelaatiokertoimet laskettiin Spearmen- ja etäisyyskorrelaatioanalyyseillä. Kaplan-Meier-käyrät piirrettiin ja merkittävän eloonjäämiseron laskemiseen käytettiin log-rank-testiä. Wilcoxonin etumerkkitestiä käytettiin jatkuvien muuttujien analysointiin, kun taas chi-neliötestiä käytettiin kategoristen tietojen analysointiin. RT-qPCR-tulokset ilmaistiin keskiarvona ± SEM. Ryhmien väliset erot arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA:lla, jota seurasi ad hoc Dunnettin moninkertainen vertailutesti verrattaessa normaaleihin munuaissoluihin. P-arvoa alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä kaikissa analyyseissä.

Tulokset

Differentiaalisesti pyroptoosiin liittyvien säätimien tunnistaminen ja luokittelu

37 pyroptoosiin liittyvän geenin ilmentymistä verrattiin TCGA-KIRC-kohortissa, ja 11 geeniä tunnistettiin differentiaalisesti ilmentyneiksi geeneiksi (kuvio 1A). Kun kahta riippumatonta GEO-tietokannan tietojoukkoa käytettiin havainnollistamaan ulkoisesti näiden 11 geenin ilmentymistä ccRCC:ssä, kuuden pyroptoosiin liittyvän säätelijän (AIM2, CASP5, NLRP3, NOD2, GZMA ja GZMB) osoitettiin ekspressoituvan voimakkaasti ccRCC:ssä (kuva 1). .1B). Yhdessä TCGA-tietosarjoista ladattujen potilaiden ennustetietojen kanssa toteutettiin yksimuuttuja Cox-regressio näiden kuuden säätelijän geenien seulomiseksi, ja neljä niistä (AIM2, CASP5, NOD2 ja GZMB) liittyi merkittävästi ccRCC-potilasennusteeseen (kuva 1C). . Näiden neljän säätelijän ilmentymisen ja ccRCC-alatyypin välisen suhteen tutkimiseksi edelleen konsensusklusterointianalyysi suoritettiin TCGA-KIRC-kohorttipotilailla. Konsensusklusterointianalyysi suoritettiin ccRCC-potilailla näiden neljän pyroptoosisäätelijän perusteella, ja tulos osoitti, että klusteroitumismuuttuja (k) =2 tunnistettiin korkeimmaksi klusterointistabiiliudeksi välillä k =1 - 9, mikä osoittaa, että että ccRCC-potilaat voidaan jakaa kahteen klusteriin, joilla on korkeimmat ryhmän sisäiset korrelaatiot ja alhaisimmat ryhmien väliset korrelaatiot (kuva 1D). Lisäksi klusterin 1 potilailla oli suotuisa kokonaiseloonjääminen (OS) verrattuna ryhmän 2 potilaisiin (kuva 1E).

Klusterien AIKA-analyysi pyroptoosisäätimien mukaan

Sen tutkimiseksi, mitkä väylät ovat rikastuneita klustereissa, suoritettiin GSEA-analyysi näiden kahteen klusteriin liittyvien merkittävien KEGG-reittien tunnistamiseksi. Tulokset osoittivat, että sytokiinireseptorin vuorovaikutus, T-solureseptorin signalointireitti, antigeenin prosessointi ja esittely, kemokiinin signalointireitti, luonnollinen tappajasoluvälitteinen sytotoksisuus, tietullin kaltainen reseptorin signalointireitti, B-solureseptorin signalointireitti ja JAK-STAT-signalointireitti polku liittyi merkitsevästi klusteriin 2 (lisätiedosto 1: kuva S1), mikä osoitti, että pyroptoosin säätelyaineita sisältävät klusterit liittyivät kasvaimen immuuni-mikroympäristöön. Siksi kahden klusterin välisen immuunitoiminnan eron tutkimiseksi laskettiin ESTIMATE-pisteet ja osoitettiin, että klusterilla 2 oli merkittävästi korkeammat ESTIMATE-, strooma- ja immuunipisteet verrattuna klusteriin 1 (kuva 2A), ja neljä pyroptoosin säätelijää olivat positiivisia. liittyvät näihin pisteisiin (kuvio 2B). Lisäksi kaksi klusteria paljasti merkittäviä eroja immuunisolujen infiltraatiossa (kuvio 2C). Ryhmässä 1 oli korkeampi infiltroituneiden B-solujen taso naiiveja, T-soluja CD4-muistia lepääviä, NK-soluja lepääviä, monosyyttejä, makrofageja M0, makrofageja M2, dendriittisoluja aktivoituneita ja syöttösoluja lepääviä, kun taas klusterissa 2 oli suurempi määrä liittyvät plasmasoluihin, T-soluihin CD8, T-soluihin muistiaktivoituihin, T-soluihin follikulaariseen auttajaan, T-solujen säätelyyn (Tregs), T-soluihin gamma-deltaan ja aktivoituihin NK-soluihin. Neljän säätelijän ja immuunisolutyypin välisen korrelaation analyysi osoitti, että neljällä säätelijällä oli positiivinen tai negatiivinen korrelaatio useimpien immuunisolutyyppien kanssa (kuvio 2D). Mielenkiintoista on, että lisätutkimus immuunigeenien erilaisesta ilmentymisestä kahden klusterin välillä paljasti, että immuunigeenien massa oli säädelty ylöspäin klusterissa 2, kun taas vain 5 geeniä oli alasäädelty (Lisätiedosto 2: Kuva S2A). 10 eniten ylös- ja alasäädeltyä geeniä valittiin analysoimaan korrelaatiota, ja tulos esitetään lisätiedostossa 2: Kuva S2B. Biologisten prosessien GO-analyysi osoitti, että immuunigeenien erilainen ilmentyminen klustereiden välillä rikastui aktivoimalla solun pinnan reseptorin signalointireittiä ja signaalin transduktiota.immuunivaste. Solukomponenttianalyysi osoitti, että eri tavalla ilmentyneitä immuunigeenejä oli runsaasti immunoglobuliinikompleksissa. Molekyylifunktioanalyysi osoitti, että differentiaalisesti ekspressoituneet immuunigeenit sisälsivät antigeenin sitoutumisen. KEGG-analyysi osoitti, että differentiaalisesti ilmentyneet immuunigeenit rikastuivat sytokiini-sytokiinireseptorivuorovaikutuksissa (Lisätiedosto 2: Kuva S2C, D). Nämä tulokset osoittivat, että klusteri 2 ja neljä säätelijää ovat osallisia kasvaimen immuuni-mikroympäristössä.

Pyroptoosia säätelevien aineiden yhdistäminen immuunitarkistuspisteen estäjiin ja kohdennetut lääkeherkkyydet Immuunitarkistuspisteen estäjähoidot (ICI) on todettu tehokkaaksi hoitovaihtoehdoksi useille kasvaintyypeille, kun taas vain murto-osa potilaista hyötyy tällaisesta hoidosta. Siksi ICI:iden erilaista ilmentymistä eri alatyypeissä tutkittiin edelleen. Kahdeksan kuuman immuunitarkistuspisteen geeniä (SIGLEC15, TIGIT, PD-L1, TIM3, PD-1, CTLA4, LAG3 ja PD-L2) liittyivät positiivisesti klusteriin 2 (kuvio 3A, B). Mielenkiintoista on, että neljä säätelijää liittyi tiiviisti useimpiin ICI:ihin, kun taas GZMB:n ja SIGLEC15:n välillä ei ollut merkittävää yhteyttä (kuva 3C). Lisäksi, kun otetaan huomioon kliinisen hoidon arvo kohdelääkkeiden herkkyydessä, sunitinibi ja temsirolimuusi osoittivat enemmän herkkyyttä klusterissa 1, kun taas aksitinibi oli läheistä sukua klusterille 2 (kuva 3D-F). Nämä tulokset osoittivat, että tämä luokittelu voi tarjota tietyn viitearvon erilaisten ccRCC-potilaiden kliiniselle lääkitykselle.

Klusterin kliinisen hyödyn stratifikaatioanalyysi Tämän luokituksen ja eri kliinisten ominaisuuksien välisen suhteen kliinisen arvon tutkimiseksi tarkemmin ccRCC-potilaat jaettiin eri ryhmiin potilaan iän, sukupuolen, asteen ja sairauden vaiheen mukaan. On syytä huomata, että korkeampi sairausvaihe liittyi enemmän klusterin 2 potilaisiin, samoin kuin patologiseen asteeseen (taulukko 1; kuva 4B). Pyroptoosin säätelijöiden ja kliinisten ominaisuuksien välisen suhteen lisäanalyysi osoitti, että neljän säätelijän ilmentymistaso nousi sairauden vaiheen ja patologisen asteen lisääntyessä, kun taas vain AIM2 ekspressoitui enemmän miehillä kuin naisilla. Neljän säätelijän ilmentymisen ja potilaan iän välillä ei ollut merkittävää eroa (kuvio 4A).

Neljän säätelijän ilmentymisen kokeellinen todentaminen Näiden neljän säätelijän ilmentymisen bioinformaattisen analyysin perusteella analysoimme mRNA:n ja proteiinin ilmentymistasoja. Verrattuna normaaleihin soluihin näiden neljän geenin ilmentymistasot nostettiin vaihtelevassa määrin kahdessa ccRCC-solulinjassa (kuvio 5A). Vastaavasti AIM2-, NOD2- ja GZMB-proteiinien ilmentymismallit HPA-tietokannasta paljastivat, että säätelijät olivat myös yli-ilmentyneitä ccRCC-kudoksessa normaaliin kudokseen verrattuna (kuvio 5B).

Neljä pyroptoosin säätelijän ilmentymismallia useissa syövissä

Näiden neljän pyroptoosisäätelijän ilmentymismallin lisätutkimus pansyövässä osoitti, että neljä pyroptoosisäätelijää ilmentyi eri tavalla useissa syövissä (kuva 6A). AIM2 ilmentyi eri tavalla useissa syövissä, mukaan lukien virtsarakon, rinta-, ruokatorven, munuaisten ja maksan syövissä. keuhkot, mahalaukku ja kohdun limakalvo sekä CASP5, NOD2 ja GZMB (kuva 6A). Lisäanalyysi havaitsi, että AIM2 oli positiivisimmin suhteessa HNSC:hen, kun taas CASP5 oli negatiivisesti suhteessa COAD:hen (kuvio 6B). Ja AIM2 ja GZMB olivat kaksi geeniä, joilla oli merkittävin positiivinen yhteys (korrelaatiokerroin =0,59, kuva 6C).

Syövän etenemisen aikana kasvainsolut voivat vähitellen menettää erilaistuneen fenotyypin ja saada esi- ja kantasolun kaltaisia ​​piirteitä[11]. Yleensä RNAss- ja DNAss-arvoja voidaan käyttää syövän kantasolujen kantasolujen arvioimiseen [12]. Siksi tutkittiin korrelaatiota pyroptoosin säätelijöiden ja RNAss:n ja DNAss:n avulla mitatun kasvaimen varren välillä. Neljä säätelijää korreloivat merkitsevästi positiivisesti tai negatiivisesti RNAs:n ja DNAss:n kanssa useimmissa yleissyövissä (kuvio 6D). Erityisesti KIRC:ssä AIM2 ja GZMB liittyivät positiivisesti tai negatiivisesti RNA:ihin, kun taas NOD2 liittyi negatiivisesti DNAss:hin (Lisätiedosto 3: Kuva S3).

Neljän pyroptoosisäätelijän yhdistäminen kasvaimen immuuni-mikroympäristöön pansyövässä

Pyroptoosigeenien tärkeän säätelyvaikutuksen perusteella eri immuunisolutyyppeihin neljää säätelijää tutkittiin edelleen yleissyöpämikroympäristössä. Mielenkiintoista on, että paitsi että AIM2 liittyi negatiivisesti DLBC:hen ja CASP5 liittyi negatiivisesti COAD- ja READ-arvoihin ESTIMATE-pisteissä ja stroomapisteissä, toiset liittyivät positiivisesti syöpiin immuunipisteissä, stroomapisteissä ja ESTI-MATE-pisteissä (kuva 7A). ). Neljän pyroptoosisäätelijän ilmentymisen tutkimiseksi eri immuunialatyypeissä pansyövässä immuuni-infiltraatit jaettiin kuuteen tyyppiin analysointia varten, jotka vastaavat kasvainta edistävistä kasvainta suppressoiviin, mukaan lukien haavan paraneminen, hallitseva IFN-y, tulehdus, lymfosyytti heikentynyt, immunologisesti hiljainen ja TGF-dominoiva. Mielenkiintoista on, että neljä pyroptoosisäätelijää olivat kaikki merkitsevästi sukua immuunialatyypeille, ja neljä pyroptoosin säätelijää ilmenivät eniten IFN-y-dominantissa, jota seurasi TGF-dominantti (kuvio 7B). KIRC:ssä neljän pyroptoosisäätelijän ilmentyminen oli kuitenkin korkein C2:ssa ja sama kuin yleissyöpäanalyysissä. AIM2, jolla oli toiseksi korkein ekspressio immuunialatyypeissä, oli sukua Cl:lle, kun taas NOD2, CASP5 ja GZMB olivat sukua C6:lle (kuvio 2E).

Keskustelu

Kirurginen resektio on ensimmäinen munuaissyövän hoito kliinisessä käytännössämme. Munuaissyövän etäpesäkkeitä on kuitenkin edelleen vaikea poistaa. Metastaattinen munuaissyöpä on resistentti sädehoidolle ja systeemiselle hoidolle, mukaan lukien hormonihoito ja kemoterapia [13]. Kliininen tutkimus nivolumabilla, anti-PD-L1-immuunitarkistuspisteen estäjällä, metastaattisen ccRCC:n (CheckMate-025) hoitoon, on osoittanut, että nivolumabilla on merkittävästi parempi käyttöjärjestelmä, riskisuhde, ORR ja kokonaisvastesuhde. 14]. Nämä tutkimukset osoittavat, että immunoterapian soveltamisella ccRCC:n hoidossa on suuret näkymät. ccRCC TIME:n heterogeenisyyden syvällinen analyysi voi auttaa tarjoamaan tarkan ja yksilöllisen immunoterapian hallinnan parantamaan hoidon tehoa ja potilaan ennusteen eloonjäämisen laatua. Täällä ccRCC-potilaat erotettiin kahteen itsenäiseen molekyylialatyyppiin, joilla oli erilaiset kliiniset ominaisuudet, immuunigeenin ilmentyminen ja TIME konsensusklusteroinnin avulla neljälle pääpyroptoosin säätelijälle. Tämän tutkimuksen mukaan klusterin 2 ennuste oli huonompi kuin klusterin 1, mutta klusteri 2 oli herkempi immunoterapialle.

Solujen sisäisistä kuolemanmekanismeista pyroptoosi on saanut yhä enemmän huomiota. Pyroptoosi on äskettäin tunnistettu ohjelmoidun tulehduksellisen solukuoleman tyyppi, joka aktivoituu klassisten kaspaasi-1 tulehdusreaktioiden tai ei-klassisten kaspaasien-4, kaspaasin-5 ja kaspaasin{{4} välittämien reittien kautta. } [15]. Äskettäin uusia todisteita on raportoitu pyroptoosin tärkeästä roolista ihmisen pahanlaatuisten kasvainten kasvainten muodostumisessa [16,17]. Pyroptoosi estää kasvainten kasvua paksusuolensyövän, maksasyövän ja ihosyövän kohdalla, mutta sillä on kaksisuuntainen vaikutus rintasyöpään [18-20]. ccRCC:ssä ei tiedetä, kuinka pyroptoosiin liittyvät geenit ovat vuorovaikutuksessa ja liittyvätkö ne potilaan eloonjäämisaikaan. Useimpien pyroptoosia säätelevien geenien ilmentyminen korreloi positiivisesti ja sillä on tärkeä prognostinen rooli ccRCC:ssä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että pyroptoosin säätelijöillä voi olla keskeinen rooli tuumorigeneesin ja ccRCC:n kehityksen säätelyssä. Tässä tutkimuksessa tunnistettiin neljä pyroptoosin säätelijää, jotka ilmentyvät voimakkaasti munuaissyövässä ja aiheuttavat huonon ennusteen. AIM2 on sytosolinen synnynnäinen immuunireseptori, joka tunnistaa kaksijuosteisen DNA:n (dsDNA), joka vapautuu solujen häiriöiden ja patogeenisen hyökkäyksen aikana. Aktivoitu AIM2 aktivoi klassisen pyroptoosin reitin kaspaasin kautta-1 [21]. AIM2:lla voi olla ainutlaatuinen rooli eri syöpätyypeissä [22-25], ja tämä tutkimus osoitti, että AIM2:lla on syöpää edistävä rooli ccRCC:ssä. Kaspaasi-5(CASP5), samanlainen kuin kaspaasi-4 ja kaspaasi-1l, on kaspaasi-1-riippumattoman pyroptoosin toimeenpaneva proteiini [26]. Sytotoksiset lymfosyytit käyttävät GZMB:tä molekyyliaseena suojautuakseen viruksen infektoituneita ja pahanlaatuisesti transformoituneita isäntäsoluja vastaan[27]. GZMB:n alhainen ilmentyminen liittyy paksusuolensyövän varhaiseen metastaasiin, mikä viittaa verisuonten ja hermojen infiltraatioon [28]. Mielenkiintoista on, että analyysimme havaitsi, että GZMB on positiivisesti korreloiva geeni munuaissyövässä. NOD2 on muodontunnistusreseptori, joka voi säädellä isännän luontaista immuunivastetta ja ehkäistä tulehdusta, steatoosia ja liikalihavuutta [29]. LPS:n indusoima solunulkoinen histoni H3 voi aiheuttaa pyroptoosia sepsiksen aikana NOD2- ja VSIG4/NLRP3-reittien kautta [30]. On edelleen tuntematonta, kuinka nämä geenit ovat vuorovaikutuksessa toistensa kanssa solupyroptoosin aikana ccRCC:ssä.

Kliinisessä käytännössämme verisuonten endoteelin kasvutekijäreseptorin tyrosiinikinaasi-inhibiittoreista (VEGFR-TKI:t) on tullut mRCC:n hoidon standardi [31]. Sunitinibia, joka on laajakirjoinen reseptorityrosiinikinaasien estäjä, on käytetty laajalti hoidon standardina edistyneen ccRCC:n ensilinjan hoidossa [32]. Kaikki RCC-potilaat eivät kuitenkaan ole herkkiä sunitinibihoidolle, ja useimmat potilaat kehittävät resistenssin sunitinibille muutaman kuukauden hoidon jälkeen. Siksi avain sunitinibin valinnassa hoitoon on valita potilaat, jotka ovat herkkiä sunitinibille. Tämä tutkimus osoitti, että klusteri 1 on herkempi sunitinibille, kun taas klusteri 2 on herkempi aksitinibille.

Pyroptoosisäätelyaineiden ilmentymisen ymmärtäminen ccRCC:ssä ennen hoitoa voi auttaa suunnittelemaan entistä optimoitumpia kohdennettuja hoitovaihtoehtoja potilaiden hyödyksi. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että pyroptoosin tehokas proinflammatorinen vaikutus liittyy kasvaimen immuuni-mikroympäristön säätelyyn [33]. Pyroptoosin mahdollinen rooli ccRCC:n immuuni-mikroympäristössä on kuitenkin edelleen vaikeaselkoinen. Pyroptoosin säätelijöiden ilmentymisominaisuuksien perusteella tämä tutkimus osoitti, että eri klustereissa olevilla potilailla on erilainen korrelaatio erilaisten immuuni-infiltraatioiden kanssa. Klusterissa 1 havaittiin korkeampia tunkeutuneita B-soluja, jotka eivät olleet muistissa CD4-soluja, NK-soluja lepää, monosyyttejä, makrofageja M0 ja makrofageja M2. Toisaalta klusteri 2 oli korkeampi suhteessa CD8 plus -soluihin. T-solut, Tregit ja T-follikulaariset auttajasolut. Tregit voivat erittää erilaisia ​​immunosuppressiivisia sytokiinejä, mikä johtaa kasvainsolujen immuunipakkoon. Tutkimukset ovat osoittaneet, että Tregit estävät tehokkaasti efektori-T-solujen proliferaatiota ja korkea CD8＋ T-soluinfiltraatiotaso on epäsuotuisa ennustetekijä ccRCC:lle [34,35]. Klusterin 2 huono ennuste ja näiden kahden johtopäätöksen johtopäätökset ovat keskenään johdonmukaisia. Ryhmä 2 korreloi positiivisesti kahdeksan kuuman ICI:n kanssa (SIGLEC15, TIGIT, PD-L1, T IM3, PD-1, CTLA4, L AG3 ja PD-L2). Näiden löydösten perusteella klusterin 2 huonot eloonjäämistulokset voivat johtua kasvaintenvastaisen immuniteetin heikkenemisestä, ja klusteri 2 voi olla hyödyllisempi immuunihoidossa. GSEA:n tulokset osoittavat, että klusteri 2 liittyy useisiin immuunisäätelysignalointireitteihin. Tärkeää on, että JAK-STAT-signalointireitti liittyy ccRCC:n karsinogeneesiin ja immuuni-infiltraatioon. Näin ollen arvelimme, että pyroptoosi voi säädellä kasvaimen immuuni-mikroympäristön koostumusta. Tutkimuksemme ehdotti, että ccRCC, jolla on korkea näiden 4 geenin ekspressio, voi olla herkempi immunoterapialle.

Neljän säätelijän ilmentymistaso nousi sairauden vaiheen ja patologisen asteen noustessa, eikä neljän säätelijän ilmentymisen ja potilaan iän välillä ollut merkittävää eroa, mikä oli yhdenmukainen klusterin 2 huonomman ennusteen kanssa.

Koska pyroptoosi on laajalti mukana erilaisissa biologisissa prosesseissa, tutkimme, onko näillä neljällä klusterin 2 pyroptoosisäätelijällä tärkeä rooli myös muissa syöpätyypeissä. Myöhemmin suoritettiin yleissyöpäanalyysi, ja tulokset osoittivat, että nämä neljä pyroptoosin säätelijää liittyivät läheisesti stroomapisteisiin, immuunipisteisiin ja ESTIMATE-pisteisiin useissa syöpätyypeissä. Nämä tulokset osoittivat, että nämä neljä pyroptoosin säätelijää ovat mahdollisia kohteita useille syövän immunoterapioille eivätkä rajoitu ccRCC:hen.

Jatkossa tarvitaan lisää luotettavaa todentamisanalyysiä suuremmassa ryhmässä. Lisäksi tarvitaan lisää in vitro- ja in vivo -kokeita pyroptoosin säätelyaineiden ja kasvaimen immuuni-mikroympäristön välisen säätelymekanismin selvittämiseksi.

Johtopäätökset

Yhteenvetona voidaan todeta, että tässä tutkimuksessa analysoitiin systemaattisesti pyroptoosin säätelijöiden ilmentymisprofiilia ccRCC:ssä ja sen korrelaatiota immuunitarkistuspisteiden kanssa ja roolia kasvaimen immuuni-mikroympäristössä. Pyroptoosin säätelijöiden ilmentyminen liittyy merkittävästi immuunitarkistuspisteisiin, kuten PD-L1 ja CTLA4. Myös kaksi riippumatonta alatyyppiä perustettiin pyroptoosisäätimien johdonmukaisen klusteroinnin avulla. Tuumorien heterogeenisyyttä ja eroja immuunitarkistuspisteen ilmentymisessä ja tuumorin immuuni-mikroympäristössä havaittiin näiden kahden alatyypin välillä, mikä helpottaa riskien kerrostumista ja ccRCC-potilaiden tarkkaa hoitoa. Yksivaiheinen pan-syöpäanalyysi osoitti, että nämä pyroptoosin säätelijät liittyvät läheisesti stroomapisteisiin, immuunipisteisiin ja ESTIMATE-pisteisiin monissa syöpätyypeissä. Tärkeää on, että tulevat kliiniset tutkimukset ja perustutkimukset auttavat määrittämään tavoitteita syövän immunoterapian tehokkuuden parantamiseksi.