Selkeä munuaisen kuvantaminen ja kvantifiointi 3D-muodossa

edmund.chen@wecistanche.com

Vuosikymmeniä mittauksetmunuainen2-ulotteisia leikkeitä käyttävä mikroanatomia on antanut meille yksityiskohtaista tietoa munuainen morfologia fysiologisissa ja patologisissa olosuhteissa. Kudosten puhdistusmenetelmien nopea kehitys viime vuosina sekä uusien 3-ulotteisten kuvantamismenetelmien kehitys ovat kuitenkin antaneet uusia näkemyksiämunuainenrakenne ja toiminta. Tässä katsausartikkelissa kuvataan useita uusia oivalluksiamunuainenäskettäin näitä uusia metodologisia lähestymistapoja käyttämällä. Esimerkiksi kehitystyössämunuainennämä lähestymistavat ovat tarjonneet uusia käsityksiä virtsan haaroittumismorfogeneesistä, nefronien esisolujen lisääntymisestä ja sitoutumisesta, virtsan kärkisolujen ja nefronin progenitorisolujen välisistä vuorovaikutuksista ja nefronien segmentaation muodostamisesta. Kokonaisessa aikuisessa hiiressämunuaisetKudosten puhdistaminen yhdistettynä valolevymikroskopiaan voi kuvata ja kvantifioida glomerulusten kokonaismäärän, mikä on suuri läpimurto alalla. Samankaltaiset lähestymistavat ovat antaneet uusia näkemyksiä munuaisten verisuonten rakenteesta ja hermotuksesta, tubulointerstitiaalisesta uudelleenmuodostumisesta, podosyyttien katoamisesta ja hypertrofiasta, kystojen muodostumisesta, solukuun puolikuun kehittymisestä ja glomerulusten suodatusesteen rakenteesta. Paljon enemmän edistystä ymmärryksessämunuainenbiologiaa ja patologiaa voidaan odottaa, kun yhä useammat tutkijat kehittävät ja ottavat käyttöön lisäpuhdistus- ja kuvantamistekniikoita.

Avainsanat:3D-kuvaus; glomerulus; munuaisten kehitys; nefropatologia; kudosten puhdistaminen; tubulukset; munuaisten

CISTANCHE PARANTAA MUUNAISTEN/MUUNAISTEN TOIMINTAA

Nefronien kokonaismäärä jokaisessa normaalissa ihmisessämunuainenvaihtelee noin 200,000 yli 2 miljoonaan, 1 keskimäärin noin miljoona. Nämä nefronit sekä muut nefronitmunuainenmukaan lukien keräyskanavat, verisuonet, interstitiat ja hermosäikeet on järjestetty erinomaisella mikroanatomisella tarkkuudella. 2 Tämä tarkka kuviointi tukee normaaliamunuaisten toimintaja terveys, joka voi häiriintyä vakavasti, kun kudosrakenne muuttuu glomerulaarisen tai tubulaarisen hypertrofian tai kutistumisen, nefronien katoamisen, synnynnäisten poikkeavuuksien, verisuonten harventumisen ja interstitiaalisen fibroosin vuoksi. Useat kuvantamismenetelmät ovat auttaneet ymmärtämään kattavastimunuainenmikroanatomia kehityksen aikana sekä terveellä ja sairaalla aikuisellamunuainen. Suurimmaksi osaksi tämä ymmärrys on peräisin 2-ulotteisten (2D) osien analysoinnista riippumatta siitä, ovatko ne valo- tai elektronimikroskooppisia fyysisiä leikkeitä tai konfokaalisia optisia leikkeitä. Tämän mikroanatomian kvantifiointi on enimmäkseen riippunut leikkeiden stereologisista analyyseistä, jotka ovat antaneet arvioita glomerulusten, tubulusten, verisuonten, interstitioiden ja niiden solukomponenttien lukumäärästä, pituudesta, pinta-alasta ja tilavuudesta. 3,4 Viime aikoihin asti 3D-visualisointimunuainenmikrorakenne rajoittui suurelta osin konfokaaliseen mikroskopiaan, joka mahdollistaa optisen leikkaamisen ja 3D-rekonstruoinnin 50-80 m:n syvyyteen asti. Valitettavasti kudoksessa olevien proteiini- ja lipidikomponenttien taittoominaisuudet sirottavat valoa ja heikentävät kuvanlaatua dramaattisesti syvyyden kasvaessa. Viime vuosina on kehitetty joukko puhdistusmenetelmiä kudoksen lipidi- ja pigmenttipitoisuuden poistamiseksi ja kudoksen ja kiinnitysvälineiden taiteominaisuuksien yhteensovittamiseksi kudoksen tekemiseksi läpinäkyväksi. 5 Puhdistusmenetelmät vaihtelevat monimutkaisesti kudoksen inkuboinnista eri liuoksissa tuntien ajan pitkiin toimenpiteisiin, joissa käytetään mukautettuja sähkökemiallisia laitteita. Ohjaamme lukijat viimeaikaisiin katsauksiin 5,6 saadaksesi yksityiskohtaisen yleiskatsauksen nykyisistä menetelmistä ja tässä lainattuihin julkaisuihin erityisistä menetelmistä ja käyttötapauksista.

Subsellulaariset rakenteet ja kokonaiset solupopulaatiot voidaan erottaa puhdistetuista kokonaisista elimistä tai paksuista osista. Tarkat kuvantamisominaisuudet puhdistetussa kudoksessa vaativat erikoismikroskooppeja ja kuvankäsittelyä tilavuustietojen keräämiseksi ja rekonstruoimiseksi näytteistä, joiden koko voi vaihdella sadoista mikroneista senttimetreihin. Pistepyyhkäisy- ja pyörivä levykonfokaalimikroskoopit on käytetty tehokkaasti kuvaamaan piirteitä tyhjennettynämunuainenkudoksissa, mutta kärsivät heikentyneestä resoluutiosta Z-akselilla ja fluoresenssin intensiteetin asteittaisesta vähenemisestä syvyydessä yhden valaistuksen ja kuvantamisen akselin vuoksi. Valolevymikroskopiatekniikat sopivat erityisen hyvin puhdistettujen kudosten kuvantamiseen, koska ne mahdollistavat suurten 3D-volyymien nopean hankinnan ja voivat sisältää monikulmavalaistuksen ja -kuvauksen. Optinen projektiotomografia on toinen lähestymistapa, joka sisältää monikulmakuvauksen ja digitaalisen rekonstruoinnin datan tuottamiseksi, jossa kunkin vokselin X-, Y- ja Z-akselit ovat samat. Erityisestä lähestymistavasta huolimatta kudosten puhdistaminen ja koko mount -kuvaus tarjoavat uuden mahdollisuuden tutkia tuntemattomia solujen mikroympäristöjä ja korkeamman asteen kudosrakennetta. Tässä katsauksessa korostamme joitain uusia oivalluksiamunuainenkehitys, aikuinenmunuainenrakenne ja patologia, joka on seurausta kudosten puhdistuksesta, jota seurasi 3D-kvantitatiivinen analyysi.

Uusia näkemyksiä munuaisten kehityksestäVuosikymmeniä kestäneet geeniekspression profilointi- ja poistotutkimukset ovat johtaneet yksityiskohtaiseen ymmärrykseen solutyypeistä, geenien säätelyverkostoista ja signalointireiteistä, jotka ohjaavat nisäkkäitämunuainenkehitystä. Tämä tieto antoi tietoa synnynnäisten sairauksien diagnosoinnista ja mahdollisti niiden tuotannonmunuainensolutyyppejä pluripotenteista kantasoluista. 7 Kehityksen koko, läpinäkyvyys ja monimutkaisuusmunuainenmuodosti merkittävän esteen tämän elimen morfogeneesin ja solujen ja proteiinien 3D-jakauman tarkalle mittaamiselle. Kudospuhdistuksen ja monimuotokuvauksen soveltaminenmunuainenon mahdollistanut virtsan haaroittumisen morfogeneesin, esisolupopulaatioiden ja ehjien elinten nefronivarannon visualisoinnin ja kvantitatiivisen analyysin (kuva 1). 8 Nämä lähestymistavat tukevat uutta kykyä tarkkaan fenotyypitykseen ja avoimia tapoja analysoida solujen ja molekyylien tekijöitä.munuainenkehitys ja synnynnäinen sairaus.

Haaroittumismorfogeneesin kuvaaminen ja analysointi 3D:ssä.Virtsanjohdinpuun muodostuminen on määrittävä piirremunuainenkehitystä ja sitä on tutkittu laajasti käyttämällä hiiren genetiikkaa ja litistettymunuaineneksplantoida kulttuureja. Kuitenkin sen ymmärtäminen, kuinka yksittäiset geenit myötävaikuttavat tämän haarautuneen epiteelikanavarakenteen kasvuun, muotoon ja kuviointiin in vivo, vaati kykyä kuvata ja analysoida tätä monimutkaista verkkoa useissa eri näytekokoissa. Short et ai. 8 käsitteli näitä ongelmia käyttämällä koko mount immunofluoresenssia, liuotinpohjaista puhdistusta (bentsyylialkoholibentsyylibentsoaatti) ja kuvaamalla kokonaisia ​​elimiä optisella projektiotomografialla. Tämän lähestymistavan käyttäminen 3D-kuvien tallentamiseen varhaisesta puoliväliinmunuainenKehityksen aikana tiimi kehitti mukautetun analyysiohjelmiston saadakseen ennennäkemättömän yksityiskohtaista tietoa virtsanjohtimen puusta, mukaan lukien kärjen lukumäärä, oksien kulmat ja pituus, oksien tilavuudet ja ehjien virtsanpuiden haarautumissukupolvien lukumäärä (kuvat 1c ja d). 8 Käytettiin alun perin karakterisoimaan ja tunnistamaan munuaisten haarautumiseen liittyviä uusia näkökohtia, 910 meneillään olevalla ponnistelulla pyritään määrittelemään periaatteet ja keskeiset säätelytekijät, jotka säätelevät haarojen muodostumista in vivo. 1

Progenitoridynamiikan yhdistäminen elinten morfogeneesiin monimittakaavaisella kuvantamisella.Virtsaputken kärkisolujen ja nefronien progenitorisolujen välisillä molekyylivuorovaikutuksilla on tärkeä rooli nefronien komplementin muodostamisessa, mikä helpottaamunuaisten toimintaaikuisten elämässä. Indusoimattomat nefronien progenitorit tuottavat tekijöitä, jotka edistävätmunuainenkasvu virtsan haaroittumisen kautta, kun taas virtsanjohtimen kärjessä olevat spatiaalisesti rajoitetut vihjeet sekä ylläpitävät nefronin progenitoritilan että indusoivat näiden progenitorien alajoukon erilaistumaan varhaiseksi nefroniksi. Nämä vuorovaikutukset ohjaavat haaroittumis- ja nefroni-induktiosykliä, joka loppuu syntymän aikoihin, kun jäljellä olevat nefronien kantasolut erilaistuvat. Ennen kudosten puhdistusmenetelmiä ymmärryksemme dynamiikastamunuainenmorfogeneesi ja progenitorisolupopulaatioiden suhteellinen runsaus ajan mittaan oli vakavasti rajoitettu. Tämä muuttui, kun kehitettiin monimittaisia ​​kuvantamismenetelmiä, joissa hyödynnettiin laajennettuja immunofluoresenssiprotokollia, kudosten puhdistusta ja kuvantamismenetelmiä kvantifiointiin.munuainenkehitys solun (konfokaalinen) ja koko elimen tasolla (optinen projektiotomografia, valolevy). 9,10 Kävi ilmi, että hinnatmunuainenkasvu vaihtelee dramaattisesti alun perin nopeiden haarautumis- ja lisääntymisnopeuksien kanssa, jotka laskevat vaiheissa, jotka korreloivat progenitorisolujen lukumäärän vähenemisen kanssa nefrogeenisessä markkinaraossa. 10 Kolmiulotteinen konfokaalinen kuvantaminen kokonaisesta ihmissikiöstämunuaiset(viikko 11) tai näytteitämunuainencortex (viikot 11–23) vahvistavat, että tämä markkinaraon koon pieneneminen säilyy kaikissa lajeissa. 12 Ihmisen ja hiiren nefrogeenisen markkinaraon vertaileva lisäanalyysi puhdistetussa kudoksessa johti uuteen aikaan perustuvaan nefronien muodostumisen rekrytointimalliin, jossa esisoluja lisätään asteittain varhaiseen nefroniin ja ne ottavat segmentin identiteetin saapumisjärjestyksen mukaan. . 13 Toisessa tutkimuksessa, joka keskittyi nefronien progenitorisitoutumiseen, käytettiin hydrogeeliin perustuvaa kudosten puhdistusmenetelmää (passiivinen Clear Lipid-changed Acryl-amid-hybridized Rigid Imaging/Immuno-värjäys/In situ -hybridisaatioon yhteensopiva Tissue-HYdrogel [CLARITY] 14). kyky säilyttää endogeenisen tdTomato-reportterin fluoresenssi. TdTomato-leimauksen analyysi puhdistetussa kudoksessa osoitti, että solut varhaisessa sitoutuneessa nefronissa voivat palata progenitoritilaan, jossa aikaisemmat tulokset viittaavat siihen, että sitoutuminen oli yksisuuntaista. 15 Siten kudosten puhdistaminen on parantanut ymmärrystämme dynaamisista kehitysprosesseista asteikkojen ja lajien välillä.

Tarkka fenotyyppi. Edistys kudosten puhdistamisessa ja kvantitatiivisessa analyysissä on mahdollistanut uuden kapasiteetin tarkkuusfenotyypitykseen. Tilastollisesti voimakkaita muutoksia haarautumisessa ja nefronien lukumäärässä on tunnistettu hiirimalleissa, joissa on hienovaraisia ​​fenotyyppejä, kuten Ret þ/? ja Six2 þ/? hiiret (kuvio 2), jotka aiemmin luokiteltiin "normaaleiksi". 10,16 Korkearesoluutioinen konfokaalinen kuvantaminen tyhjennetystä Wnt11 ?/?munuaisettunnisti uuden solufenotyypin, jossa nefronien progenitorit näyttävät epäorganisoituneilta johtuen kyvyttömyydestä muodostaa stabiileja solukiinnittymiä virtsanjohtimen kärjen kanssa ja erilaistua ennenaikaisesti. 17 Näitä menetelmiä on myös käytetty kvantifioimaan, kuinka uudet nefronin esisolun tilan säätelijät, kuten DNA-metyylitransferaasi 1, mikroRNA:t Lin28 ja Let7 sekä TSC1, vaikuttavat.munuainenkehitystä ja nefronien lukumäärää. 18–20 Tarkasta fenotyypitystä tulee todennäköisesti tärkeä työkalu pyrittäessämme ymmärtämään geneettisten ja ympäristötekijöiden additiivista vaikutusta, jotka vaikuttavat alhaiseen nefronien määrään ja alttiuteen kroonisille.munuaissairaus.

Matemaattinen mallinnusmunuainenmorfogeneesi. Tiedot tuotetaan tyhjennetystä kehitystyöstämunuainenruokkivat kuvapohjaisen matemaattisen mallinnuksen aaltoa, joka yrittää havaita, kuinka kudoksen makroskooppinen muoto ja toiminta syntyvät kantasolupopulaatioiden välisistä molekyylivuorovaikutuksista. 11,21–23 Kokoelimen kuvantamisen lisääminen puhdistettuun kudokseen on ratkaisevan tärkeää 3D-kudoskuvioinnin molekyyli- ja solutekijöiden ymmärtämiseksi, ja se voi olla avainasemassa kudosten kantasolumallien rakenteen ja tarkkuuden parantamisessa.munuainen.

Aikuisen munuaisen 3D-morfologia ja patologiaAikuisen monimutkainen morfologiamunuainenrajoittaa 2D-morfologisten työkalujen käyttöä, koska ne voivat välittää epätäydellisiä tai harhaanjohtavia käsityksiä 3D-rakenteesta. Täällä keskustelemme joistakin viime vuosien tärkeistä metodologisista edistysaskeleista, jotka mahdollistavat nyt aikuisen rakenteiden vankan 3D-analyysin.munuainen, aina ehjästämunuaisetaina glomerulussuodatusesteen komponentteihin saakka (kuva 3). 2

CISTANCHE PARANTAA MUNUAISTEN/MUUNUNAISTEN VAATTOA

Nefronien lukumäärä ja koko.Ihminenmunuainenosoittaa suurta sisäistä ja yksilöiden välistä vaihtelua nefronien lukumäärässä ja tilavuudessa, mikä on kuvattu ruumiinavaustutkimuksissa henkilöiltä, ​​joilla ei ole selväämunuaisten sairaudet1,30,31 ja se on yhdistetty kehityshäiriöihin. Vuosikymmenien ajan kultainen standardi työkalu nefronien määrän määrittämiseen kokeellisissa ja ihmisnäytteissä on ollut disektori/fraktiointimenetelmä, suunnittelupohjainen stereologinen menetelmä. 3,4 Vaikka tämä lähestymistapa on tarkka ja tarkka, se on myös käytännönläheistä, aikaa vievää ja vaatii huomattavaa koulutusta. Tästä syystä on ehdotettu vaihtoehtoisia lähestymistapoja tehokkaiden menetelmien kehittämiseksi, jotka voivat tarjota korkealaatuisia päätepisteitä: 32 esimerkiksi optisten puhdistusmenetelmien yhdistelmät, mukaan lukien hydrofobiset (aiemmin liuotinpohjaiset), hydrofiiliset tai hydrogeelipohjaiset ja kehittyneet valomikroskopia (esim. konfokaalinen, monifotoni tai valolevy).

Tietojemme mukaan ensimmäinen raportti, jossa yhdistettiin optinen kirkastus ja valolevymikroskopia nefronien lukumäärän ja koon analysoimiseksi, julkaisivat Klingberg et ai. 24 maamerkkipaperissa, jossa oli useita tärkeitä edistysaskeleita. Ensinnäkin tässä raportissa esiteltiin etyylisinnamaatti, vaaraton liuotin, joka voisi korvata myrkyllisiä kemikaaleja, kuten bentsyylialkoholi-bentsyylibentsoaattia, jota siihen asti käytettiin säännöllisesti hydrofobisissa puhdistusprotokollassa. Toiseksi tutkijat suorittivat nefronilaskennan ehjällä hiirellämunuaiset in aggressiivinen ja progressiivinen immuunivälitteisen mallinmunuaissairaus, tunnistaa nefronien katoamisen taudin kulun aikana. Lisäksi otettiin käyttöön merkittäviä askeleita kohti kuvien segmentointialgoritmien tietokoneistettua automatisointia, mikä tarjosi polun merkittäviin tehokkuuden parannuksiin. Äskettäin Østergaard et ai. 25 esitteli samanlaisen hydrofobisen puhdistusmenetelmän yhdistettynä valolevymikroskopiaan ja automaattiseen kuvan segmentointiin, joka tarjoaa sekä kokonaisnefronien lukumäärän että yksittäisen glomerulaarisen tilavuuden diabeettisen nefropatian hiirimallissa. Lisäksi tämä tutkimus osoitti proksimaalisten tubulusten tyylikkään toiminnallisen leimauksen in vivo albumiini-injektion avulla glomerulusten tubulusliitoksen visualisoimiseksi ja yksinkertaisen protokollan korrelatiiviselle histopatologialle samoissa optisesti puhdistetuissa näytteissä. Tämä raportti osoittaa näiden protokollien joustavuuden, ja niistä on tulossa monikerroksisia putkia kattavaan kudosprofilointiin.

Munuaisten verisuoni ja hermotus.Haaroittuneiden verisuonten tai hermosäikeiden jälkiä aikuisellamunuainenon lähes mahdotonta 2D perinteisessä histologiassa, koska elimen koko ja rakenteellisen jakauman monimutkaisuus edellyttävät laajaa ja asiantuntevaa sarjaleikkausta. Äskettäin Huang et ai. 33 raportoi kationisesta lähi-infrapunafluoresoivasta väriaineesta (MHI148-PEI) erityisesti verisuonten leimaamiseksi, joka voidaan yhdistää muunneltuun ja nopeutettuun etyylisinnamaattiin perustuvaan puhdistusprotokollaan kudoksen käsittelyajan lyhentämiseksi. Tämä lähestymistapa avaa uusia mahdollisuuksia verisuonitutkimuksellemunuainen,varsinkin kun tarvitaan korkearesoluutioista 3D-kuvausta. Samoin Hasegawa et ai. 26 käytti Clear Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails ja Computational Analyys (CUBIC) sekä räätälöidyn valolevymikroskopiajärjestelmän sympaattisen hermotuksen jakautumisen tunnistamiseksi ehjässä hiiren munuaisessa. Sympaattiset hermot jakautuivat pääasiassa valtimoiden ympärille. 10 päivän iskemian tai reperfuusiovaurion jälkeen sympaattisen hermotuksen tiheys väheni merkittävästi, mikä korreloi alentuneiden norepinefriinitasojen kanssamunuaiskudosta. Nämä muutokset säilyivät osittain 28 päivää alkuperäisen vamman jälkeen, mikä viittaa siihen, että jatkuvia sympaattisia muutoksia voi löytyä kroonisen taudin etenemisen aikana.munuaissairaus.

Tubulointerstitiaalinen remodeling.Munuaisten tubulusjärjestelmää on erityisen vaikea analysoida 3D:ssä. Mutkainen ja monimutkainen morfologia asettaa useita haasteita perinteisille menetelmille, jotka perustuvat sarjaleikkaukseen ja standardivalomikroskopiaan. Optinen tyhjennys mahdollistaa kuitenkin ehjien tubulusten ja niitä ympäröivän mikroympäristön analysoinnin. Saritas et ai. 34 suoritti hydrogeelipohjaisen ja hydrofobisen optisen puhdistuksen yhdistelmän, jota seurasi edistynyt valomikroskopia ja puoliautomaattinen 3D-analyysi luonnehtiakseen ravinnon kaliumpuutosta johtuvaa distaalista putkien uudelleenmuotoilua. Tutkijat määrittelivät tubulaarisen hyperplasian ja havaitsivat lisääntymisen lisääntyvien solujen määrässä tubulointerstitiumissa. Tässä tutkimuksessa hyödynnettiin sekä optisen selvityksen monipuolisuutta että

Kuva 3| Kolmiulotteinen (3D) morfometria aikuisen munuaisessa. (a) Nefronien laskeminen kokonaisissa munuaisissa käyttämällä endoteelisolujen CD31-leimausta. Paneelissa näkyy 3D-rekonstruktio (vasemmalla), optinen leikkaus kaksiulotteisessa (2D) näkymässä (keskellä) ja erityisalueet, joissa näkyy yksittäisiä glomeruluksia valolevymikroskopian (LSFM) ja konfokaalisen ja 2- fotoni (2P) mikroskopia. Mukautettu American Society of Nephrologyn luvalla, julkaisusta Journal of the American Society of Nephrology, Fully Automated Evaluation of Total Glomerula Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys using Lightsheet Microscopy, Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I, et al. ., osa 28, numero 2, 2017; Copyright Clearance Center, Inc.:n kautta toimitettu lupa 24 (b) Kerästen koon määrittäminen spatiaalisen rekisteröinnin avulla – värikoodaus edustaa glomerulusten kokoa, jossa punainen on suurin esine ja vaaleanpunainen pienin. Mukautettu American Society of Nephrologyn luvalla, julkaisusta Kidney360, Automated Image Analyzes of Glomerulaar Hypertrophy in a Mouse Model of Diabetic Nephropathy, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL, et ai., osa 6, numero 6 , 2020; Copyright Clearance Center, Inc.:n kautta toimitettu lupa 25 (c) Verisuonten ja hermotuksen seuranta, jossa on koskemattoman munuaisen 3D-rekonstruktio sympaattisten hermojen (vihreä), verisuonten (magenta) ja yhdistettyjen (vasemmalla) immunomerkinnällä. Muokattu julkaisusta Kidney International, osa 96, numero 1, Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T, et ai., Comprehensive kolmiulotteinen analyysi (CUBIC-kidney) visualisoi epänormaalit munuaisten sympaattiset hermot iskemian/reperfuusiovaurion jälkeen, sivut 129–138, Tekijänoikeus ª 2019 International Society of Nephrologyn luvalla. 26 (d) Podosyyttimorfometria yksittäisissä glomeruluissa käyttämällä immunoleimausta podosyyttispesifiselle markkerille p57 (vihreä) ja DNA-markkerille 4 0,6-diamidino-2-fenyyli-indoli (DAPI). Paneeleissa näkyy (vasemmalla) 3D-rekonstruktio ja (oikealla) renderoidut pinnat. Mukautettu American Society of Nephrologyn luvalla, julkaisusta Journal of the American Society of Nephrology, Validation of a Kolmiulotteinen menetelmä podosyyttien laskemiseksi ja koon määrittämiseksi koko glumerulissa, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al., osa 27, numero 10, 2016; lupa välitetty Copyright Clearance Center, Inc.:n kautta. 27 (e) Soludynamiikka käyttämällä sukulinjan jäljitystä, jossa näkyvät podosyytit (äärivasemmalla), parietaaliepiteelisolut (PEC:t), jotka muodostavat solukuulia 3D-muodossa (keskellä vasen), 2D-näkymä tunkeutuvista PEC-soluista glomerulaarinen puoli verisuonivaurioineen (keskellä oikealla) ja 2D-visualisointi putkimaisesta ulostulosta (äärioikealla). Mukautettu julkaisusta Kidney International, osa 96, numero 2, Puelles VG, Fleck D, Ortz L, et ai., Uusi 3D-analyysi optista kudospuhdistusta käyttäen dokumentoi hiiren nopeasti etenevän glomerulonefriitin kehitystä, sivut 505–516, Copyright ª 2019, International Society of Nephrology, CC BY-NC-ND -lisenssillä (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (f) Hakatun kalvon visualisointi kasvavilla suurennoksilla vasemmalta oikealle. Muokattu julkaisusta Kidney International, osa 99, numero 4, Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M, et ai., Nopea ja yksinkertainen puhdistus- ja turpoamisprotokolla munuaisen 3D-in situ -kuvaukseen asteikkojen yli, sivut 1010–1020 , Tekijänoikeus ª 2021, International Society of Nephrology, CC BY-NC-ND -lisenssillä (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 Optimoidaksesi tämän kuvan katselun, katso tämän artikkelin online-versio osoitteessawww.kidney-international.org.

valomikroskopia putkimaisen analyysin tekemiseen ehyissä munuaisissa käyttämällä hydrogeeli-upotusta ja valolevymikroskopiaa sekä yksisoluinen kvantifiointi munuaisviipaleissa käyttämällä hydrofobista selkeyttä ja konfokaalista mikroskopiaa, koska jokainen yhdistelmä sopi paremmin tiettyyn tutkimuskysymykseen. Tahaei et ai. käyttivät optisen puhdistuksen ja edistyneen valomikroskopian yhdistelmiä. 35, joka luonnehti seksuaalista dimorfismia distaalisen kierteisen tubuluksen pituudessa, mikä saattaa määrittää sen kyvyn sopeutua fysiologiseen stressiin, ja Schuh et ai. 36, joka paljasti aksiaaliset erot proksimaalisen tubuluksen ligandin sisäänoton ja endolysosomaalisen toiminnan välillä, korostaen, että S1-segmentti on erittäin erikoistunut proteiinien imeytymiseen reseptorivälitteisen endosytoosin kautta. Tuoreessa tutkimuksessa Blanc et ai. 2 analysoi kystojen muodostumismallia, joka osoitti, että kystat kehittyivät vain spesifisiin nefronisegmentteihin, jotka määrittelivät niiden muodon ja sijaitsivat vierekkäin normaaleihin laajentumattomiin tubuluksiin. Kaiken kaikkiaan meillä on nyt useita esimerkkejä optisen puhdistuksen suorasta soveltamisesta tubulointerstitiaalisen osaston systemaattiseen analysointiin.

Podosyyttien menetys ja hypertrofia.Keräs on ainutlaatuinen esimerkki elimen ehjien toiminnallisten yksiköiden analysoinnista. Erityisesti podosyyttien ehtymisen tutkimus on hyötynyt suoraan näistä teknologisista edistysaskeleista, koska kultastandardin suunnitteluun perustuvat menetelmät vaativat merkittäviä aika- ja resursseja. 37 Ensimmäinen työkalu koskemattomien hiiren glomerulusten 3D-podosyyttimorfometriseen analyysiin yhdistettyyn immunoleimaukseenmunuainenviipaleita käyttäen modifioitua epäsuoran immunofluoresenssin, hydrofobisen optisen puhdistuksen ja konfokaalimikroskopian protokollaa, mikä helpotti podosyyttien kokonaismäärän kvantifiointia kokonaisissa yksittäisissä glomerulusissa, joiden tilavuus tunnetaan. Uskomme, että tämä lähestymistapa on ihanteellinen sellaisten prosessien tutkimiseen, jotka vaikuttavat tiettyyn rakenteiden alaryhmään (esim. podosyyttien menetys, joka johtaa fokaaliseen ja segmentaaliseen glomeruloskleroosiin). 27 Samaa tekniikkaa käytettiin myöhemmin karakterisoimaan podosyyttien hypertrofian roolia kompensoivana vasteena podosyyttien häviämisen jälkeen, mekanismia, jota välittää rapamysiinin signaalireitin nisäkäskohde. 38 Vaikka nämä kaksi tutkimusta keskittyivät glomerulaaristen podosyyttien analyysiin, tätä tavanomaiseen immunoleimaukseen perustuvaa putkilinjaa voidaan käyttää minkä tahansa solutyypin morfologisten muutosten karakterisoimiseen suurella spatiaalisella resoluutiolla.

Solupuolisten puolikuuten kehitys.Toinen tärkeä työkalu, joka piti integroida onnistuneesti 3D-työkalupakettiinmunuainenmorfometria on geneettisen linjan jäljitys. Useimmilla optisilla puhdistusmenetelmillä on taipumus saada aikaan tietty fluoresenssin sammutus (joka vaihtelee lievästä vakavaan). 6 Esitimme äskettäin protokollan, joka yhdistää sukulinjan jäljityksen, optisen selvityksen ja monifotonimikroskoopin podosyyttien häviämisen ja parietaaliepiteelisolujen aktivoitumisen kattavaan analyysiin. 28 Tässä tutkimuksessa podosyyttien häviäminen tunnistettiin kokeellisen puolikuun nefriitin piirteeksi käyttämällä podosyyttien metabolista leimaamista tehostetulla vihreällä fluoresoivalla proteiinilla. Solukuunsirppien evoluutio visualisoitiin ja kvantifioitiin parietaaliepiteelisolujen proliferaation ja vaeltamisen perusteella, joille oli myös tunnusomaista lisääntynyt vihreä fluoresoiva proteiini ja joita seurattiin puolikuun nefriitin kokeellisen mallin aikana. Intaktien glomerulusten analyysi mahdollisti fokaalisen podosyyttihäviön ja leesioiden muodostumisen tunnistamisen, mikä eteni tubulustukkeumiksi parietaaliepiteelisolujen toimesta, mikä johti tubulaaristen glomerulusten muodostumiseen. Tämä tutkimus tasoittaa tietä tuleville tutkimuksille monimutkaisista immuuni-epiteelin vuorovaikutuksista ehjänämunuaiset.

CISTANCHE PARANTAA MUNUAIS-/MUUNAISDIALYYSIÄ

Glomerulaarisen suodatuksen este.Tärkeä diagnostinen työkalu glomerulaaristen sairauksien rutiininomaiseen arviointiin on munuaisbiopsioiden ultrarakenneanalyysi elektronimikroskopialla. Vaihtoehto elektronimikroskopialle löytyy ekspansiomikroskoopin alalta, joka määritelmän mukaan pyrkii lisäämään optista resoluutiota lisäämällä kudosmittoja. Vuosien mittaan Unnersjo-Jess et ai. 39,40 on toimittanut useita protokollia nanomittakaavan rakenteiden visualisointiinmunuainen.Äskettäin nämä tutkijat raportoivat nopeasta ja yksinkertaisesta menettelystä 3D-visualisoimiseksimunuainenmorfologia, jossa yhdistyvät optisen puhdistuksen ja kudoksen laajentamisen käsitteet nanomittakaavan rakenteiden ratkaisemiseksi käyttämällä tavanomaista konfokaalimikroskopiaa. 29 Tätä protokollaa sovellettiin useiden patologisten piirteiden visualisointiin ja kvantifiointiin hiirellä ja ihmisellämunuainenbiopsiat, mukaan lukien jalkaprosessin häviäminen, glomerulaarisen tyvikalvon muutokset, rakokalvon pituus, IgG-kertymät ja klassiset patologiset ominaisuudet (esim. glomeruloskleroosi, tubulointerstitiaalinen fibroosi ja tubulaarinen atrofia). Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä menetelmä mahdollistaa munuaispatologian monimittaisen visualisoinnin ja kvantifioinnin käyttämällä yksinkertaista menetelmää ja käytettävissä olevia kuva-analyysityökaluja. Tämän lähestymistavan skaalautuvuus ja käyttöönotto kliinisessä käytännössä määräytyy todennäköisesti kehittyneiden valomikroskopialaitteiden ja automaattisten kuva-analyysityökalujen kehityksen perusteella.

Johtopäätös

Nykyinen kudosten puhdistusmenetelmien kirjo sisältää yksinkertaisia ​​tekniikoita, jotka voidaan toteuttaa useimmissa laboratorioissa parantamaan 3D-kuvausta yleisesti saatavilla olevilla mikroskoopeilla. Kun näiden uusien lähestymistapojen tarjoamat mahdollisuudet tulevat ilmeisiksi, odotamme erikoistuneiden mikroskopiajärjestelmien laajempaa käyttöönottoa, jotta voidaan kuvata tehokkaasti puhdistettua kudosta korkealla resoluutiolla, sekä räätälöityjen tutkimusten ja kliinisten työnkulkujen kehittämistä tiettyjen kysymysten käsittelemiseksi. Neurotieteen ala on toiminut testausalustana puhdistetuille kudoskuvantamismenetelmille ja -sovelluksille. Tässä yhteydessä on kehitetty automatisoitua kuva-analyysiä, uusia lähestymistapoja soluyhteyksien tutkimiseen sekä kudoslaajuisia geeni- ja proteiiniekspression atlasprojekteja. On todennäköistä, että samankaltaiset lähestymistavat antavat uusia näkemyksiä solujen anatomiasta ja solupopulaatioiden keskinäisestä riippuvuudesta kehittyvissä ja aikuisissamunuainen.

Käytännön rajoituksia näille edistyksille ovat kuvantamislaitteiston kustannukset ja vaikeudet suurten tietojoukkojen käsittelyssä, tallentamisessa ja analysoinnissa. Muut rajoitukset johtuvat värjäytymisen toistettavuuden puutteesta kudoksilla, joihin kiinnitysolosuhteet ja vasta-aineleimaus vaikuttavat vaihtelevasti. Tästä johtuen tarvitaan uusia 3D-analyysejä, joita arvioidaan kriittisesti ja verrataan vakiintuneisiin menetelmiin. Huolimatta vaikuttavasta edistymisestä arvioinnissamunuainenkehitystä ja aikuisuuttamunuainenTässä katsauksessa korostetun rakenteen ja sairauden vuoksi uskomme, että paras kudosten puhdistaminen ja 3D-kuvaus on vielä tulossa ja se on todennäköisesti jännittävä kasvualuemunuainentutkimusta tuleville vuosikymmenille.