Cistanche-Vaccariae-siemennesteen mekanismi kroonisen ei-bakteeriperäisen eturauhastulehduksen hoidossa rotilla verkkofarmakologiaan perustuen

 

Abstrakti

Tutkia yrttiparin Cistanche–Vaccariae Semen (Cistanche–VS) suojaavaa vaikutusta tulehdusvaurioon kroonisessa ei-bakteeriperäisessä eturauhastulehduksessa (CNP). Tässä tutkimuksessa seulottiin 41 vaikuttavaa ainetta ja 156 vastaavaa kohdeproteiinia TCMSP:n ja kirjallisuuden louhinnan avulla. OMIM- ja GeneCards-tietokantoja käytettiin tunnistamaan 9 848 sairauteen liittyvää CNP-kohdetta. Cytoscapea ja STRING:tä käytettiin proteiini-proteiini-vuorovaikutusverkoston (PPI) ja vaikuttavan aineen-sairauden kohde-reittiverkoston rakentamiseen. PPI-tulokset koskivat pääasiassa avainproteiineja, kuten interleukiini-6 (IL-6), tuumorinekroositekijä- (TNF-), interleukiini-1-beeta (IL-1), kasvainproteiini p53 (TP53) ja RAC-alfa-seriini/treoniini-proteiinikinaasi (AKT1). GO- ja KEGG-polun rikastusanalyysit suoritettiin käyttämällä Metascape-alustaa; rikastettuihin KEGG-reitteihin kuuluivat PI3K-AKT, lipidi- ja ateroskleroosi, eturauhassyöpä ja MAPK-signalointireitit. Molekyylitelakka suoritettiin aktiivisten komponenttien ja ydinkohteiden välillä. Yllä olevien tietojen tarkistamiseksi seerumipitoisuudet IL-1, interleukiini-18 (IL-18) ja TNF- mitattiin eläinkokeissa. Patologisia muutoksia eturauhaskudoksessa havaittiin H&E-värjäyksellä. Ydinkohdeproteiinit IL-6, TNF-, IL-1 ja reittiin liittyvät proteiinit havaittiin Western blot -menetelmällä. Eläinkokeet osoittivat, että tulehdustekijöiden säätely ja tulehdukseen liittyvien proteiinien ilmentyminen vaimenivat kussakin hoitoryhmässä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PI3K-AKT-signalointireitti voi olla osallisena CNP:n parantamisessa monikomponenttisten ja monikohdemekanismien kautta.

Avainsanat:verkko farmakologia; yrtti pari;krooninen ei-bakteerinen eturauhastulehdus; Cistanche; Vaccariae siemenneste; PI3K-AKT-signalointireitti

 

 

 

 

 

Cistanche-uutteen lisäravinteet krooniseen ei-bakteeriperäiseen eturauhastulehdukseen

Napsauta saadaksesi lisätietoja

 

Wecistanchen tukipalvelu - Lisätietoja yhteistyöstä
Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Johdanto

Krooninen ei-bakteerinen eturauhastulehdus (CNP)on urogenitaalinen häiriö, jota esiintyy yleisesti keski-ikäisillä miehillä. Kliinisesti sille on ominaista dysuria, virtsaamistiheys, kiireellisyys, kipu virtsatessa ja epätäydellisen virtsarakon tyhjenemisen tunne; vaikeissa tapauksissa se voi vaikuttaa mielenterveyteen, johon liittyy unettomuutta, eläviä unia, ahdistusta ja masennusta. Perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä (TCM) se vastaa luokkia, kuten "Jinglin", "Baizhuo", "Longbi" ja "Lin-zhuo". Vallitseva TCM-patogeneesi sisältää kostean lämmön ja pysähtyneen; Hoitoperiaatteet painottavat yleisesti lämmön poistamista, kosteuden poistamista, veren aktivoimista ja qin säätelyä. Perinteisiä länsimaisia ​​hoitoja ovat alfasalpaajat, antibiootit ja ei-steroidiset tulehduskipulääkkeet. Tällä hetkellä, koska patogeneesi on edelleen epäselvä, tehokkaat CNP-hoidot ovat rajallisia.

Yrttiparia Cistanche–Vaccariae Semen käytetään perinteisesti poistamaan kosteaa lämpöä alemmasta jiaosta, edistämään verenkiertoa ja säätelemään qi:tä. Cistanche siirtyy munuaisten ja virtsarakon kanaviin ja auttaa käsittelemään alhaisempaa jiao-kosteutta. Nykyaikaiset farmakologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Cistanchella on anti-inflammatorisia, antibakteerisia ja analgeettisia vaikutuksia; Cistanchen alkaloidin kaltaiset ja fenyylietanoli-aineosat on yhdistetty urogenitaaliseen tukeen, mukaan lukien mahdolliset eturauhasen terveydelle merkitykselliset hyödyt. Vaccariae Siemenneste kulkeutuu maksan ja munuaisten kanaviin edistäen verenkiertoa, sääteleen kuukautisia ja helpottaen diureesia turvotuksen ja kivun lievittämiseksi. Nykyaikainen farmakologia raportoi, että Vaccariae Semenin etanoliuutteilla on tulehdusta estäviä vaikutuksia, ja Vaccariae Semen -polysakkaridit voivat lieventää virtsatieinfektion aiheuttamaa virtsarakon vauriota.

Viime vuosina TCM-yrttipareja on käytetty laajalti reseptien yhteensopivuuden, tehokkuuden ja mekanismien tutkimiseen. Siksi tässä tutkimuksessa käytetään verkkofarmakologiaa ja eläinkokeita selvittääkseen ja validoidakseen kattavasti molekyylimekanismeja, joilla yrttipari Cistanche–Vaccariae Semen hoitaa CNP:tä. Tavoitteena on tarjota referenssi sen kliiniseen käyttöön ja kokeelliseen tutkimukseen sekä sen mahdolliseen muuntamiseen eturauhastulehdukseen kohdistetuiksi ravintolisiksi.

Materiaalit ja menetelmät

1.1 Reagenssit

 

Cistanche-rakeet (valmistaja: Shenwei Pharmaceutical Group Co., Ltd.; eränumero: 21082272)

Vaccariae Semen rakeet (Shenwei Pharmaceutical Group Co., Ltd.; eränro: 230515P2)

Karrageeni (Sigma, USA; eränumero: C1013-100G)

ELISA-sarjat IL-1:lle, IL-18:lle ja TNF-:lle (Sangon Biotech; eränumerot: D731007, D731079, D731168)

-aktiinivasta-aine (Wuhan Servicebio; eränumero: ZB15001-HRP-100)

Vasta-aineet: IL-6, TNF-, IL-1, fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasi (PI3K), fosforyloitu PI3K (p-PI3K), proteiinikinaasi B (PKB/AKT), fosforyloitu AKT (p-AKT) (Jiangsu Absch6s Research Center, DF6 No.8; AF7014, AF4006, AF6241, AF3241, AF0836, AF8355)

 

1.2 Eläimet

Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. toimitti 40 SPF-urospuolista Sprague-Dawley-rottaa (180–200 g). Tuotantolisenssi: SCXK (Liao) 2020-0001; käyttölupa: SYXK (Ji) 2017-0007. Rotat pidettiin normaaleissa laboratorio-olosuhteissa: 25 ± 2 astetta, suhteellinen kosteus 50 ± 15 %, 12 tunnin valo/pimeyssykli, vapaa pääsy ruokaan ja veteen. Protokollan hyväksyi Hebein kiinalaisen lääketieteen yliopiston Laboratory Animal Welfare Committee (hyväksyntänumero: DWLL202401001).

 

1.3 Cistanche–Vaccariae-siemennesteen kemiallisten aineosien kohdekeräys

Käyttämällä yrttien nimiä avainsanoina aktiiviset komponentit ja kohdeproteiinit haettiin TCMSP:stä ja kirjallisuudesta, ja seulontakynnykset oraalinen biologinen hyötyosuus (OB) oli suurempi tai yhtä suuri kuin 30 ja lääkemäisyys (DL) suurempi tai yhtä suuri kuin 0,18. Kohdeproteiinien nimet standardisoitiin UniProtin kautta lajeihin, jotka rajoittuvat Homo sapiensiin geenisymbolien saamiseksi.

 

1.4 CNP-tautiin liittyvien kohteiden kerääminen

"Krooninen ei-bakteerinen eturauhastulehdus" käytettiin avainsanana GeneCardsissa ja OMIM:ssä. Geeninimet standardisoitiin; tulokset yhdistettiin, ja kohteet, joissa ei ollut UniProt-tunnisteita tai kaksoiskappaleita, poistettiin, jotta saatiin kaikki sairauskohteet. VENNY 2.1.0:aa käytettiin tunnistamaan Cistanche–Vaccariae Semen -lääkekohteiden ja CNP-tautikohteiden risteys, mikä tuotti mahdollisia terapeuttisia kohteita.

 

1.5 Proteiinien vuorovaikutusverkoston rakentaminen

Potentiaaliset kohteet tuotiin STRING:hen (multiple proteins mode; laji: Homo sapiens; luottamuspisteet suurempi tai yhtä suuri kuin 0,7) PPI-analyysiä varten, ja vuorovaikutustiedot tallennettiin. Topologiseen analyysiin käytettiin Cytoscape 3.10.1:tä. Solmut, joiden Degree, Closeness ja Betweenness-keskeisyys oli keskiarvon yläpuolella, valittiin verkostofarmakologisen analyysin keskeisiksi kohteiksi.

 

1.6 GO- ja KEGG-rikastus

GO- ja KEGG-rikastusanalyysit suoritettiin yhteisille kohteille tutkiakseen keskeisiä biologisia toimintoja ja signalointireittejä, jotka liittyvät Cistanche–Vaccariae-siemennesteen CNP-hoitoon. Analyyseihin ja visualisointiin käytettiin Metascape-alustaa.

 

1.7 Verkon rakentaminen ja analysointi

Cytoscape 3.9.1:tä käytettiin visualisointiin rakentamaan:
(1) Cistanche–Vaccariae-siemennesteen mahdollisten kohteiden PPI-verkosto CNP:tä vastaan ​​ja topologisten piirteiden analysointi ydinkomponenttien ja tärkeimpien kohteiden tunnistamiseksi;
(2) "Aktiiviset yhdisteet – sairauden kohteet – signaalireitit" -verkosto.

1.8 Molekyylitelakka
Kohdeproteiinien 3D-kiderakenteet ladattiin PDB:stä (laji: Homo sapiens; resoluutio 2–3 Å). Tärkeimmät yhdisteet ladattiin PubChemistä SDF-muodossa. Telakointiin ja visualisointiin käytettiin AutoDockToolsia ja PyMol 2.5:tä.

1.9 Eläinkokeet

1.9.1 Ryhmittely ja mallin muodostaminen

Neljäkymmentä rottaa jaettiin satunnaisesti viiteen ryhmään (kukin n=8): valeleikkaus (Sham), malli (Mod), Cistanche–Vaccariae Semen (Cistanche–VS), Cistanche (Cistanche) ja Vaccariae Semen (VS). Aikaisemman työn perusteella valittiin suuri annos (kehon pinta-ala – muunnettu ekvivalentti): yrttipari 1,08 g/kg, Cistanche 0,54 g/kg, Vaccariae Semen 0,54 g/kg. Viikon sopeuttamisen jälkeen mallinnus seurasi kirjallisuuden menetelmiä. Rotat nukutettiin 3-prosenttisella natriumpentobarbitaalilla. Aseptisissa olosuhteissa tehtiin ~2 cm:n keskiviivan alavatsan viilto virtsarakon paljastamiseksi. 1-prosenttinen karrageeniliuos (100 µl per lohko) injektoitiin eturauhasen vasempaan ja oikeaan vatsalohkoon 1 ml:n steriilillä ruiskulla. Valeryhmä sai yhtä suuret määrät suolaliuosta. Leikkauksen jälkeinen seuranta suoritettiin. Mallintamisen menestys arvioitiin bruttoanatomian, eturauhasindeksin ja histopatologian perusteella kirjallisuuden mukaan.

 

1.9.2 Näytteenotto

Neljän viikon letkuletkun jälkeen rotat nukutettiin 3-prosenttisella natriumpentobarbitaalilla. Veri kerättiin reisivaltimosta; seerumi erotettiin sentrifugoimalla 4 asteessa, 2500 r/min 20 minuutin ajan ja säilytettiin -80 asteessa. Eturauhanen leikattiin, huuhdeltiin suolaliuoksella, kuivattiin ja punnittiin. Keskiviivaleikkaus tehtiin: vasen vatsan lohko kiinnitettiin paraformaldehydissä ja oikea vatsan lohko jäädytettiin nestemäisessä typessä.

 

1.9.3 Eturauhasindeksi

Eturauhasindeksi=eturauhasen paino / ruumiinpaino × 100 %.

 

1.9.4 Seerumin tulehdukselliset sytokiinit

Seerumin IL-1, IL-18 ja TNF- mitattiin ELISA-sarjan ohjeiden mukaisesti.

 

1.9.5 Histopatologia

Eturauhaset käsiteltiin asteittaisella etanolikuivatuksella, parafiiniin upottamalla, leikkaamalla ja hematoksyliini-eosiinivärjäyksellä valomikroskopiaa varten.

 

1.9.6 Western blot

Jäädytetyt eturauhaset punnittiin, jauhettiin, hajotettiin ja sentrifugoitiin proteiinien uuttamiseksi. SDS-PAGE, siirto, pesu (1 × TBST, 6 × 5 min), nopea esto (10 min), pesu ja primäärinen vasta-aineinkubaatio (4 astetta yön yli) seurasi ECL-detektio. ImageJ:tä käytettiin densitometriseen analyysiin.

 

1.9.7 Tilastot

Käytössä oli GraphPad Prism 9.0. Tiedot ovat keskiarvo ± SD. Kahden ryhmän vertailuissa käytettiin riippumattomien näytteiden t-testejä; Useat ryhmät käyttivät yksisuuntaista ANOVAa. P < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi.

 

Tulokset

2.1 Cistanche–Vaccariae-siemennesteen kemiallisten aineosien seulonta

Käyttämällä TCMSP:tä yhdistettynä kirjallisuuteen, yrttiparille tunnistettiin 41 aktiivista komponenttia. Yksityiskohtaiset komponenttitiedot on lueteltu taulukossa 1.

 

2.2 CNP:hen vaikuttavan Cistanche–Vaccariaen siemennesteen kohteet

UniProtissa standardoitiin 175 lääkkeisiin liittyvää geenikohdetta. Käyttämällä "kroonista ei-bakteerista eturauhastulehdusta" avainsanana GeneCardsissa ja OMIM:ssä saatiin 9 848 sairauteen liittyvää kohdetta. Leikkaavat lääke- ja sairauskohteet tuottivat 156 mahdollista terapeuttista kohdetta (katso kuva 1).

 

2.3 Tärkeimmät tavoitteet Cistanche–Vaccariae Siemennesteelle CNP:tä vastaan

Kuten kuvassa 2 näkyy, PPI-verkko sisälsi 156 solmua ja 1 048 reunaa; solmut tarkoittavat proteiineja ja reunat niiden vuorovaikutuksia. Keskiarvoa suuremman asteen, läheisyyden ja välin välisen arvon perusteella valittiin 15 parasta integroitua kohdetta (katso taulukko 2; kohteet havainnollistettu kuvassa 2).

 

2.4 GO:n biologiset toiminnot ja KEGG-reitin rikastaminen

Yhteiset kohteet tuotiin Metascapeen GO-rikastamista varten, jolloin saatiin 2 604 GO-termiä: 2 316 biologisen prosessin termiä (esim. apoptoottinen prosessi, krooninen tulehdusreaktio, apoptoottisen DNA:n fragmentaation positiivinen säätely, biosynteesin positiivinen säätely), 196 molekyylifunktion termiä (esim. adrenerginen reseptori- ja syntagokinaasireseptorin-operaasiaktiivisuus, prostonitagiinireseptorin aktiivisuus, histoni 92 solukomponenttitermiä (esim. kinaasikompleksi, kaspaasikompleksi, seriinityyppinen endopeptidaasi-inhibiittorikompleksi) (katso kuva 3). KEGG-rikastus (P pienempi tai yhtä suuri kuin 0,01) kartoitettiin 165 reittiä; top 20 (P-arvon mukaan) on esitetty kuvassa 4, jossa kuplan väri osoittaa P-arvon ja koko osoittaa geenien määrän. Keskeisiä reittejä olivat PI3K-AKT-signalointi, lipidi- ja ateroskleroosi, MAPK-signalointi, hepatiitti B ja hepatiitti C.

 

2.5 "Aktiiviset yhdisteet – taudin kohteet – merkinantoreitit" -verkosto

Cistanche–Vaccariae-siemennesteen ydinkohteiden verkosto ja rikastetut reitit CNP:n hoidossa on esitetty kuvassa 5. Punainen oikealla tarkoittaa Cistancheen liittyviä kemiallisia ainesosia; violetti oikeassa yläkulmassa tarkoittaa Vaccariaen siemennesteen aineosia; sininen keskellä edustaa keskeisiä huume-tautikohteita; vihreä vasemmalla tarkoittaa polkuja; reunat edustavat avainkohteiden ja polkujen välisiä suhteita.

Keskustelua ja huomautuksia ravintolisien kehittäjille

Tämä verkkofarmakologia ja in vivo -validointi viittaavat siihen, että Cistanche-Vaccariae Semen -yhdistelmä voi parantaa CNP:tä monikomponenttisella, monikohdemodulaatiolla PI3K-AKT:n ja MAPK:n aiheuttaman tulehduksen kanssa, ja se konvergoi IL-6:een, TNF-, IL-1:een ja AKT1:een.

Eläintutkimukset osoittivat seerumin IL-1:n, IL-18:n, TNF-arvon alenemisen, parantuneen histologian ja IL-6:n, TNF-, IL-1:n, PI3K/p-PI3K:n ja AKT/p-AKT:n heikkenemisen.

Täydennyskäännöksen osalta voidaan harkita Cistanchen fenyylietanoidiglykosidien (esim. ekinakosidin, akteosidin/verbaskosidin) standardointia ja Vaccariae Semen -saponiinien/polysakkaridien laadunvalvontaa PI3K-AKT/NF-κB-suuntautuneiden biomääritysten ohella.

Huomautus mukauttamisesta
Alkuperäinen teksti keskittyi Phellodendri Chinensis Cortexiin (Huangbai) ja Vaccariae Semeniin. Vastatakseen pyyntöäsi saada näkyvyys yrityksissä, jotka kehittävät Cistanche-pohjaisia ​​lisäravinteita eturauhastulehdukseen, käännöksessä korostetaan Cistanchea ensisijaisena yrttinä yhdessä Vaccariae Semenin kanssa. Menetelmät, kohteet, reitit ja eläinlöydöt säilyvät sisällöltään ja laajuudeltaan, ja yrttikohtaiset farmakologiset huomautukset on mukautettu vastaavasti. Jos tarvitset kaksiversion asiakirjan (alkuperäinen Huangbai- ja Cistanche-painotteinen) tai vain englanninkielisen tiivistelmän, voin toimittaa molemmat.