Cistanche Tubulosasta peräisin olevan kalkonisyntaasin kloonaus, funktionaalinen tunnistus ja ilmentymisanalyysi

Tiivistelmä: Tavoite Tutkia kalkonisyntaasin toimintaa Guanhuaroucongrongista (Cistanche tubulosa) ja CtCHS-geenin ilmentymiskuvio valkoisissa, punaisissa ja purppuraisissa kukissa.

Menetelmät CtCHS-geeni kloonattiin RT-PCR:llä ja suoritettiin bioinformatiikkaanalyysi. pET-28a-CtCHS-plasmidi siirrettiin Escherichia coliin proteiiniekspression indusoimiseksi IPTG:llä. CtCHS-rekombinanttiproteiinia inkuboitiin substraattien p-kumaroyyli-CoA ja malonyyli-CoA kanssa, ja tuotteet havaittiin HPLC:llä ja MS:llä. pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS-plasmidi siirrettiin Arabidopsis thalianan protoplastiin CtCHS-proteiinin subsellulaarisen lokalisoinnin havaitsemiseksi. CtCHSgenen ilmentymäkuvio kukissaC. tubulosakolmella värillä havaittiin qRT-PCR:llä.

Tulokset CtCHS-geeni kloonattiin. Avoimen lukukehyksen (ORF) pituus oli 1173 bp ja se koodaa 390 aminohappoa ja proteiinin molekyylipaino oli 42 8000. CtCHS sisälsi katalyyttiset tähteet Cys164, His303, Asn336, jotka konservoituivat kalkonisyntaasissa. CtCHS-proteiini ekspressoitiin E. colissa ja puhdistettiin rekombinanttiproteiinin saamiseksi. CtCHS-proteiini voisi katalysoida p-kumaroyyli-CoA:ta ja malonyyli-CoA:ta tuottamaan naringeniinikalkonia. CtCHS-proteiini sijoittui pääasiassa sytoplasmaan. CtCHS-geeni ilmentyi voimakkaasti purppuraisissa ja punaisissa kukissa, ja suhteelliset ilmentymistasot olivat vastaavasti 8,44 ja 3,21 kertaa korkeammat kuin valkoisilla kukilla.

Johtopäätös CtCHS-geeni kloonattiin kukkastaC. tubulosaja proteiini ilmentyi. CtCHS-proteiinilla on kalkonisyntaasitoiminto, ja CtCHS-geenin ilmentyminen on korkeampaa tummemmissa kukissa, mikä osoittaa, että CtCHSgeeni voi säädellä C. tubulosan kukkien väriä, mikä luo perustan jatkotutkimukselle.C. tubulosan kukkien värin säätelymekanismi.

Avainsanat:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; kalkonisyntaasi; entsyymiaktiivisuuden analyysi; subsellulaarinen lokalisointi; ilmaisuanalyysi

NAPSAUTA TÄSTÄ SAADAksesi LUONNOLLISTA ORGAANIISTA KISTANKSIUUTEtta, jossa on 30 % EKINAKOOSIDIA JA 12 % AKTEOSIDIA

Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin vesisäiliön viejä:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950

Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Biosynteettinenflavonoidien reittialkaa fenyylipropanoidireitillä.Fenyylialaniinimuunnetaan ensin kanelihapoksifenyylialaniiniammonialyaasin vaikutus(PAL), ja kanelihappo 4-hydroksyloituu kanelihapolla. Entsyymi (kanelihappo-4-hydroksylaasi, C4H) ja 4-kumaraattikoentsyymi A ligaasi (4-kumaraattikoentsyymi A ligaasi, 4CL) katalysoivat reaktiota muodostaen 4-kumaroyyli-CoA:ta [11 ]. Kalkonisyntaasi (CHS) katalysoi yhtä 4-kumaroyyli-CoA-molekyyliä ja kolme malonyyli-CoA-molekyyliä naringeniinikalkonin tuottamiseksi, jossa on flavonoidiyhdisteitä. Kalkoni-isomeraasin perusrunko, flavanoni-3-hydroksylaasi, dihydroflavonoli 4-reduktaasi jne. tuottaa erilaisia ​​flavonoideja, kuten isoflavoneja, flavonoleja, antosyaaneja jne. [12]. Keskeisenä entsyyminä flavonoidien biosynteettisessä reitissä CHS säätelee flavonoidien pitoisuutta kasveissa ja sillä on myös tärkeä rooli kasvien kukkien värin säätelyssä [13]. Esimerkiksi Gentiana scabra Bunge CHS:n transkription jälkeinen geenin hiljentäminen voi estää antosyaniinien biosynteesiä ja aiheuttaa spesifistä teriälohkojen valkaisua [14]. Actinidia erianthaBenthin CHS-geenin hiljentäminen. CHS vähentää antosyaanipitoisuutta terälehdissä ja tekee terälehdistä punaisia. Terälehdet vaalenevat väriltään[15]. Siksi tässä tutkimuksessa CtCHS-geeni kloonattiin Cistanche tubulosan kukista, ja sille suoritettiin bioinformatiikka-analyysi, prokaryoottinen ilmentyminen ja puhdistus, entsyymiaktiivisuusanalyysi, solunsisäinen lokalisaatioanalyysi ja ilmentymisanalyysi kolmessa kukkavärissä CtCHS:n toiminnan tutkimiseksi. proteiinia ja CtCHS-geenin ilmentymismallia käytettiin alustavasti tutkimaan CtCHS:n ja Cistanche tubulosa -kukkien värin välistä suhdetta, mikä loi perustan CtCHS-geenin säätelymekanismin tutkimukselle.Cistanche tubulosa kukan väri.

1 Materiaalit ja välineet

1.1 Materiaalit

Cistanche tubulosa -kukat kerättiin Yutian Countysta, Hotanin prefektuurista, Xinjiangista toukokuussa 2018. Näytteenotossa noudatettiin satunnaisperiaatetta ja valittiin Cistanche tubulosa -kukkia, joilla oli hyvä fysiologinen tila ja tasainen kasvin korkeus. Professori Tu Pengfei Pekingin yliopiston farmasian korkeakoulusta otti kolme Cistanche tubulosa -kantaa, joissa oli kolme kukkaväriä, valkoinen, punainen ja violetti, ja tunnisti ne Cistanche tubulosa (Schenk) Wightiksi. Ne jäädytettiin nopeasti nestetypessä ja kuljetettiin sitten Pekingiin kuivajäässä. E. coli DH5 kemiallisesti toimivaltaiset solut ostettiin yhtiöltä Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd. ja E. coli BL21 (DE3) kemiallisesti toimivaltaiset solut hankittiin yhtiöltä Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektori ostettiin yhtiöltä Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyyli-CoA ostettiin Sigma Companylta, 4-kumaroyyli-CoA, naringeniini -kalkoni ostettiin Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.:ltä ja naringeniini ostettiin Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.:ltä.

1.2 Laitteet

Nanodrop 2000C -spektrofotometri (Thermo Fisher Company, USA); gradientti-PCR-laite (Eppendorf Company, Saksa); CFX 96 fluoresenssikvantitatiivinen PCR-laite, UVP-geelikuvantaja, geelielektroforeesilaite, proteiinielektroforeesilaite (BioRad Company, USA); EnSpire

Mikrolevylukija (PerkinElmer Company, USA); vakiolämpötilan inkubaattori (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D suuren kapasiteetin täyden lämpötilan oskillaattori (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Vesikylvyn vakiolämpötila-oskillaattori (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH erittäin puhdas työpöytä (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); korkeapaineinen höyrysterilointilaite (TOMY Company, Japani); Milli Q puhdasta vettä instrumentti (Millipore, Yhdysvallat); LC-20Tehokas nestefaasikromatografi (Shimadzu Company, Japani); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap korkearesoluutioinen massaspektrometria (Thermo Fisher Company, USA); FV1200 laserkonfokaalinen mikroskooppi (Olympus Company, Japani).

2 Kokeellinen menetelmä

2.1 RNA:n uutto ja cDNA-synteesi.

Cistanche tubulosa -kukat jauhettiin nestetypessä ja alistettiin sitten RNA-uuttomääritykselle.

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä pakkausta (Norgen, Cat 17200), RNA:n pitoisuus ja laatu havaittiin NanoDrop 2000C:llä, ja RNA-näytteet, joiden A260/A280-suhde oli välillä 1,8-2,1, valittiin käänteistranskriptioon cDNA:n syntetisoimiseksi. M-MLV-käänteistranskriptaasia (Promega, M170B) käytettiin kelpuutetun kokonais-RNA:n käänteiskopioimiseen cDNA:ksi. Koetoimenpiteet suoritettiin ohjeiden mukaan.

2.2 CtCHS-geenin kloonaus

Tutkimusryhmämme Cistanche tubulosa -kukkien transkriptitietojen [16] perusteella seulottiin CtCHS, jossa oli täydellinen avoin lukukehys, ja SnapGene-ohjelmistolla suunniteltiin spesifisiä alukkeita geenisekvenssin perusteella (taulukko 1). PCR-amplifikaatio suoritettiin käyttämällä Cistanche tubulosa -kukka-cDNA:ta templaattina. Monistusjärjestelmä oli 2 × Phanta Max -puskuri 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, ylävirran ja alavirran alukkeet (10 μmol/L) 2 μL kumpikin, cDNA 2 μL, Phanta Max Super Fidelity DNA Polymerase, 1 μL ddH2O 17 μL. Reaktio-olosuhteet olivat: esidenaturointi 95 asteessa 3 minuuttia; 25 denaturointisykliä 95 asteessa 15 s, hehkutus 55 asteessa 15 s ja pidennys 72 asteessa 1 min; reaktion pidentäminen 72 asteessa 5 minuutin ajan. PCR-tuote havaittiin 1 % agaroosigeelielektroforeesilla ja DNA-puhdistuspakkausta (Novizan, Cat DC301-01) käytettiin geelin talteenottoon, minkä jälkeen talteen otettu DNA puhdistettiin nopealla kloonauspakkauksella (Novizan, Cat). C601-01). DNA-fragmentti ligoitiin pCE2TA/Blunt-Zero-vektoriin, transformoitiin Escherichia coli DH5 -kompetenttisiin soluihin ja yön yli 37 asteessa viljelyn jälkeen yksittäiset kloonikannat valittiin ja lähetettiin yritykselle sekvensointia varten.

Taulukko 1 Alukesekvenssit

2.3 Bioinformatiikka-analyysi

Käytä ProtParam online-ohjelmistoa analysoimaan proteiinien fysikaalisia ja kemiallisia ominaisuuksia; käytä Prot Scale -verkkotyökalua proteiinien hydrofiilisyyden/hydrofobisuuden analysointiin; käyttää online-työkalua SOPMA ennustamaan proteiinin sekundaarirakennetta; käyttää online-analyysiohjelmistoa SWISS-MODEL ennustaaksesi proteiinin tertiaarista rakennetta; käytä online-ohjelmistoa TMHMM Ennusta proteiinin transmembraanirakenne; käytä DNAMAN-ohjelmistoa vertaamaan CtCHS:n homologiaa muiden lajien CHS-aminohapposekvensseihin; käytä MEGA-X-ohjelmistoa fylogeneettisen puun rakentamiseen naapuriliitoksen (NJ) ja Poisson-korjauksen avulla. Evoluutioetäisyys lasketaan Bootstrap-menetelmällä ja Bootstrap-toistojen määrä on 1000 kertaa.

2.4 CtCHS-prokaryoottinen ilmentäminen ja puhdistus

Suunnittele alukkeet, joissa on restriktiokohdat BamHⅠ ja XhoⅠ CtCHS-sekvenssin perusteella, ja PCR monistaa vastaavat kohdefragmentit. pET-28a-vektori ja kohdefragmentti digestoitiin käyttämällä endonukleaaseja BamHI ja Kloonattu kanta sekvensoidaan ja plasmidi uutetaan oikean sekvensoinnin jälkeen. Sekvensoinnilla varmennettu pET-28a-CtCHS-plasmidi siirrettiin Escherichia coli BL21:n (DE3) kompetentteihin soluihin. Katso Ding Ning et ai. [17] isopropyylillä

-D-tiogalaktopyranosidia (IPTG) käytettiin indusoimaan proteiinin ilmentymistä alhaisessa lämpötilassa, ja se puhdistettiin Ni2+-affiniteettikromatografiakolonnilla (Cytiva, Cat 17531901). Proteiini konsentroitiin sentrifugoimalla ultrasuodatusputkessa (Millipore, 30 000) ja suolat poistettiin. Säilytä 20 mmol/L KPB-puskurissa (pH 8,0, sisältää 1 mmol/LEDTA) ja säilytä -80 asteen jääkaapissa pitkäaikaista säilytystä varten.

2.5 CtCHS-entsyymiaktiivisuusanalyysi

CtCHS-entsyymireaktiojärjestelmä: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonyyli-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroyyli-CoA 2 μL, CtCHS rekombinantti proteiinia 20 µl, in Sen jälkeen kun seos oli reagoinut vesihauteessa 37 asteessa 12 tunnin ajan, seos uutettiin kolme kertaa 800 µl:lla etyyliasetaattia, kuivattiin typpivirtauksella ja liuotettiin sitten 100 µl:aan metanolia. Käytä korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa tuotteen havaitsemiseen. Olosuhteet ovat Ultimate LP-C18 -kolonni (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), kolonnin lämpötila 30 astetta, näytteen tilavuus 10 μL ja vesi (A) ja asetonitriili (B) virtauksena. Faasi, eluutiogradientti: 0-10

min, 30 % B; 10-20 min, 30-60 % B; 20-25 min, 60-70 % B; 25-30 min, 70-80 % B; 30-35 min, 80-100 % B; 35-40 min, 100 % B; 40-46 min, 100 %-30% B. Tilavuusvirtausnopeus on 1 ml/min ja tunnistus tapahtuu aallonpituudella 290 nm.

Lisähavainnointiin käytettiin UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS:ää. Nestefaasiolosuhteet olivat Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 -kolonni (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonnin lämpötila 40 astetta, naringeniini- kalkonin ja naringeniinin kontrollit. Tuotteen lataustilavuus on 4 μL ja entsyymireaktiotuotteen lataustilavuus on 7 μL. Liikkuvana faasina käytetään vettä (A)-asetonitriiliä (B). Eluointigradientti on: 0 - 5 min, 30 % B; 5-15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60 %-100% B; 20-25 min, 100 % B; 25-31 min, 100 %-30 % B. Tilavuusvirtausnopeus on 0,3 ml/min. Massaspektrometrian olosuhteet ovat sähkösumutusionilähde, typpi kantokaasuna, vaippakaasun paine 3,5 MPa, apukaasun paine 1,0 MPa, ruiskutuspaine 3500 V, kapillaarilämpötila 350 astetta, apukaasun kuumennuslämpötila 200 astetta, positiiviset ja negatiiviset ionit, skannaus ionialueen m/z on 100-1500, täysi MS-resoluutio on 35 000, dd-MS2-resoluutio on 17 500, (N)

CE/porrastettu nce asetettu arvoon 35, 60.

2.3 Bioinformatiikka-analyysi

Käytä ProtParam online-ohjelmistoa analysoimaan proteiinien fysikaalisia ja kemiallisia ominaisuuksia; käytä Prot Scale -verkkotyökalua proteiinien hydrofiilisyyden/hydrofobisuuden analysointiin; käyttää online-työkalua SOPMA ennustamaan proteiinin sekundaarirakennetta; käyttää online-analyysiohjelmistoa SWISS-MODEL ennustaaksesi proteiinin tertiaarista rakennetta; käytä online-ohjelmistoa TMHMM Ennusta proteiinin transmembraanirakenne; käytä DNAMAN-ohjelmistoa vertaamaan CtCHS:n homologiaa muiden lajien CHS-aminohapposekvensseihin; käytä MEGA-X-ohjelmistoa fylogeneettisen puun rakentamiseen naapuriliitoksen (NJ) ja Poisson-korjauksen avulla. Evoluutioetäisyys lasketaan Bootstrap-menetelmällä ja Bootstrap-toistojen määrä on 1000 kertaa.

2.4 CtCHS-prokaryoottinen ilmentäminen ja puhdistus

Suunnittele alukkeet, joissa on restriktiokohdat BamHⅠ ja XhoⅠ CtCHS-sekvenssin perusteella, ja PCR monistaa vastaavat kohdefragmentit. pET-28a-vektori ja kohdefragmentti digestoitiin käyttämällä endonukleaaseja BamHI ja Kloonattu kanta sekvensoidaan ja plasmidi uutetaan oikean sekvensoinnin jälkeen. Sekvensoinnilla varmennettu pET-28a-CtCHS-plasmidi siirrettiin Escherichia coli BL21:n (DE3) kompetentteihin soluihin. Katso Ding Ning et ai. [17] isopropyylillä

-D-tiogalaktopyranosidia (IPTG) käytettiin indusoimaan proteiinin ilmentymistä alhaisessa lämpötilassa, ja se puhdistettiin Ni2+-affiniteettikromatografiakolonnilla (Cytiva, Cat 17531901). Proteiini konsentroitiin sentrifugoimalla ultrasuodatusputkessa (Millipore, 30 000) ja suolat poistettiin. Säilytä 20 mmol/L KPB-puskurissa (pH 8,0, sisältää 1 mmol/LEDTA) ja säilytä -80 asteen jääkaapissa pitkäaikaista säilytystä varten.

2.5 CtCHS-entsyymiaktiivisuusanalyysi

CtCHS-entsyymireaktiojärjestelmä: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonyyli-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroyyli-CoA 2 μL, CtCHS rekombinantti proteiinia 20 µl, in Sen jälkeen kun seos oli reagoinut vesihauteessa 37 asteessa 12 tunnin ajan, seos uutettiin kolme kertaa 800 µl:lla etyyliasetaattia, kuivattiin typpivirtauksella ja liuotettiin sitten 100 µl:aan metanolia. Käytä korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa tuotteen havaitsemiseen. Olosuhteet ovat Ultimate LP-C18 -kolonni (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), kolonnin lämpötila 30 astetta, näytteen tilavuus 10 μL ja vesi (A) ja asetonitriili (B) virtauksena. Faasi, eluutiogradientti: 0-10

min, 30 % B; 10-20 min, 30-60 % B; 20-25 min, 60-70 % B; 25-30 min, 70-80 % B; 30-35 min, 80-100 % B; 35-40 min, 100 % B; 40-46 min, 100 %-30% B. Tilavuusvirtausnopeus on 1 ml/min ja tunnistus tapahtuu aallonpituudella 290 nm.

Lisähavainnointiin käytettiin UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS:ää. Nestefaasiolosuhteet olivat Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 -kolonni (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonnin lämpötila 40 astetta, naringeniini- kalkonin ja naringeniinin kontrollit. Tuotteen lataustilavuus on 4 μL ja entsyymireaktiotuotteen lataustilavuus on 7 μL. Liikkuvana faasina käytetään vettä (A)-asetonitriiliä (B). Eluointigradientti on: 0 - 5 min, 30 % B; 5-15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60 %-100% B; 20-25 min, 100 % B; 25-31 min, 100 %-30 % B. Tilavuusvirtausnopeus on 0,3 ml/min. Massaspektrometrian olosuhteet ovat sähkösumutusionilähde, typpi kantokaasuna, vaippakaasun paine 3,5 MPa, apukaasun paine 1,0 MPa, ruiskutuspaine 3500 V, kapillaarilämpötila 350 astetta, apukaasun kuumennuslämpötila 200 astetta, positiiviset ja negatiiviset ionit, skannaus ionialueen m/z on 100-1500, täysi MS-resoluutio on 35 000, dd-MS2-resoluutio on 17 500, (N)

CE/porrastettu nce asetettu arvoon 35, 60.

2.6 CtCHS-proteiinin subsellulaarinen sijainti

CtCHS-sekvenssin ja saumattoman kloonauksen periaatteen perusteella suunniteltiin alukkeet, joissa oli entsyymileikkauskohdat KpnⅠ ja BamHⅠ, ja vastaavat kohdefragmentit monistettiin PCR:llä. pCAMBIA1300-35S-GFP-plasmidi digestoitiin restriktioendonukleaaseilla Kpn Ⅰ ja BamH Ⅰ, ja kohdefragmentti ja vektori yhdistettiin saumattoman kloonauspakkauksen (Novizan, Cat C115-01) kautta ja siirrettiin sitten E. coli DH5 -kompetensseihin soluihin. , valitse yksittäiset kloonikannat sekvensointia varten ja uutta plasmidit oikeista kannoista. Plasmidit pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS ja pCAMBIA 1300-35S-GFP transformoitiin Arabidopsis thaliana -protoplasteiksi käyttäen PEG4000:aa ja viljeltiin heikossa valossa 8-10 tuntia. CtCHS-proteiinin subsellulaarinen lokalisaatio havaittiin laserkonfokaalimikroskoopilla.

2.7 CtCHS-ilmentymiskuvion analyysi

Reaaliaikaiset fluoresoivat kvantitatiiviset alukkeet suunniteltiin käyttämällä DNAMAN:ia CtCHS-sekvenssin perusteella, F-boxin sisäisenä vertailugeeninä. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa 1. CtCHS:n suhteellinen ilmentyminen erivärisissä Cistanche tubulosan kukissa havaittiin reaaliaikaisella fluoresoivalla kvantitatiivisella PCR:llä. Käytä TransStart Green qPCR SuperMixiä (full gold, AQ101-02) mittaamaan SYBRGreen fluoresoivalla väriainemenetelmällä. Reaktiojärjestelmä: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 µl, ylävirran ja alavirran alukkeet (10 µmol/L) 0,2 µl kumpikin, cDNA-templaatti 0,5 µL, käytettiin 4,1 µl nukleotidaasvapaata vettä reaktiolle kaksivaiheisella menetelmällä. Reaktiomenetelmä perustui menetelmään, jonka ovat kuvanneet Dong Xianjuan et ai. [18]. Jokainen näyte sisälsi 3 biologista toistoa, ja koe toistettiin kolme kertaa. Kokeelliset tiedot analysoitiin Excelillä, CtCHS:n suhteellinen ilmentyminen laskettiin 2−ΔΔCt-menetelmällä ja GraphPadPrism 8:lla suoritettiin merkitsevyysanalyysi ja piirrettiin histogrammeja.