Cistanche Tubulosasta peräisin olevan kalkonisyntaasin kloonaus, funktionaalinen tunnistus ja ilmentymisanalyysi

Tiivistelmä: Tavoite

Tutkia toimintoakalkonisyntaasi Cistanche tubulosastaja CtCHS-geenin ilmentymiskuvio valkoisissa, punaisissa ja purppuraisissa kukissa.

menetelmätCtCHS-geeni kloonattiin RT-PCR:llä ja suoritettiin bioinformatiikka-analyysi. pET-28a-CtCHS-plasmidi siirrettiin Escherichia coliin proteiinin ilmentymisen indusoimiseksi IPTG:llä. CtCHS-rekombinanttiproteiinia inkuboitiin substraattien p-kumaroyyli-CoA ja malonyyli-CoA kanssa, ja tuotteet havaittiin HPLC:llä ja MS:llä. pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS-plasmidi siirrettiin Arabidopsis thalianan protoplastiin CtCHS-proteiinin subsellulaarisen lokalisoinnin havaitsemiseksi. CtCHS-geenin ilmentymiskuvio C. tubulosan kukissa kolmella värillä havaittiin qRT-PCR:llä.

TuloksetCtCHS-geeni kloonattiin. Avoimen lukukehyksen (ORF) pituus oli 1173 bp, joka koodaa 390 aminohappoa, ja proteiinin molekyylipaino oli 42 8000.

LUOMU KISTANSSIUUTE, SISÄLTÄ 30 % EKINAKOOSIDEA JA 12 % AKTEOSIDIA

CtCHS sisälsi katalyyttiset tähteet Cys164, His303, Asn336, jotka konservoituivat kalkonisyntaasissa. CtCHS-proteiini ekspressoitiin E. colissa ja puhdistettiin rekombinanttiproteiinin saamiseksi. CtCHS-proteiini voisi katalysoida p-kumaroyyli-CoA:ta ja malonyyli-CoA:ta tuottamaan naringeniinikalkonia. CtCHS-proteiini sijoittui pääasiassa sytoplasmaan. CtCHS-geeni ilmentyi voimakkaasti purppuraisissa ja punaisissa kukissa, ja suhteelliset ilmentymistasot olivat 8,44 ja 3,21 kertaa korkeammat kuin valkoisissa kukissa.

Johtopäätös CtCHS-geeni kloonattiin C. tubulosan kukasta ja proteiini ekspressoitiin. CtCHS-proteiinilla on kalkonisyntaasitoimintoa ja CtCHS-geenin ilmentyminen on korkeampaa tummemmissa kukissa, mikä osoittaa, että CtCHS-geeni saattaa säädellä C. tubulosan kukan väriä, mikä luo perustan jatkotutkimukselle C:n kukkavärin säätelymekanismista. tubulosa.

Avainsanat: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; kalkonisyntaasi; entsyymiaktiivisuuden analyysi; subsellulaarinen lokalisointi; ilmentymisanalyysi

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT on pyreal-kasvi, jota esiintyy luonnollisesti Etelä-Xinjiangissa [1] Xinjiangin Hetianin alueella [2]. Piippukukkien lääkearvo on korkea. Sen lihavarret ovat yksi vuoden 2020 version lähteistä "Kiinan farmakopea". [3] Piippukukkien Cordonus -lihavarsien tutkimus on lisääntynyt, mutta sen kukista on suhteellisen vähän biologista tutkimusta. Piippukukkien kukinta-aika on huhtikuusta toukokuuhun [4], pääasiassa Valkoista on kolme väriä , punainen ja violetti Piippukukat ovat väriltään runsaita, mutta niiden kukkavärin säätelymekanismia ei ole raportoitu ja geneettiset tekijät [5] kasvien kukkien pigmentti sisältää pääasiassa kolme luokkaa: flavonoidit, karoteeni ja beetiini, joista suurin on suuri värivalikoima [7] Paeonia Lactiflora Pall -lajikkeena.

Se näkyy valkoisena, ja värin pääväri sisältää punaisen värin ja kaunis kompetenssi saa kukat esille purppuranpunaisina [8]. Kukkaväri on monien koristekasvien tärkeä ominaisuus, ja se on myös avaintekijä, joka houkuttelee vaaleanpunaisia ​​hyönteisiä [9]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että se periytyy. Suurin hyönteisten käyntitaajuus on syväpurppurakasvi [10]. Biologisessa tutkimuksessa putkikukkien cistanosauruskukissa olevien cistanoidien synteettistä geneettistä tutkimusta varten se auttaa selventämään putkikukkakoordonin värinsäätömekanismia, tarjoamalla teoreettisen perustan geenitekniikan värin parantamiselle, edistämällä sen rikkaampia värejä, lisäämällä katselua, laajentaa sovellusaluetta.

Biosynteettinen reittiflavonoiditalkaafenyylipropanoidireitti. Fenyylialaniini muunnetaan ensin kanelihapoksi fenyylialaniiniammonialyaasin (PAL) vaikutuksesta, ja kanelihappo 4-hydroksyloituu kanelihapolla. Entsyymi (kanelihappo-4-hydroksylaasi, C4H) ja 4-kumaraattikoentsyymi A ligaasi (4-kumaraattikoentsyymi A ligaasi, 4CL) katalysoivat reaktiota 4-kumaroyyli-CoA:n muodostamiseksi [11]. Kalkonisyntaasi (CHS) katalysoi yhtä 4-kumaroyyli-CoA-molekyyliä ja kolme malonyyli-CoA-molekyyliä muodostaen naringeniinikalkonia, jolla onflavonoidiyhdisteetKalkoni-isomeraasin, flavanoni-3-hydroksylaasin, dihydroflavonoli-4-reduktaasin jne. perusrunko tuottaa erilaisia ​​flavonoideja, kuten isoflavoneja, flavonoleja, antosyaaneja jne. [12]. Keskeisenä entsyyminä flavonoidien biosynteettisessä reitissä CHS säätelee flavonoidien pitoisuutta kasveissa ja sillä on myös tärkeä rooli kasvien kukkien värin säätelyssä [13]. Esimerkiksi Gentiana scabra Bunge CHS:n transkription jälkeinen geenin hiljentäminen voi estää antosyaniinien biosynteesiä ja aiheuttaa spesifistä teriälohkojen valkaisua [14]. Actinidia eriantha Benthin CHS-geenin hiljentäminen. CHS vähentää antosyaanipitoisuutta terälehdissä ja aiheuttaa punaisten terälehtien väri vaalenee [15]. Siksi tässä tutkimuksessa CtCHS-geeni kloonattiin Cistanche deserticola -kukista, ja sille suoritettiin bioinformatiikka-analyysi, prokaryoottinen ilmentyminen ja puhdistus, entsyymiaktiivisuusanalyysi, subsellulaarinen lokalisaatioanalyysi ja ilmentymisanalyysi kolmessa kukkavärissä CtCHS:n toiminnan tutkimiseksi. proteiinia ja CtCHS-geenin ilmentymismallia käytettiin tutkimaan alustavasti CtCHS:n ja Cistanche deserticola -kukkien värin suhdetta, mikä loi perustan Cistanche deserticola -kukkien värin säätelymekanismin tutkimukselle.

1 Materiaalit ja välineet

1.1 Materiaalit

Cistanche tuberosa -kukat kerättiin Yutian Countysta, Hotanin prefektuurista, Xinjiangista toukokuussa 2018. Näytteenotossa noudatettiin satunnaisperiaatetta ja valittiin Cistanche tuberosa -kukat, joilla oli hyvä fysiologinen tila ja tasainen kasvin korkeus. Pekingin yliopiston farmasian professori Tu Pengfei otti kolme Cistanche deserticola -kantaa, joissa oli kolme kukkaväriä, valkoinen, punainen ja violetti, ja tunnisti ne Cistanche tubulosa (Schenk) Wightiksi. Ne jäädytettiin nopeasti nestetypessä, säilytettiin kuivajäässä ja kuljetettiin Pekingiin. E. coli DH5 kemiallisesti toimivaltaiset solut ostettiin yhtiöltä Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd. ja E. coli BL21 (DE3) kemiallisesti toimivaltaiset solut hankittiin yhtiöltä Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektori ostettiin yhtiöltä Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyyli-CoA ostettiin Sigma Companylta, 4-kumaroyyli-CoA, naringeniini -kalkoni ostettiin Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.:ltä ja naringeniini ostettiin Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.:ltä.

1.2 Laitteet

Nanodrop 2000C -spektrofotometri (Thermo Fisher Company, USA); gradientti-PCR-laite (Eppendorf Company, Saksa); CFX 96 fluoresenssikvantitatiivinen PCR-laite, UVP-geelikuvantaja, geelielektroforeesilaite, proteiinielektroforeesilaite (BioRad Company, USA); EnSpire

Mikrolevylukija (PerkinElmer Company, USA); vakiolämpötilan inkubaattori (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D suuren kapasiteetin täyden lämpötilan oskillaattori (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Vesikylvyn vakiolämpötila-oskillaattori (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH erittäin puhdas työpöytä (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); korkeapaineinen höyrysterilointilaite (TOMY Company, Japani); Milli Q puhdasta vettä instrumentti (Millipore, Yhdysvallat); LC-20Tehokas nestefaasikromatografi (Shimadzu Company, Japani); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap korkearesoluutioinen massaspektrometria (Thermo Fisher Company, USA); FV1200 laserkonfokaalinen mikroskooppi (Olympus Company, Japani).

2 Kokeellinen menetelmä

2.1 RNA:n uutto ja cDNA-synteesi. Cistanche deserticola -kukat jauhettiin nestetypessä ja alistettiin sitten RNA-uuttomääritykselle.

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä pakkausta (Norgen, Cat 17200), RNA:n konsentraatio ja laatu havaittiin NanoDrop 2000C:llä ja RNA-näytteet, joiden A260/A280-suhde oli välillä 1,8 - 2,1, valittiin cDNA:n käänteiskopiointisynteesiä varten. M-MLV-käänteistranskriptaasia (Promega, M170B) käytettiin kelpuutetun kokonais-RNA:n käänteistranskriptioon cDNA:ksi. Koetoimenpiteet suoritettiin ohjeiden mukaan.

2.2 CtCHS-geenin kloonaus

Tutkimusryhmämme Cistanche deserticola -kukkien transkriptitietojen [16] perusteella seulottiin CtCHS, jossa oli täydellinen avoin lukukehys, ja SnapGene-ohjelmistolla suunniteltiin spesifisiä alukkeita geenisekvenssin perusteella (taulukko 1). PCR-monistus suoritettiin käyttämällä Cistanche deserticola -kukka-cDNA:ta templaattina. Monistusjärjestelmä oli 2 × Phanta Max -puskuri 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, ylävirran ja alavirran alukkeet (10 μmol/L) 2 μL kumpikin, cDNA 2 μL, Phanta Max Super Fidelity

DNA-polymeraasi 1 μL, ddH2O 17 μL. Reaktio-olosuhteet olivat: esidenaturointi 95 asteessa 3 minuuttia; 25 denaturointisykliä 95 asteessa 15 s, hehkutus 55 asteessa 15 s ja pidennys 72 asteessa 1 min; ja reaktion pidentäminen 72 asteessa 5 minuuttia. PCR-tuote havaittiin 1-prosenttisella agaroosigeelielektroforeesilla ja DNA-puhdistuspakkausta (Novizan, Cat DC301-01) käytettiin geelin talteenottoon, minkä jälkeen talteen otettu DNA puhdistettiin nopealla kloonauspakkauksella (Novizan, Cat). C601-01). DNA-fragmentti ligoitiin pCE2 TA/Blunt-Zero -vektoriin, transformoitiin Escherichia coli DH5 -kompetenttisiin soluihin, ja yön yli 37 asteessa viljelyn jälkeen yksittäiset kloonikannat valittiin ja lähetettiin yritykselle sekvensointia varten.

Taulukko 1 Alukesekvenssit

2.3 Bioinformatiikan analyysi

Käytä ProtParam online-ohjelmistoa analysoimaan proteiinien fysikaalisia ja kemiallisia ominaisuuksia; käytä Prot Scale -verkkotyökalua proteiinien hydrofiilisyyden/hydrofobisuuden analysointiin; käyttää online-työkalua SOPMA ennustamaan proteiinin sekundaarirakennetta; käyttää online-analyysiohjelmistoa SWISS-MODEL ennustaaksesi proteiinin tertiaarista rakennetta; käytä online-ohjelmistoa TMHMM Ennusta proteiinin transmembraanirakenne; käytä DNAMAN-ohjelmistoa vertaamaan CtCHS:n homologiaa muiden lajien CHS-aminohapposekvensseihin; käytä MEGA-X-ohjelmistoa fylogeneettisen puun rakentamiseen naapuriliitoksen (NJ) ja Poisson-korjauksen avulla. Evoluutioetäisyys lasketaan Bootstrap-menetelmällä ja Bootstrap-toistojen määrä on 1000 kertaa.

Lisähavainnointiin käytettiin UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS:ää. Nestefaasiolosuhteet olivat Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 -kolonni (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonnin lämpötila 40 astetta, naringeniini , kalkoni ja naringeniini. Kontrolliaineen lataustilavuus on 4 μL ja entsyymireaktiotuotteen lataustilavuus on 7 μL. Liikkuvana faasina käytetään vettä (A)-asetonitriiliä (B). Eluointigradientti on: 0 - 5 min, 30 % B; 5-15 min. 30 % - 60 % B; 15-20 min, 60-100 % B; 20-25 min, 100 % B; 25-31 min, 100-30 % B. Tilavuusvirtausnopeus on 0,3 ml/min. Massaspektrometrian olosuhteet ovat sähkösumutusionilähde, typpi kantokaasuna, vaippakaasun paine 3,5 MPa, apukaasun paine 1,0 MPa, ruiskutuspaine 3500 V, kapillaarilämpötila 350 astetta, apukaasun kuumennuslämpötila 200 astetta, positiiviset ja negatiiviset ionit, skannaus ionialueen m/z on 100-1500, täysi MS-resoluutio on 35 000, dd-MS2-resoluutio on 17 500, (N)

CE/porrastettu nce asetettu arvoon 35, 60.

2.6 CtCHS-proteiinin subsellulaarinen sijainti

CtCHS-sekvenssin ja saumattoman kloonauksen periaatteen perusteella suunniteltiin alukkeet, joissa oli entsyymileikkauskohdat KpnⅠ ja BamHⅠ, ja vastaavat kohdefragmentit monistettiin PCR:llä. pCAMBIA1300-35S-GFP-plasmidi digestoitiin restriktioendonukleaaseilla Kpn Ⅰ ja BamH Ⅰ, ja kohdefragmentti ja vektori yhdistettiin saumattoman kloonauspakkauksen (Novizan, Cat C115-01) kautta ja siirrettiin sitten E. coli DH5 -kompetensseihin soluihin. , valitse yksittäiset kloonikannat sekvensointia varten ja uutta plasmidit oikeista kannoista. Plasmidit pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS ja pCAMBIA 1300-35S-GFP transformoitiin Arabidopsis thaliana -protoplasteiksi käyttäen PEG4000:aa ja viljeltiin heikossa valossa 8-10 tuntia. CtCHS-proteiinin subsellulaarinen lokalisaatio havaittiin laserkonfokaalimikroskoopilla.

2.7 CtCHS-ilmentymiskuvion analyysi

CtCHS-sekvenssiin perustuen DNAMAN:ia käytettiin reaaliaikaisten fluoresenssin kvantitatiivisten alukkeiden suunnitteluun F-boxin sisäisenä vertailugeeninä. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa 1. CtCHS:n suhteellinen ilmentyminen erivärisissä Cistanche deserticola -kukissa havaittiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella fluoresenssi-PCR:llä. Käytä TransStart Green qPCR SuperMixiä (täyskulta, AQ101-02) mittaamaan SYBR Greenin fluoresoivalla väriainemenetelmällä, reaktiojärjestelmä: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, alku- ja loppualukkeet (10)

μmol/L) {{0}},2 μL kutakin, cDNA-templaatti 0,5 μL, nukleotidaasiton vesi 4,1 μL, reaktiossa käytettiin kaksivaiheista menetelmää ja reaktiomenetelmä perustui menetelmään Dong Xianjuan et ai. [18]. Jokainen näyte sisälsi 3 biologista toistoa, ja koe toistettiin kolme kertaa. Kokeelliset tiedot analysoitiin Excelillä 2:een

CtCHS:n suhteellinen ilmentyminen laskettiin käyttämällä −ΔΔCt-menetelmää, ja GraphPad Prism 8:aa käytettiin merkitsevyysanalyysiin ja histogrammien piirtämiseen.