Vertaileva tutkimus Cistanche Tubulosan (Guanhua Roucongrong) ja sen jalostettujen tuotteiden kemiallisista aineosista ja sisällöstä

Abstrakti

Tavoite:Tutkia jalostettujen tuotteiden kemiallisten ainesosien vaihtelua (muutoskuvioita)Cistanche tubulosa(Guanhua Roucongrong).
Menetelmät:Valittiin viisi keittopalatyyppiä, mukaan lukien raakaviipaleet, viinihöyrytetyt viipaleet, höyrytetyt viipaleet, sekoitettavat mustien papujen kanssa käsitellyt viipaleet ja mustapapumehulla käsitellyt viipaleet. HPLC-sormenjälkimenetelmä luotiin ja yhdistettiin samankaltaisuuden arviointiin, klusterianalyysiin (CA) ja pääkomponenttianalyysiin (PCA) raakatuotteen ja jalostettujen tuotteiden välisten erojen seulomiseksi ja vahvistamiseksi. Kemometrisiä menetelmiä ja HPLC:tä käytettiin määrittämään ja vertailemaan eroja fenyylietanoidiglykosidien, polysakkaridien, flavonoidien kokonaismäärän ja neljän fenyylietanoidiglykosidin kokonaispitoisuuksissa raaka- ja prosessoitujen näytteiden joukossa.
Tulokset:HPLC-sormenjäljetCistanche tubulosa and its processed products were established. With Mark peak matching, 9 common peaks were assigned for raw slices, whereas 11 common peaks were assigned for the other four processed products. Peaks No. 2 and No. 7 were differential chromatographic peaks. By comparison with reference standards, four chromatographic peaks were identified as echinacoside, cistanoside A, acteoside, and isoacteoside. Fingerprints of the processed products showed similar profiles with the same number of common peaks; similarity values were all >0.9. Käyttämällä ekinakosidia vertailupiikkinä, eri jalostettujen tuotteiden yhteisten piikkien suhteellisten retentioaikojen RSD vaihteli välillä 0,11–0,82 %, kun taas suhteellisten piikkien alueiden RSD vaihteli välillä 15,46–76,07%. Kun luokkien väliseksi etäisyydeksi asetettiin 10, CA luokitteli raakaviipaleet ja jalostetut tuotteet kolmeen luokkaan. PCA osoitti koostumuserot raaka- ja prosessoitujen näytteiden välillä: 11 huippumuuttujaa pienennettiin kolmeen pääkomponenttiin; eri pääkomponentit korreloivat eri kromatografisten piikkien kanssa. Komponenttimatriisin ja lineaarisen painotuksen perusteella kattavat pisteet osoittivat, että mustapapumehulla käsitellyt viipaleet ja keltaviinillä höyrytetyt ja vesihöyrytetyt viipaleet sijoittuivat korkeammalle. Raaka- ja prosessoitujen näytteiden pitoisuudet olivat seuraavat: fenyylietanoidiglykosidit 3,80–7,07 %, polysakkaridit yhteensä 5,85–6,70 %, flavonoidit yhteensä 14,16–24,26 %; ekinakosidi 4,11–5,99 %, akteosidi 0,67–1,34 %, cistanosidi A 0,06–0,36 % ja isoakteosidi 0,25–1,66 %. Jalostettujen tuotteiden välillä oli huomattavia eroja.
Johtopäätös:Vakiintuneella HPLC-sormenjälkimenetelmällä on vahva spesifisyys, ja se erottaa tehokkaasti raakaviipaleet jalostetuista tuotteistaCistanche tubulosa, ja se soveltuu ekinakosidin, akteosidin, cistanosidi A:n ja isoakteosidin kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen analyysiin raakalääkkeessä ja jalostetuissa tuotteissa. Vertaileva profilointi ja sisältömuutokset eri näytteiden välillä voivat tarjota tieteellisen perustan tunnistamiselle ja laadunvalvonnalleCistanche tubulosaja sen erilaiset jalostetut tuotteet.

Avainsanat: Cistanche tubulosa; käsittely; kemialliset ainesosat; sormenjälki; korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC)

 

1 Johdanto

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight (Guanhua Roucongrong) on ​​Orobanchaceae-lajin monivuotinen yrtti, ja se on virallisesti listattu Cistanches Herban lähde Kiinan kansantasavallan farmakopeassa (jäljempänä "Kiinan farmakopea"). Lääkeosa on kuivattu, mehevä varsi, jossa on hilseileviä lehtiä. Se on luonteeltaan lämmin, maultaan makea ja suolainen, ja se kulkeutuu munuaisten ja paksusuolen meridiaaneihin ja sen tehtävänä on vahvistaa munuaisten yangia, edistää esanssia ja verta sekä kostuttaa suolistoa ummetuksen lievittämiseksi [1]. Nykyaikaiset farmakologiset tutkimukset ovat vahvistaneet useita toimintoja, kuten ikääntymistä estäviä, immuunipuolustusta vahvistavia, munuaisia ​​vahvistavia ja afrodisiaakteja, laksatiivisia vaikutuksia ja verenpainetta alentavaa vaikutusta.

Cistanche tubulosaon runsaasti fenyylietanoidiglykosideja, iridoideja ja niiden glykosideja, lignaaneja, oligosakkaridiestereitä, polyoleja, polysakkarideja, flavonoideja ja muita ainesosia [2]. Näistä fenyylietanoidiglykosidit ovat tärkeimmät aktiiviset komponentit ja yleisimmät yhdisteet; ne ovat myös farmakopean sisällön määrittämisen markkerikomponentteja, ja niillä on erilaisia ​​biologisia aktiivisuuksia, kuten antioksidanttisia vaikutuksia, aineenvaihdunnan edistäminen, oppimisen ja muistin parantaminen sekä seksuaalisen toiminnan tehostaminen [3].

Cistanche tubulosasuosii suola-alkalimaata ja Gobin autiomaa-alueita, loistaa sen juurissaTamarixspp., ja sitä levitetään pääasiassa Sisä-Mongoliassa, Xinjiangissa ja Gansussa Kiinassa [4]. Villiä ja viljeltyjä geoauthentisia alueita ovat Minfeng County, Yutian, Pishan ja Moyu Hotanin prefektuurissa Xinjiangissa. Sen jalostus on pääasiassa kehitetty viipaloiduiksi keittopaloiksi, raa'iksi yrttimateriaaleiksi, uutteiksi, terveystuotteiksi ja terveysvaikutteisiksi elintarvikkeiksi; näiden joukossa kaupalliset keittopalat ovat edelleen valtavirtaa. Markkinoilla erilaisia ​​jalostettuja tuotteita, kuten raakoja viipaleita, viinillä käsiteltyjä viipaleita, korkean lämpötilan entsyymeillä inaktivoituja viipaleita ja vesihöyrytettyjä viipaleita, sekoitetaan kuitenkin usein ja niitä on vaikea erottaa.

Cistanches Herban käsittely on kehittynyt ajan myötä muinaisista tietueista, kutenTaiping Shenghui Fang, Zhenglei Bencao, jaPuji Fang[5–7] (esim. pesu viinillä, paistaminen viinin kanssa, höyrytys/paistaminen viinin kanssa, liotus/kuivapaistaminen viinin kanssa, keittäminen vedessä, kolminkertainen höyrytys ja voissa paistaminen) nykyaikaisiin menetelmiin, kuten viinin maserointi (höyrytys), yksihöyrytys, "neljähöyrytys ja neljän pavun käsittely" [8]. Erilaiset käsittelymenetelmät voivat vaikuttaa aktiivisten aineosien pitoisuuteen, turvallisuuteen ja biologiseen aktiivisuuteen. Cai Hong et ai. [9] havaitsivat, että tuoreen materiaalin entsyymi-inaktivointi 70-asteisella kuumalla vedellä 6 minuutin ajan johti siihen, että ekinakosidi- ja akteosidipitoisuudet olivat 7,3-kertaiset ja 6,5-kertaiset suorassa auringonvalossa kuivaamiseen verrattuna. Tie Xiaoyan et ai. [10] raportoi, että höyrykäsittely paransi huomattavasti keittopalojen laatua tuoreisiin materiaaleihin verrattuna. Chen Weijun et ai. [11] havaitsi, että betaiinipitoisuus laski viinin, suolan ja höyryn käsittelyn jälkeen verrattuna tuoreisiin tuotteisiin. Zhang Chao et ai. [12] osoitti, että viinin höyrytyksen aikana pidennetyllä höyrytysajalla ekinakosidi, akteosidi, cistanosidi A ja 2'-asetyylilakteosidi vähenivät vähitellen, kun taas isoakteosidi lisääntyi merkittävästi.

Kiinan farmakopean nykyinen vuoden 2025 painos asettaa rajat vain ekinakosidille ja akteosidille raaka- ja viinihöyrytetyissä siivuissa, mutta ei määritä merkkikomponentteja muille jalostetuille tuotteille, ja siitä puuttuu tehokkaita sisällön valvontamenetelmiä. Siksi ominaisten ainesosien analysointi ja vertailu sekä koostumusmuutosmallien tutkiminen ovat erityisen tärkeitä raaka-aineiden ja jalostettujen tuotteiden laadullisen tunnistamisen ja määrällisen valvonnan kannalta.

Perinteisen kiinalaisen lääketieteen (TCM) sormenjäljet ​​ovat kemiallisten ainesosien kokonaisvaltainen esitys. Eheyden, spesifisyyden ja runsaan tiedon ansiosta sitä käytetään laajalti raakalääkkeiden ja -valmisteiden laadunvalvonta-arvioinnissa, kansainvälisten standardien mukauttamisessa, aitouden tunnistamisessa, valmistusprosessin seurannassa ja farmakodynaamisten aineiden tutkimuksessa [13]. HPLC-sormenjälkien perusteella tässä tutkimuksessa valittiin ekinakosidi, akteosidi, sistanosidi A ja isoakteosidi laatumarkkereiksi ja käytettiin samankaltaisuusanalyysiä, CA:ta ja PCA:ta yhdistettynä sisällön määritykseen kemiallisten ainesosien ja sisällön muutosmallien vertaamiseksi eri jalostettujen tuotteiden välillä, mikä tarjoaa tieteellisen perustan tunnistamiselle ja laadunvalvonnalle.

 

2 Välineet ja materiaalit

2.1 Instrumentit

U3000 HPLC-järjestelmä (Thermo Fisher); UPL-111-20R ultrapuhdas vesijärjestelmä (Sichuan Youpu); AB 265-S elektroninen vaaka (Mettler Toledo); KQ-5200DA ultraääniimuri/puhdistin (Kunshan Ultrasonic); GZX-9240MBE sähköinen kuivausuuni (Shanghai Boxun); UV-2600 UV-Vis-spektrofotometri (Shimadzu, Kiina).

2.2 Lääkkeet ja reagenssit

TuoreCistanche tubulosa(erän nroCistanche tubulosa(Schenk) Wight (Orobanchaceae).

Vertailuaineet: vedetön D-glukoosi (eränumero . 361810, 100,00%, Shenzhen Jinhui Biotechnology Co., Ltd.); ekinakosidi (eränro. 111670-201907), rutiini (eränro. 100080-202012), akteosidi (eränro. 11530-202315), sistanosidi A (eränro. 313512) ja isoakteosidi (eränro. 313413), joiden HPLC-määrityksen puhtaus on suurempi tai yhtä suuri kuin 91,8 %, 2 %, 9,6 % ja 92,0 %. 98,09 %, National Institutes for Food and Drug Control (Kiina).(Huomaa: yksi puhtausrivi on katkaistu toimitetussa tekstissä; yllä oleva seuraa luettavaa osaa.)

Keltainen riisiviini (puolikuiva tyyppi, alkoholi 16 %; Zhejiang Guyuelongshan Shaoxing Wine Co., Ltd.); metanoli ja asetonitriili (HPLC-laatu, Fisher Scientific, USA). Muut reagenssit olivat analyysilaatua.

3 Menetelmät ja tulokset

3.1 Raakaviipaleiden ja jalostettujen tuotteiden valmistusCistanche tubulosa

Seuraavia menetelmiä käytettiin raakaviipaleiden ja prosessoitujen tuotteiden valmistukseen, kukin 6 erässä.

Raakaviipaleet:TuoreCistancheleikattiin 3 mm:n viipaleiksi ja kuivattiin 60 asteessa.

Höyrytysmenetelmä:Kirjallisuuden [14] mukaan 20 g puhtaita viipaleita sekoitettiin 6 ml:aan tislattua vettä suljetussa astiassa, kostutettiin 4 tuntia [12], höyrytettiin veden päällä 12 tuntia, jäähdytettiin ja kuivattiin 60 asteessa.

Viinin jalostusmenetelmä:Valmistettu viinin haudutus- tai höyrytysmenetelmällä (yleinen sääntö 0213, Kiinan farmakopea).

Sekoituskäsittely mustien papujen kanssa:Valmistettu mukaanKiinalainen Materia Medica(Zhonghua Bencao) Cistanches Herban johdolla; mustia papuja lisättiin 1 kg per 10 kgCistanchemateriaalia.

Mustapapumehun käsittely:Viipaleet sekoitettiin mustapapumehun kanssa ja käsiteltiin sitten yllä olevalla höyrytysmenetelmällä; mustapavun annostus oli sama kuin yllä.

3.2 Tarkastuskohteiden määrittäminen

Kosteus määritettiin uunikuivauksella (yleinen sääntö 0832, Kiinan farmakopea); kokonaistuhka yleisen säännön 2302 mukaisesti; alkoholiliukoiset uutteet kylmämaserointimenetelmällä yleisen säännön 2201 mukaisesti. Tulokset on esitetty taulukossa 1.

 

3.3 HPLC-sormenjälkien vertaileva analyysiCistanche tubulosaja sen jalostetut tuotteet

3.3.1 Kromatografiset olosuhteet

Waters Xterra RP18 -kolonni (250 mm × 4,6 mm, 5 um). Liikkuva faasi: asetonitriili (A) – 0,1 % muurahaishappoa (B), gradienttieluointi: 0–12 min, 14 % A → 17 % A; 12–30 min, 17 % A → 19 % A; 30–35 min, 19 % A → 14 % A; 35–50 min, 14 % A. Virtausnopeus: 1,0 ml·min⁻¹. Kolonnin lämpötila: 30 astetta. Havaitsemisaallonpituus: 330 nm. Injektiotilavuus: 10 µL.

3.3.2 Ratkaisujen valmistelu

Viiteratkaisut:Ekinakosidi, akteosidi, cistanosidi A ja isoakteosidivertailuaineet punnittiin tarkasti ja liuotettiin 50-prosenttiseen metanoliin 10 ml:n mittapulloissa, jolloin saatiin liuokset 1,1301, 0,2294, 0,2255 ja 0,2109 mg¹, ml-; suodatetaan lopullisten liuosten saamiseksi.

Esimerkkiratkaisut:0,5 g 80 meshin jauhetta raaka- ja käsitellyistä näytteistä punnittiin tarkasti, uutettiin 50-prosenttisella metanolilla 25 ml:n mittapullossa, ultraäänikäsiteltiin (200 W, 40 kHz) 40 minuuttia, jäähdytettiin, sekoitettiin, annettiin seistä ja suodatettiin 0,22 um:n kalvon läpi; suodosta käytettiin.

3.3.3 Menetelmän validointi (sormenjälki)

3.3.3.1 Tarkkuus

Sama näyteliuos injektoitiin kuusi kertaa peräkkäin. Käyttämällä ekinakosidia vertailuhuippuna, yhteisten piikkien suhteellisten retentioaikojen RSD oli<0.48% and the RSD of relative peak areas was <2.86%, indicating good instrumental precision.

3.3.3.2 Toistettavuus

Kuusi rinnakkaista näyteliuosta valmistettiin samasta erästä (raaka viipale S1). Käyttämällä ekinakosidia vertailuhuippuna suhteellisten retentioaikojen RSD oli<0.07% and the RSD of relative peak areas was <2.77%, indicating good method repeatability.

3.3.3.3 Vakaus

Sama näyteliuos analysoitiin 0, 3, 6, 9, 12 ja 24 tunnin kohdalla. Käyttämällä ekinakosidia vertailuhuippuna suhteellisten retentioaikojen RSD oli<0.11% and the RSD of relative peak areas was <2.33%, indicating stability within 24 h.

3.3.4 Sormenjälkien määrittäminen

Kolmekymmentä erääCistanche tubulosaja jalostetut tuotteet analysoitiin. Käytettiin "Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine" (vuoden 2012 painos). Raaka viipale S1 ja keltaviinillä höyrytetty viipale J1 käytettiin vertailusormenjälkinä; Keskimääräistä menetelmää ja 0,1 minuutin aikaikkunan leveyttä sovellettiin monipistekorjaukseen ja Mark Peak -sovitukseen sormenjälkien luomiseksi (kuvat 1–2), ja saatiin päällekkäiset kromatogrammit, joissa oli sekoitettuja vertailustandardeja (kuva 3).

Tulokset osoittivat, että neljän jalostetun tuotteen sormenjälkiprofiilit olivat samanlaiset kuin raakaviipaleilla. Raakaviipaleilla oli 9 yhteistä huippua, kun taas viinihöyrytetyillä, höyrytetyillä, mustilla papuilla käsitellyillä siivuilla ja mustapapumehulla käsitellyillä viipaleilla oli 11 yhteistä huippua. Molemmilla oli yhdeksän yhteistä huippua. Huiput No. 2 ja No. 7 olivat tyypillisiä huippuja, jotka erottivat raakaviipaleet jalostetuista tuotteista. Neljän käsitellyn tuotteen sormenjälkiprofiilit olivat samanlaisia, eivätkä ne selvästi heijastaneet eroja niiden välillä.

3.3.5 Samankaltaisuusanalyysi

Using J1 as the reference fingerprint, similarity analysis was performed for different processed products (Table 2). Similarities were all >0,9, mikä osoittaa samanlaisia ​​sormenjälkien ominaisuuksia eri jalostetuissa tuotteissa.

3.3.6 Yhteisten huippujen tunnistaminen

Vertailemalla retentioaikoja sekoitettuihin vertailustandardeihin ja raakaviipalekromatogrammiin, tunnistettiin neljä kromatografista piikkiä: Piikki 4, ekinakosidi; Piikki 9, cistanosidi A; Piikki 10, akteosidi; Piikki 11, isoakteosidi (kuva 2). Kun huippu 4 (ekinakosidi) oli vertailupiikki, yhteisten piikkien suhteellisten retentioaikojen RSD-arvot neljän käsitellyn tuotteen eri erissä vaihtelivat välillä 0,11–0,82 %, ja suhteellisten piikkien pinta-alojen RSD-arvot vaihtelivat välillä 15,46–76,07.

3.3.7 Klusterianalyysi

SPSS 27.0:aa käytettiin raakaviipaleiden ja prosessoitujen tuotteiden klusterianalyysiin. Käytettiin ryhmien välistä sidosta ja käytettiin neliöityä euklidista etäisyyttä (kuva 4). Kun luokkien välinen etäisyys oli<5, water-steamed slices and wine-steamed slices clustered together. When the inter-class distance was 10, raw slices and the four processed products were classified into three categories: raw materials (S1–S6) as one category; black-bean-juice-processed slices (H1–H6) as one category; and wine-steamed slices (J1–J6) together with water-steamed slices (Q1–Q6) and stir-processed-with-black-beans slices (C1–C6) as one category. When the inter-class distance was between 15 and 25, black-bean-juice-processed slices formed a separate cluster from the other samples.

3.3.8 Pääkomponenttien analyysi

Piikkialueiden standardoinnin jälkeen PCA suoritettiin käyttämällä SPSS 27.0:aa. KMO-arvo oli 0,679 ja Bartlettin testin merkitsevyys oli<0.001, indicating suitability for PCA. With eigenvalues >Kuviossa 1 erotettiin kolme pääkomponenttia ominaisarvoilla 6,815, 1,987 ja 1,105. Varianssimaksuprosentit olivat 61,954 %, 18,063 % ja 10,047 %, ja kumulatiivinen varianssimaksuprosentti oli 90,064 % (taulukko 3). Tämä osoittaa, että ensimmäinen pääkomponentti on kokonaispistemäärän tärkein indikaattori.

Komponenttimatriisi osoitti, että ensimmäisessä pääkomponentissa huippujen pinta-alamuuttujien absoluuttiset kertoimet huippuille 2–9 ja huippuille 11 olivat suhteellisen suuret, mikä viittaa vahvaan vaikutukseen F1:een. Toinen pääkomponentti korreloi huippujen 1 ja 10 tietojen kanssa ja kolmas pääkomponentti korreloi huippujen 1 kanssa. Komponenttimatriisi on esitetty taulukossa 4; tasoituskäyrä ja kuormituskäyrä on esitetty kuvissa 5 ja 6. Käyttämällä kolmen pääkomponentin pisteitä ja niiden varianssivaikutussuhteita lineaarisen painotuksen painoina laskettiin kattavat pisteet (taulukko 5), jotka osoittavat, että mustapapumehulla käsitellyt viipaleet, vesihöyrytetyt viipaleet ja viinihöyrytetyt korkeammat suolaiset viipaleet.

 

3.4 Useiden aineosien HPLC-määritysCistanche tubulosaja sen jalostetut tuotteet

3.4.1 Kromatografiset olosuhteet ja spesifisyys

Kromatografiset olosuhteet olivat samat kuin ne, joita käytettiin sormenjälkien ottamiseen. Kukin näyteliuokset, vertailuliuokset ja negatiiviset nollaliuokset (keltainen riisiviini, puhdistettu vesi, mustapapumehu) injektoitiin (10 ui). Retentioaikoja verrattiin. Negatiiviset nollaliuokset eivät osoittaneet häiriötä ekinakosidin, cistanosidi A:n, akteosidin ja isoakteosidin kanssa.[teksti puuttuu lähteestä]

3.4.2 Lineaarisuus

Ekinakosidin, akteosidin, cistanosidi A:n ja isoakteosidin vertailuliuokset pitoisuuksilla 1,1301, 0,2294, 0,2255 ja 0,2109 mg·mL-¹ pipetoitiin tarkasti 1, 2, 4, 8, 1 6 µl ja injektoitiin 10. Lineaarinen regressio suoritettiin huippupinta-alalla XXX vs. injektoitu pitoisuus YYY (mg·mL-1). Lineaariset yhtälöt ja alueet on esitetty taulukossa 6.

3.4.3 Tarkkuus

Sama näyteliuos injektoitiin kuusi kertaa peräkkäin. Sisällön RSD-arvot neljälle analyytille (ekinakosidi, cistanosidi A, akteosidi, isoakteosidi) olivat 0,23 %, 2,71 %, 0,53 % ja 2,08 % (taulukko 7).<3%, indicating good instrumental precision.

3.4.4 Toistettavuus

Kuusi rinnakkaista näyteliuosta valmistettiin samasta erästä (raaka viipale S1). Sisällön RSD-arvot neljälle analyytille olivat 0,22 %, 2,46 %, 0,50 % ja 2,46 % (taulukko 7), kaikki<3%, indicating good repeatability.

3.4.5 Vakaus (päivän sisäinen)

Sama näyteliuos analysoitiin 0, 3, 6, 9, 12 ja 24 tunnin kohdalla. Sisältöjen RSD-arvot neljälle analyytille olivat 0,80 %, 1,62 %, 1,72 % ja 1,49 % (taulukko 7), kaikki<2.0%, indicating stability within 24 h.

3.4.6 Vakaus (päivien välinen)

Sama näyteliuos analysoitiin viiden peräkkäisen päivän ajan. Sisällön RSD-arvot neljälle analyytille viiden päivän aikana olivat 2,80 %, 2,53 %, 3,53 % ja 2,88 % (taulukko 7), mikä osoittaa stabiilisuuden viiden päivän sisällä.

3.4.7 Palautus

Sopiva määräCistanche tubulosanäyte punnittiin ja ekinakosidin, akteosidin, cistanosidi A:n ja isoakteosidin vertailustandardeihin lisättiin 1:1-suhde. Kuusi rinnakkaista näyteliuosta valmistettiin ja analysoitiin (10 ui injektio). Keskimääräiset palautukset olivat 99,29 %, 98,75 %, 99,45 % ja 96,13 % (n=6) RSD-arvojen ollessa 2,51 %, 0,38 %, 1,71 % ja 0,49 %.

3.4.8 Määritystulokset

Kutakin näytettä kohti punnittiin tarkasti 0,5 g jauhetta; 10 ui injektoitiin neljän ainesosan prosenttiosuuden määrittämiseksi ja laskemiseksi. Tulokset on esitetty kuvissa 7–10.

 

3.5 Fenyylietanoli-glykosidien, polysakkaridien ja flavonoidien kokonaismäärän määritys

3.5.1 Fenyylietanoliglykosidien kokonaismäärän määritys

3.5.1.1 Vertailuliuoksen valmistaminen

Sopiva määrä ekinakosidivertailuainetta punnittiin tarkasti ja liuotettiin metanoliin 10 ml:n mittapullossa, jolloin saatiin liuos, jonka pitoisuus oli 0,32 mg.ml-1. Kirjallisuuden [15] mukaan 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 ja 1,2 ml vertailuliuosta pipetoitiin, laimennettiin 10 ml:ksi metanolilla ja absorbanssi (A) mitattiin aallonpituudella 333 nm. Sovitettu vakiokäyräyhtälö oli Y=24.7596X+0.0147Y=24.7596X + 0.0147Y=24.7596X+0.0147, R2=0.9995R^2=0.9995R2=0.9995, lineaarisella alueella 0,0029–0,035 mg¹mL.0359.

3.5.1.2 Näyteliuoksen valmistaminen

100 mg näytejauhetta (joka kuljetettiin 100 meshin seulan läpi) punnittiin tarkasti, uutettiin ultraäänellä metanolilla 30 minuutin ajan (200 W, 40 kHz), laimennettiin 10 ml:ksi ja suodatettiin 0,22 um:n kalvon läpi. Sitten 0,2 ml suodosta laimennettiin edelleen 10 ml:ksi metanolilla ja sekoitettiin analysointia varten.

3.5.1.3 Määrittäminen

Kutakin näytettä kohti käytettiin 100 mg jauhetta näyteliuoksen valmistukseen. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 333 nm ja fenyylietanoidiglykosidien kokonaispitoisuus laskettiin (taulukko 9).

Yhtälö (1):
Sisältö (%) =C×V×Dm×100 %= \\dfrac{C \\times V \\times D}{m} \\times 100\\%=mC×V×D​×100 %
jossa CCC on analyytin pitoisuus näyteliuoksessa, VVV on laimennustilavuus, DDD on laimennustekijä ja mmm on näytteen massa (mg).

3.5.2 Polysakkaridien kokonaismäärän määritys

3.5.2.1 Vertailuliuoksen valmistaminen

Sopiva määrä vedetöntä vertailuainetta D-glukoosia punnittiin tarkasti, liuotettiin puhdistettuun veteen ja laimennettiin 10 ml:ksi, jolloin saatiin 0,190 mg-ml-1 liuos. Sekoituksen ja suodatuksen (0,22 um) jälkeen pipetoitiin 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 ja 1,0 ml. Värikehitys suoritettiin antroni-rikkihappomenetelmällä [16]. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 625 nm. Sovitettu vakiokäyräyhtälö oli Y=35.1316X−0,0079Y=35.1316X - 0.0079Y=35.1316X−0,0079, R2=0.9957R^2=0.9957R2=0.9957, lineaarisella alueella 0,0038–0,090 mg¹‹90,0,0.

3.5.2.2 Näyteliuoksen valmistaminen

40 mg näytejauhetta punnittiin tarkasti, liuotettiin ultraäänellä puhdistettuun veteen 30 minuutin ajan (200 W, 40 kHz), laimennettiin 10 ml:ksi ja suodatettiin 0,22 um:n kalvon läpi.

3.5.2.3 Määrittäminen

Kutakin näytettä kohti käytettiin 40 mg näyteliuoksen valmistukseen. Sitten pipetoitiin 0,1 ml suodosta ja lisättiin puhdistettua vettä 2,00 ml:ksi. Antroni-rikkihappomenetelmällä tapahtuneen värikehityksen jälkeen mitattiin absorbanssi ja laskettiin kokonaispolysakkaridien prosenttiosuus (taulukko 8).

3.5.3 Flavonoidien kokonaismäärän määritys

3.5.3.1 Vertailuliuoksen valmistaminen

Sopiva määrä rutiinin vertailuainetta punnittiin tarkasti, liuotettiin 70-prosenttiseen etanoliin ja laimennettiin 25 ml:ksi; suodatettiin 0,22 um:n kalvon läpi. Sitten pipetoitiin 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 ja 4,0 ml. Värikehitys suoritettiin natriumnitriitti-alumiininitraatti-natriumhydroksidi-menetelmällä [17]. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 510 nm. Sovitettu vakiokäyräyhtälö oli Y=11.5699X+0.0684Y=11.5699X + 0.0684Y=11.5699X+0.0684, R2=0.9989R^2=0.9989R2=0.9989, lineaarisella alueella 0,0097–0,0738 mg»m¹mL.

3.5.3.2 Näyteliuoksen valmistaminen

50 mg jauhetta punnittiin tarkasti, liuotettiin ultraäänellä 70-prosenttiseen etanoliin 30 minuutin ajan (200 W, 40 kHz), laimennettiin 10 ml:ksi ja suodatettiin 0,22 um:n kalvon läpi.

3.5.3.3 Määrittäminen

Kutakin näytettä kohti käytettiin 50 mg näyteliuoksen valmistukseen. Sitten 0,5 ml suodosta siirrettiin 10 ml:n mittapulloon ja värireagenssit lisättiin järjestyksessä kuten edellä. Puhdistettu vesi toimi aihiona. Absorbanssi mitattiin ja kokonaisflavonoidien prosenttiosuus laskettiin (taulukko 8).

 

4 Keskustelu

Tässä tutkimuksessa HPLC-sormenjäljetCistanche tubulosa and its various processed products were established. Peak matching across different batches confirmed 9 common peaks in raw slices and 11 common peaks in processed products. By comparison with reference standards, four common peaks were identified as echinacoside, cistanoside A, acteoside, and isoacteoside. Similarity analysis showed that similarity values among four processed products were all >0,9, ja yleiset sormenjälkiprofiilit olivat samanlaisia, mikä osoitti, että niiden ainestyypit olivat lähellä toisiaan. Suuret erot suhteellisten huippualueiden RSD:ssä viittaavat kuitenkin huomattaviin eroihin ainesosien pitoisuuksissa.

Raakaviipaleisiin verrattuna neljässä jalostetussa tuotteessa oli kaksi ylimääräistä huippua (huiput 2 ja 7), mikä osoitti, että kemialliset ainesosat muuttuivat viinin höyrytyksen, vesihöyrytyksen tai mustapavun käsittelyn jälkeen. Näiden uusien piikkien oletetaan muodostuvan käsittelyn aikana; niiden komponenttien karakterisointia käsitellään myöhemmissä tutkimuksissa.

CA-tulokset osoittivat, että kun luokkien välinen etäisyys oli<5, wine-steamed and water-steamed slices clustered together, suggesting similar chemical composition and content. At an inter-class distance of 10, raw slices could be separated from black-bean-juice-processed slices, stir-processed-with-black-beans slices, and wine/water-steamed slices. At inter-class distances of 15–25, differences between black-bean-juice-processed slices and other samples became more prominent. PCA results indicated that three principal components had substantial influence on comprehensive evaluation.

Eri prosessointimenetelmät vaikuttivat suoraan eri ainesosien tasoihin. Kemometrisen määrityksen perusteella fenyylietanoidiglykosidien kokonaismäärä luokiteltiin seuraavasti: mustapapumehukäsitelty > raakaviipaleet > vesihöyrytetty > viinihöyrytetty > sekoitettu-käsitelty mustilla papuilla. Polysakkaridien kokonaismäärä luokitellaan seuraavasti: vesihöyrytetty > viinihöyrytetty > sekoitettu-käsitelty mustilla papuilla > mustapapumehukäsitelty > raakaviipaleet. Flavonoidien kokonaismäärä luokitellaan seuraavasti: mustapapumehukäsitelty > vesihöyrytetty > sekoitettuna mustilla papuilla käsitelty > viinihöyrytetty > raakaviipaleet. Raakaviipaleisiin verrattuna mustapapumehun käsittely lisäsi fenyylietanoidiglykosidien kokonaispitoisuutta, kun taas muut käsittelymenetelmät vähensivät sitä; kaikki neljä käsittelymenetelmää lisäsivät merkittävästi polysakkaridien ja flavonoidien kokonaismäärää. Kahden mustapapumenetelmän välillä mustapapumehun käsittely tuotti suurempia lisäyksiä fenyylietanoidiglykosidien ja flavonoidien kokonaismäärässä kuin sekoituskäsittely mustilla papuilla tilastollisin eroin.

 

Taulukko 8. Fenyylietanoidiglykosidien, polysakkaridien ja flavonoidien kokonaismäärän määritystuloksetCistanche tubulosaja sen jalostetut tuotteet

Jalostettu tuote (keittopalat)	Fenyylietanoliglykosidit yhteensä (%)	Polysakkaridien kokonaismäärä (%)	Flavonoidit yhteensä (%)
Raakoja viipaleita	6.81 ± 0.06	5.85 ± 0.10	14.16 ± 0.24
Viinissä höyrytetyt viipaleet	5.10 ± 0.05***	6.61 ± 0.05***	20.84 ± 0.33***
Vesihöyrytetyt viipaleet	5.23 ± 0.05***	6.70 ± 0.15***	21.59 ± 0.37***
Sekoita käsitelty mustapapuviipaleilla	3.80 ± 0.02***	6.56 ± 0.09***	21.02 ± 0.35***
Mustapapu-mehulla käsitellyt viipaleet	7.07 ± 0.09****	6.09 ± 0.03****	24.26 ± 0.18****

Huomautuksia: Raakaviipaleisiin verrattuna: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; verrattuna sekoituskäsiteltyihin mustien papuviipaleiden kanssa: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Ekinakosidi, akteosidi, cistanosidi A ja isoakteosidi ovat keskeisiä fenyylietanolidiglykosideja, jotka edistävät munuaisia ​​vahvistavia ja esanssia hyödyllisiä vaikutuksia.Cistanche tubulosa. Näiden neljän ainesosan HPLC-vertailu osoitti, että piikkien pinta-alaerot yhteisten piikkien välillä voisivat toimia perustana erilaisten prosessoitujen tuotteiden erottamiselle. Raakaviipaleisiin verrattuna ekinakosidi, cistanosidi A ja isoakteosidi lisääntyivät vaihtelevassa määrin jalostetuissa tuotteissa ja selvemmin mustapapumehutuotteissa. Akteosidi väheni kolmessa jalostetussa tuotteessa, mutta lisääntyi mustilla papuilla käsitellyissä tuotteissa. Tämä voi liittyä akteosidin luontaiseen stabiiliuteen: fenyylietanoididiglykosidina, jossa on kofeoyyliosa, se voi läpikäydä esterisidoksen katkeamisen kuumennuslämpötilan, ajan ja pH:n muutosten seurauksena, jolloin muodostuu kofeiinihappoa ja osittain isomeroituu isoakteosidiksi. Havaittu akteosidin väheneminen ja isoakteosidin lisääntyminen neljässä jalostetussa tuotteessa saattaa liittyä korkean lämpötilan höyrytykseen, mikä on yhdenmukainen Rehmanniae Radix -käsittelyssä raportoitujen mallien kanssa [18].

Ekinakosidi lisääntyi tässä tutkimuksessa viinin/veden höyrytyksen ja mustapavun käsittelyn jälkeen, mikä on vastoin Zhang Chaon et al. [12]. Verrattaessa sekoituskäsittelyä mustien papujen ja mustapapumehun käsittelyyn, jälkimmäinen osoitti merkittävästi korkeampia ekinakosidi- ja cistanosidi A -pitoisuuksia ja selvempi konversiotrendi akteosidista isoakteosidiksi. Kaiken kaikkiaan tämä tutkimus paljastaa koostumuksen ja sisällön muutokset eri käsittelymenetelmien jälkeen ja vahvistaa muutoksen akteosidin ja isoakteosidin välillä. HPLC-sormenjäljet ​​tarjoavat tieteellisen menetelmän raakaviipaleiden ja prosessoitujen tuotteiden tunnistamiseen ja tarjoavat viitteen laadunvalvontastandardien laatimiseen sekä laadullisiin ja kvantitatiivisiin analyyseihin.

 

Eturistiriita

Kirjoittajat ilmoittavat, että ne eivät ole eturistiriitoja.

Tekijän panokset

XU Xiaoqin: hanketuki, tutkimuksen suunnittelu, kokeellinen määrittäminen ja käsikirjoitus;
QING Degang: yleinen koordinointi ja lääkkeiden kerääminen;
ZHANG Juan ja ZHAO Peng'an: ainesosien määrittäminen ja tietojen analysointi;
WANG Guoping: lääkemateriaalien autentikointi.

 

Cistanchen näytetehdas:

https://www.xjcistanche.com/about-us

 

 

Viitteet

[1] Kiinan kansantasavallan terveysministeriön farmakopeakomissio.Kiinan kansantasavallan farmakopea[M]. Peking: Chemical Industry Press, 2025.
[2] Jia Xiaoguang, Ni Hui, Zhang Juan ym. Tutkimuksen ja teollisuuden kehittämisen asemaCistanche tubulosa [J]. Xinjiangin lääketieteellisen yliopiston lehti, 2012, 35(7): 876–880.
[3] Liu Yuewen. Fenyylietanoidiglykosidien tutkimuksen edistyminenCistanche tubulosa [J]. Nykyaikaiset maatalouskoneet, 2020(11): 60–62.
[4] Tu Pengfei. Cistanches Herban [J] yrttitekstitodisteiden uudelleentarkastelu.China Journal of Chinese Materia Medica, 2022, 47(20): 5670–5679.
[5] Zhu Su, Teng Shuo, Liu Chun.Puji Fang[M]. Peking: People's Medical Publishing House, 1959.
[6] Wang Huaiyin.Taiping Shenghui Fang[M]. Peking: People's Medical Publishing House, 1959.
[7] Tang Shenwei.Chongxiu Zhenghe Jingshi Zhenglei Beiyong Bencao[M]. Peking: People's Medical Publishing House, 1957.
[8] Zhang Yong, Wu Huan. Cistanches Herban [J] käsittelymenetelmien historiallinen kehitys.China Journal of Chinese Materia Medica, 1992, 17(4): 213–214.
[9] Cai Hong, Bao Zhong, Jiang Yong. Käsittelytekniikka tuoreelleCistanche tubulosa [J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2007, 32(13): 1289–1291.
[10] Tie Xiaoyan, Feng Yinping, Ma Dongni. Alkuperäalueen höyrytyskäsittelyn vaikutus aavikon Cistanches Herba laatuun [J].Perinteisen kiinalaisen eläinlääketieteen lehti, 2021, 40(2): 54–56.
[11] Chen Weijun, Jia Cuiyu, Li Lianjiang. Eri prosessointimenetelmien vaikutukset betaiinipitoisuuteen XinjiangissaCistanche tubulosa [J]. Maatalouden talteenottolääketiede, 2009, 31(5): 400–402.
[12] Zhang Chao, Hua Yue, Lian Jing ym. Tutkimus fenyylietanoidiglykosidien sisällön vaihtelusta Cistanches Herban käsittelyn aikana [J].Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine, 2022, 29(4): 92–97.
[13] Wu Chunxing, Yang Yang, Meng Mei ym. TCM-sormenjälkien tutkimustilanne ja trendianalyysi viimeisen vuosikymmenen aikana [J].Kiinan Minzu-yliopiston lehti (luonnontieteellinen painos), 2024, 33(4): 63–72.
[14] Jiang Yong, Bao Zhong, Sun Yongqiang. Tutkimus Cistanches Herba -viipaleiden käsittelyteknologiasta [J].Chinese Pharmaceutical Journal, 2011, 46(14): 1074–1076.
[15] Zhang Leihong, Du Niansheng, Wang Qing. Fenyylietanoidiglykosidien määritys Cistanches Herba kokonaisglykosidikapseleista UV-spektrofotometrialla [J].Xinjiangin lääketieteellisen yliopiston lehti, 2002, 25(4): 407–408.
[16] Ailadan·Maimaiti Aili, Yang Ting, Yuan Jie. Polysakkaridien uuttoprosessi ja in vitro antioksidanttiaktiivisuus jäämistäCistanche tubulosa [J]. Chemical and Biochemical Engineering Quarterly(käännetty lehden nimi perustuu kiinan kieleen), 2020, 37(2): 36–41.
[17] Luo Yan. Flavonoidien kokonaisuuttoprosessin optimointiCistanche tubulosa[D]. Shihezi: Shihezi University, 2015.
[18] Shan Guoshun, Zhao Qimiao, Li Rui et ai. Akteosidipitoisuuden dynaaminen tutkimus käsittelyn aikanaRehmannia glutinosa [J]. Aasian ja Tyynenmeren perinteinen lääketiede, 2019, 15(3): 37–39.