1. Johdanto

Immunomoduloivia ominaisuuksia omaavien elintarvikkeiden ainesosien ja vastaavien molekyylikohteiden tunnistaminen on herättänyt lisääntynyttä kiinnostusta viime vuosina. Suuren ligandidiversiteettinsä vuoksi ionikanavien (TRP-kanavien) lyhytaikainen reseptoripotentiaalinen superperhe edustaa erittäin mielenkiintoista potentiaalisten kohderakenteiden luokkaa.

Nisäkkään TRP-kanavan superperheeseen kuuluu kuusi toisiinsa liittyvää proteiiniperhettä, nimittäin ankyriini (TRPA), kanoninen (TRPC), melastatiini (TRPM), mukolipiini (TRPML), polykystiini (TRPP) ja vanilloidiperhe (TRPV), jotka kaikki jakavat tyypillisesti kuusi transmembraanista segmenttiä, jotka kokoontuvat varikationi-selektiivisiksi tetrameereiksi muodostaen 1-selektiivisyyden]. TRPV1-kanava voi olla ylivoimaisesti intensiivisimmin tutkittu TRP-superperheen jäsen. TRPV1 tunnistettiin alun perin kapsaisiinin, chilipippurien pistävän komponentin, reseptoriksi.[2] Myöhemmin myös inkivääristä saadun pistävän ainesosan, gingerolien, osoitettiin aktivoivan TRPV1:tä.[3]

TRPV1:n biologista roolia ei-neuronaalisissa solutyypeissä tutkitaan edelleen laajasti, mutta saatavilla olevat tulokset viittaavat toimiin, jotka ovat paljon aisti- ja lämpöhavainnon ulkopuolella. Esimerkiksi 12 viikkoa kestänyt toimenpide, jossa vuorokausiannos oli 0,15 mg TRPV1-agonisti nonivamidia, rakenteellista kapsaisiinianalogia, esti ruokavalion aiheuttaman kehon rasvamassan nousun ja nosti plasman serotoniinitasoja terveillä ylipainoisilla henkilöillä.[4]

3T3-L1-rasvasoluissa TRPV1:n aktivaatio nonivamidilla vähensi lipidien kertymistä erilaistumisen ja kypsymisen aikana estämällä PPAR-ilmentymistä.[5] Makrofageissa kapsaisiini ja nonivamidi heikensivät LPS:n aiheuttamaa proinflammatoristen sytokiinien, kuten IL6:n, CXCL8:n ja TNF-alfan, vapautumista TRPV1:stä riippuvaisella tavalla.[6] Silti TRPV1:n erityiset toiminnot ihmisen veren leukosyyteissä pysyvät epämääräisinä. Ihmisen NK-soluissa 10 ja 50 μM kapsaisiini aiheutti solunsisäisten Ca2+-pitoisuuksien nousun, mikä osoittaa toimivan TRPV1-kanavan.[7]

Kuitenkin vaimennetut NK-solujen efektoritoiminnot, kuten sytotoksinen degranulaatio ja sytokiinien eritys, jotka aiheutettiin esikäsittelyllä soluja kapsaisiinilla 1 tunnin ajan pitoisuudessa 10–100 µM, olivat suurelta osin TRPV1:stä riippumattomia.[7] T-soluissa TRPV1:n on dokumentoitu osallistuvan T-solureseptorisignalointiprosesseihin, T-solujen lisääntymiseen ja erilaistumiseen sekä sytokiinien tuotantoon.[8] Ryhmämme aikaisempi työ osoitti myös TRPV1:n toiminnallisen ilmentymisen ihmisen primaarisissa T-soluissa.[9] Lisäksi annosvasteanalyysit pitoisuuksilla 0,03–300 μmol L-1 paljastivat, että [6]-gingeroli estää ihmisen primääristen leukosyyttien sytokiinieritystä IC50-arvolla 82,2 μmol L-1.

Kuitenkin [6]-gingerolin kvantifiointi terveiden koehenkilöiden plasmanäytteistä osoitti, että plasman keskimääräinen maksimipitoisuus oli vain 42,0 ± 16,3 nmol L-1 1 litran inkivääriteetä nauttimisen jälkeen. Koska näillä [6]-gingerolipitoisuuksilla ei ollut merkittävää vaikutusta sytokiinien erittymiseen aikaisemmissa tutkimuksissa,[9] on epäselvää, riittääkö ravinnon kannalta merkityksellinen pitoisuus 50 nmol L-1, joka saavutetaan veriplasmassa 1 litran inkivääriteetä nauttimisen jälkeen, moduloimaan solujen immuunivasteita muissa ihmisen primaarisissa leukosyyteissä.

Ihmisen neutrofiilien osalta tieto TRPV1:n toiminnallisesta roolista on rajallinen. Kun Köse ja Nazıroglu˘ [10] osoittivat, että TRPV1-antagonisti kapsatsepiini vähensi Ca2+--virtoja neutrofiileissä vasteena 10 µM kapsaisiiniin, muut tulokset eivät osoittaneet, että kapsaisiini indusoi Ca2+-RNA-virtausta, kun sitä testattiin pitoisuuksilla 1–10M PV100. ilmaisu.[11]

Neutrofiilit ovat ihmisveren yleisimmät leukosyytit, ja ne muodostavat 60–70 % kaikista verenkierrossa olevista valkosoluista. Ne ovat ensimmäisiä immuunisoluja, jotka värvätään infektiopaikoille; Siksi niitä kutsutaan usein ensimmäiseksi puolustuslinjaksi.[12] Neutrofiilien kerääntymisen laukaisee muun muassa bakteeri- tai mitokondrioista peräisin oleva peptidi N-formyylimetioniini-leusyylifenyylialaniini (fMLF) tai kemokiinit, kuten CXCL8 (IL-8).[13]

Neutrofiilien puolustusmekanismeihin kuuluvat fagosytoosi[14], antimikrobisten entsyymien vapautuminen degranulaation kautta,[15] reaktiivisten happilajien (ROS) muodostuminen[16] ja neutrofiilien ekstrasellulaaristen ansojen muodostuminen[17]. Näiden suorien puolustusmekanismien lisäksi neutrofiilit edistävät myöhempiä immuunivasteita erilaisten sytokiinien ja kemokiinien vapautumisen kautta.[18] Neutrofiilit voivat myös käydä läpi esikäsittelyprosessin, jonka avulla ne voivat reagoida voimakkaammin myöhempään täyteen aktivaatioon.[16b]

Viime vuosina on lisääntynyt näyttöä siitä, että elintarvikkeista ja/tai lääkekasveista peräisin olevat ainesosat voivat muuttaa yhtä tai useampaa ihmisen neutrofiilien mainituista puolustusreaktioista. Näitä modifikaatioita ovat lisääntynyt fagosytoottinen aktiivisuus[19] ja ROS:n muodostuminen[20], lisääntynyt kemotaksinen fMLF:ää kohtaan[21] ja neutrofiilien ekstrasellulaaristen ansojen muodostuminen[20]. Aktiivista yhdistettä (aktiivisia yhdisteitä) ei kuitenkaan tunnistettu. Ferula akitschkensis -bakteerin ainesosat (-pineeni, sabineeni, -terpiini, geranyyyliasetoni ja isobornyyliasetaatti) tekivät neutrofiilien herkistymisen fMLF- ja CXCL8-indusoidulle Ca2+-virtaukselle ja estivät fMLF-asetonin aiheuttamia kemotaksisia. TRPV1.[22]

Saatavilla olevien tietojen perusteella oletimme, että ligandin indusoima TRPV1:n aktivaatio [6]-gingerolin vaikutuksesta voi vaikuttaa neutrofiilien yleisiin toimintoihin joko suoraan tai tehostamalla niiden vasteita aktivoiviin ärsykkeisiin. Tämän hypoteesin puitteissa pyrimme erityisesti selvittämään, onko varmennettu ravitsemuksellisesti relevantti pitoisuus riittävä moduloimaan solujen immuunivasteita ihmisen primaarisissa neutrofiileissä osana leukosyyttipopulaatiota. '

Lisäksi pyrimme vertaamaan kaikkien nisäkkäiden TRP-superperheen jäsenten RNA-ekspressiotasoja viidessä merkittävimmässä ihmisen veren solutyypissä saadaksemme kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti kattavan yleiskuvan TRP-kanavan ilmentymisestä ihmisen leukosyyteissä.

2. Tulokset

2.1. TRP-kanavien runsaus ja suhteelliset transkriptitasot ihmisen leukosyyteissä

TRP-kanavan RNA:n ilmentymisen arvioimiseksi veren leukosyyteissä eristettiin viisi merkittävintä leukosyyttisolutyyppiä terveiden luovuttajien verestä ja TRP-kanavien RNA-ilmentymistä analysoitiin kvantitatiivisella RT-PCR:llä (kuvio 1).

TRPV:n ja TRPM-perheen spesifiset transkriptit havaittiin korkeilla 75–100 %:n taajuuksilla kaikissa analysoiduissa solutyypeissä. Keskimääräinen yleisfrekvenssi ottaen huomioon kaikki solutyypit oli 96 % TRPV-perheellä ja 98 % TRPM-perheellä. TRPC-spesifiset transkriptit olivat paljon vähemmän runsaita, ja ne vaihtelivat 0 %:sta monosyyteissä, NK-soluissa, T-soluissa ja B-soluissa 100 %:iin NK-soluissa ja T-soluissa, joiden yleinen keskimääräinen esiintymistiheys oli vain 53 % (kuvio 1A). TRPC5-spesifinen transkripti havaittiin vain neutrofiileissä 70 %:n esiintymistiheydellä.

Myös TRPA1-spesifinen transkripti paljasti yleensä melko alhaisen runsauden analysoiduissa solutyypeissä 100 % neutrofiileissä, 25 % monosyyteissä, 80 % NK-soluissa, 100 % T-soluissa ja 60 % B-soluissa. Samoin TRPML3-spesifinen transkripti osoitti alhaisen esiintymistiheyden neutrofiileissä (50 %), monosyyteissä (25 %), NK-soluissa (40 %) ja B-soluissa (20 %), mutta 100 %:n esiintymistiheys T-soluissa. TRPV1-spesifinen transkripti havaittiin kaikissa solutyypeissä, ja sen esiintymistiheys oli 100 % monosyyteissä, NK-soluissa ja T-soluissa ja 90 % neutrofiileissä ja 80 % B-soluissa.

Mitä tulee suhteelliseen RNA-ilmentymiseen, verrattuna vastaaviin frekvenssiin, TRP-kanavat paljastivat solutyyppispesifisemmän ilmentymiskuvion, mikä käy ilmi vastaavien Δct-arvojen vertailusta eri analysoiduissa solutyypeissä (kuvio 1B). Esimerkiksi TRPP3 havaittiin 100 %:n esiintymistiheydellä kaikissa solutyypeissä, mutta se paljasti selvästi korkeimman ekspression tason monosyyteissä.

Sitä vastoin TRPV2-kanava havaittiin kaikissa tutkituissa solutyypeissä verrattain korkealla RNA-ilmentymistasolla sekä korkealla taajuudella. Samoin TRPV1:n transkriptitasot olivat samanlaiset kaikissa tutkituissa solutyypeissä (kuvio 1B).

2.2. TRPV1-pinnan ilmentyminen neutrofiileillä

Nykyinen tieto TRPV1:n toiminnasta ihmisen neutrofiileissä on edelleen epäselvä. Tutkiaksemme edelleen TRPV1:n rooleja ihmisen neutrofiileissä tutkimme seuraavaksi, ekspressoituuko TRPV1-kanava ihmisen primääristen neutrofiilien pinnalla käyttämällä elävien solujen virtaussytometriaa (kuvio 2).

Eristetyt neutrofiilit värjättiin CD15:n suhteen neutrofiilien pintamarkkerina (kuvio 2A, B) ja samanaikaisesti joko värjättiin vasta-aineella, joka oli nostettu TRPV1-proteiinin ensimmäisessä ekstrasellulaarisessa silmukassa olevaa epitooppia vastaan ​​(kuvio 2B) tai vastaavalla isotyyppikontrollilla, jälkimmäisen toimiessa epäspesifisenä sitoutumisena (spesifisenä 2:na). CD15+-populaatiossa analysoitiin FITC:n fluoresenssin intensiteetti. Neutrofiilien värjäys TRPV1-vasta-aineella johti selvästi erottuvaan fluoresenssisignaaliin verrattuna isotyyppikontrolliin, mikä vahvisti TRPV1:n pintaekspression primaarisissa ihmisen neutrofiileissä (kuvio 2C). Neljän yksittäisen luovuttajan neutrofiilien analysointi paljasti TRPV1:n vastaavan pinnan ilmentymisen (kuvio 2D).

2.3. [6]-Gingerol Induced Increase in Intracellular Ca2+

Koska ligandin aiheuttama TRPV1:n aktivaatio johtaa Ca2+:n sisäänvirtaukseen, [23] neutrofiilien intrasellulaariset Ca2+-pitoisuudet määritettiin Ca2+--herkän väriaineen Fura-2 avulla. Aiempien löytöjemme perusteella [9] valittiin 50 nM:n konsentraatioksi tunnettua TRPV1-ligandia [6]-gingerolia ja inkubaatioaikaa 2 tuntia. Analyysit osoittivat, että neutrofiilien inkubointi 50 nM [6]-gingerolin kanssa johti lisääntyneisiin solunsisäisiin Ca2+-pitoisuuksiin, jotka olivat keskimäärin 18,4 % ± 1,0 % maksimiarvosta määritettynä käyttämällä 1 µM ionofori-ionomysiiniä. DMSO:n aiheuttama lisäys oli 4,7 % ± 1,2 % (kuvio 3).

2.4. [6]-Gingerolin vaikutus TRPV1-ilmentymiseen

Seuraavaksi pyrimme analysoimaan [6]-gingerolin TRPV1-stimulaation vaikutusta TRPV1:n ilmentymiseen transkriptitasolla q-RTPCR:n kautta sekä pintaproteiinitasolla elävien solujen värjäyksen kautta. Tätä tarkoitusta varten ihmisen neutrofiilejä inkuboitiin 50 nM [6]-gingerolin kanssa 2 tuntia ja vastaavat ilmentymistasot kvantifioitiin.

Tämä 2 tunnin inkubaatio ei vaikuttanut TRPV1-transkriptin eikä proteiinitasoihin (kuvio 4), eikä myöskään muuttanut, paitsi IL6:n, IL17A:n, IL24:n, C5:n ja GDF5:n osalta, tutkittujen yleisten sytokiini- ja kemokiinigeenien RNA-ilmentymiseen (kuva S1, taulukko S2, tukitiedot).

2.5. [6]-Gingerolin vaikutus neutrofiilien pintamarkkerien ilmentymiseen

1. Johdanto

Immunomoduloivia ominaisuuksia omaavien elintarvikkeiden ainesosien ja vastaavien molekyylikohteiden tunnistaminen on herättänyt lisääntynyttä kiinnostusta viime vuosina. Suuren ligandidiversiteettinsä vuoksi ionikanavien (TRP-kanavien) lyhytaikainen reseptoripotentiaalinen superperhe edustaa erittäin mielenkiintoista potentiaalisten kohderakenteiden luokkaa.

Nisäkkään TRP-kanavan superperheeseen kuuluu kuusi toisiinsa liittyvää proteiiniperhettä, nimittäin ankyriini (TRPA), kanoninen (TRPC), melastatiini (TRPM), mukolipiini (TRPML), polykystiini (TRPP) ja vanilloidiperhe (TRPV), jotka kaikki jakavat tyypillisesti kuusi transmembraanista segmenttiä, jotka kokoontuvat varikationi-selektiivisiksi tetrameereiksi muodostaen 1-selektiivisyyden]. TRPV1-kanava voi olla ylivoimaisesti intensiivisimmin tutkittu TRP-superperheen jäsen. TRPV1 tunnistettiin alun perin kapsaisiinin, chilipippurien pistävän komponentin, reseptoriksi.[2] Myöhemmin myös inkivääristä saadun pistävän ainesosan, gingerolien, osoitettiin aktivoivan TRPV1:tä.[3]

TRPV1:n biologista roolia ei-neuronaalisissa solutyypeissä tutkitaan edelleen laajasti, mutta saatavilla olevat tulokset viittaavat toimiin, jotka ovat paljon aisti- ja lämpöhavainnon ulkopuolella. Esimerkiksi 12 viikkoa kestänyt toimenpide, jossa vuorokausiannos oli 0,15 mg TRPV1-agonisti nonivamidia, rakenteellista kapsaisiinianalogia, esti ruokavalion aiheuttaman kehon rasvamassan nousun ja nosti plasman serotoniinitasoja terveillä ylipainoisilla henkilöillä.[4]

3T3-L1-rasvasoluissa TRPV1:n aktivaatio nonivamidilla vähensi lipidien kertymistä erilaistumisen ja kypsymisen aikana estämällä PPAR-ilmentymistä.[5] Makrofageissa kapsaisiini ja nonivamidi heikensivät LPS:n aiheuttamaa proinflammatoristen sytokiinien, kuten IL6:n, CXCL8:n ja TNF-alfan, vapautumista TRPV1:stä riippuvaisella tavalla.[6] Silti TRPV1:n erityiset toiminnot ihmisen veren leukosyyteissä pysyvät epämääräisinä. Ihmisen NK-soluissa 10 ja 50 μM kapsaisiini aiheutti solunsisäisten Ca2+-pitoisuuksien nousun, mikä osoittaa toimivan TRPV1-kanavan.[7]

Kuitenkin vaimennetut NK-solujen efektoritoiminnot, kuten sytotoksinen degranulaatio ja sytokiinien eritys, jotka aiheutettiin esikäsittelyllä soluja kapsaisiinilla 1 tunnin ajan pitoisuudessa 10–100 µM, olivat suurelta osin TRPV1:stä riippumattomia.[7] T-soluissa TRPV1:n on dokumentoitu osallistuvan T-solureseptorisignalointiprosesseihin, T-solujen lisääntymiseen ja erilaistumiseen sekä sytokiinien tuotantoon.[8] Ryhmämme aikaisempi työ osoitti myös TRPV1:n toiminnallisen ilmentymisen ihmisen primaarisissa T-soluissa.[9] Lisäksi annosvasteanalyysit pitoisuuksilla 0,03–300 μmol L-1 paljastivat, että [6]-gingeroli estää ihmisen primääristen leukosyyttien sytokiinieritystä IC50-arvolla 82,2 μmol L-1.

Kuitenkin [6]-gingerolin kvantifiointi terveiden koehenkilöiden plasmanäytteistä osoitti, että plasman keskimääräinen maksimipitoisuus oli vain 42,0 ± 16,3 nmol L-1 1 litran inkivääriteetä nauttimisen jälkeen. Koska näillä [6]-gingerolipitoisuuksilla ei ollut merkittävää vaikutusta sytokiinien erittymiseen aikaisemmissa tutkimuksissa,[9] on epäselvää, riittääkö ravinnon kannalta merkityksellinen pitoisuus 50 nmol L-1, joka saavutetaan veriplasmassa 1 litran inkivääriteetä nauttimisen jälkeen, moduloimaan solujen immuunivasteita muissa ihmisen primaarisissa leukosyyteissä.

Ihmisen neutrofiilien osalta tieto TRPV1:n toiminnallisesta roolista on rajallinen. Kun Köse ja Nazıroglu˘ [10] osoittivat, että TRPV1-antagonisti kapsatsepiini vähensi Ca2+--virtoja neutrofiileissä vasteena 10 µM kapsaisiiniin, muut tulokset eivät osoittaneet, että kapsaisiini indusoi Ca2+-RNA-virtausta, kun sitä testattiin pitoisuuksilla 1–10M PV100. ilmaisu.[11]

Neutrofiilit ovat ihmisveren yleisimmät leukosyytit, ja ne muodostavat 60–70 % kaikista verenkierrossa olevista valkosoluista. Ne ovat ensimmäisiä immuunisoluja, jotka värvätään infektiopaikoille; Siksi niitä kutsutaan usein ensimmäiseksi puolustuslinjaksi.[12] Neutrofiilien kerääntymisen laukaisee muun muassa bakteeri- tai mitokondrioista peräisin oleva peptidi N-formyylimetioniini-leusyylifenyylialaniini (fMLF) tai kemokiinit, kuten CXCL8 (IL-8).[13]

Neutrofiilien puolustusmekanismeihin kuuluvat fagosytoosi[14], antimikrobisten entsyymien vapautuminen degranulaation kautta,[15] reaktiivisten happilajien (ROS) muodostuminen[16] ja neutrofiilien ekstrasellulaaristen ansojen muodostuminen[17]. Näiden suorien puolustusmekanismien lisäksi neutrofiilit edistävät myöhempiä immuunivasteita erilaisten sytokiinien ja kemokiinien vapautumisen kautta.[18] Neutrofiilit voivat myös käydä läpi esikäsittelyprosessin, jonka avulla ne voivat reagoida voimakkaammin myöhempään täyteen aktivaatioon.[16b]

Viime vuosina on lisääntynyt näyttöä siitä, että elintarvikkeista ja/tai lääkekasveista peräisin olevat ainesosat voivat muuttaa yhtä tai useampaa ihmisen neutrofiilien mainituista puolustusreaktioista. Näitä modifikaatioita ovat lisääntynyt fagosytoottinen aktiivisuus[19] ja ROS:n muodostuminen[20], lisääntynyt kemotaksinen fMLF:ää kohtaan[21] ja neutrofiilien ekstrasellulaaristen ansojen muodostuminen[20]. Aktiivista yhdistettä (aktiivisia yhdisteitä) ei kuitenkaan tunnistettu. Ferula akitschkensis -bakteerin ainesosat (-pineeni, sabineeni, -terpiini, geranyyyliasetoni ja isobornyyliasetaatti) tekivät neutrofiilien herkistymisen fMLF- ja CXCL8-indusoidulle Ca2+-virtaukselle ja estivät fMLF-asetonin aiheuttamia kemotaksisia. TRPV1.[22]

Saatavilla olevien tietojen perusteella oletimme, että ligandin indusoima TRPV1:n aktivaatio [6]-gingerolin vaikutuksesta voi vaikuttaa neutrofiilien yleisiin toimintoihin joko suoraan tai tehostamalla niiden vasteita aktivoiviin ärsykkeisiin. Tämän hypoteesin puitteissa pyrimme erityisesti selvittämään, onko varmennettu ravitsemuksellisesti relevantti pitoisuus riittävä moduloimaan solujen immuunivasteita ihmisen primaarisissa neutrofiileissä osana leukosyyttipopulaatiota. '

Lisäksi pyrimme vertaamaan kaikkien nisäkkäiden TRP-superperheen jäsenten RNA-ekspressiotasoja viidessä merkittävimmässä ihmisen veren solutyypissä saadaksemme kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti kattavan yleiskuvan TRP-kanavan ilmentymisestä ihmisen leukosyyteissä.

2. Tulokset

2.1. TRP-kanavien runsaus ja suhteelliset transkriptitasot ihmisen leukosyyteissä

TRP-kanavan RNA:n ilmentymisen arvioimiseksi veren leukosyyteissä eristettiin viisi merkittävintä leukosyyttisolutyyppiä terveiden luovuttajien verestä ja TRP-kanavien RNA-ilmentymistä analysoitiin kvantitatiivisella RT-PCR:llä (kuvio 1).

TRPV:n ja TRPM-perheen spesifiset transkriptit havaittiin korkeilla 75–100 %:n taajuuksilla kaikissa analysoiduissa solutyypeissä. Keskimääräinen yleisfrekvenssi ottaen huomioon kaikki solutyypit oli 96 % TRPV-perheellä ja 98 % TRPM-perheellä. TRPC-spesifiset transkriptit olivat paljon vähemmän runsaita, ja ne vaihtelivat 0 %:sta monosyyteissä, NK-soluissa, T-soluissa ja B-soluissa 100 %:iin NK-soluissa ja T-soluissa, joiden yleinen keskimääräinen esiintymistiheys oli vain 53 % (kuvio 1A). TRPC5-spesifinen transkripti havaittiin vain neutrofiileissä 70 %:n esiintymistiheydellä.

Myös TRPA1-spesifinen transkripti paljasti yleensä melko alhaisen runsauden analysoiduissa solutyypeissä 100 % neutrofiileissä, 25 % monosyyteissä, 80 % NK-soluissa, 100 % T-soluissa ja 60 % B-soluissa. Samoin TRPML3-spesifinen transkripti osoitti alhaisen esiintymistiheyden neutrofiileissä (50 %), monosyyteissä (25 %), NK-soluissa (40 %) ja B-soluissa (20 %), mutta 100 %:n esiintymistiheys T-soluissa. TRPV1-spesifinen transkripti havaittiin kaikissa solutyypeissä, ja sen esiintymistiheys oli 100 % monosyyteissä, NK-soluissa ja T-soluissa ja 90 % neutrofiileissä ja 80 % B-soluissa.

Mitä tulee suhteelliseen RNA-ilmentymiseen, verrattuna vastaaviin frekvenssiin, TRP-kanavat paljastivat solutyyppispesifisemmän ilmentymiskuvion, mikä käy ilmi vastaavien Δct-arvojen vertailusta eri analysoiduissa solutyypeissä (kuvio 1B). Esimerkiksi TRPP3 havaittiin 100 %:n esiintymistiheydellä kaikissa solutyypeissä, mutta se paljasti selvästi korkeimman ekspression tason monosyyteissä.

Sitä vastoin TRPV2-kanava havaittiin kaikissa tutkituissa solutyypeissä verrattain korkealla RNA-ilmentymistasolla sekä korkealla taajuudella. Samoin TRPV1:n transkriptitasot olivat samanlaiset kaikissa tutkituissa solutyypeissä (kuvio 1B).

2.2. TRPV1-pinnan ilmentyminen neutrofiileillä

Nykyinen tieto TRPV1:n toiminnasta ihmisen neutrofiileissä on edelleen epäselvä. Tutkiaksemme edelleen TRPV1:n rooleja ihmisen neutrofiileissä tutkimme seuraavaksi, ekspressoituuko TRPV1-kanava ihmisen primääristen neutrofiilien pinnalla käyttämällä elävien solujen virtaussytometriaa (kuvio 2).

Eristetyt neutrofiilit värjättiin CD15:n suhteen neutrofiilien pintamarkkerina (kuvio 2A, B) ja samanaikaisesti joko värjättiin vasta-aineella, joka oli nostettu TRPV1-proteiinin ensimmäisessä ekstrasellulaarisessa silmukassa olevaa epitooppia vastaan ​​(kuvio 2B) tai vastaavalla isotyyppikontrollilla, jälkimmäisen toimiessa epäspesifisenä sitoutumisena (spesifisenä 2:na). CD15+-populaatiossa analysoitiin FITC:n fluoresenssin intensiteetti. Neutrofiilien värjäys TRPV1-vasta-aineella johti selvästi erottuvaan fluoresenssisignaaliin verrattuna isotyyppikontrolliin, mikä vahvisti TRPV1:n pintaekspression primaarisissa ihmisen neutrofiileissä (kuvio 2C). Neljän yksittäisen luovuttajan neutrofiilien analysointi paljasti TRPV1:n vastaavan pinnan ilmentymisen (kuvio 2D).

2.3. [6]-Gingerol Induced Increase in Intracellular Ca2+

Koska ligandin aiheuttama TRPV1:n aktivaatio johtaa Ca2+:n sisäänvirtaukseen, [23] neutrofiilien intrasellulaariset Ca2+-pitoisuudet määritettiin Ca2+--herkän väriaineen Fura-2 avulla. Aiempien löytöjemme perusteella [9] valittiin 50 nM:n konsentraatioksi tunnettua TRPV1-ligandia [6]-gingerolia ja inkubaatioaikaa 2 tuntia. Analyysit osoittivat, että neutrofiilien inkubointi 50 nM [6]-gingerolin kanssa johti lisääntyneisiin solunsisäisiin Ca2+-pitoisuuksiin, jotka olivat keskimäärin 18,4 % ± 1,0 % maksimiarvosta määritettynä käyttämällä 1 µM ionofori-ionomysiiniä. DMSO:n aiheuttama lisäys oli 4,7 % ± 1,2 % (kuvio 3).

2.4. [6]-Gingerolin vaikutus TRPV1-ilmentymiseen

Seuraavaksi pyrimme analysoimaan [6]-gingerolin TRPV1-stimulaation vaikutusta TRPV1:n ilmentymiseen transkriptitasolla q-RTPCR:n kautta sekä pintaproteiinitasolla elävien solujen värjäyksen kautta. Tätä tarkoitusta varten ihmisen neutrofiilejä inkuboitiin 50 nM [6]-gingerolin kanssa 2 tuntia ja vastaavat ilmentymistasot kvantifioitiin.

Tämä 2 tunnin inkubaatio ei vaikuttanut TRPV1-transkriptin eikä proteiinitasoihin (kuvio 4), eikä myöskään muuttanut, paitsi IL6:n, IL17A:n, IL24:n, C5:n ja GDF5:n osalta, tutkittujen yleisten sytokiini- ja kemokiinigeenien RNA-ilmentymiseen (kuva S1, taulukko S2, tukitiedot).

2.5. [6]-Gingerolin vaikutus neutrofiilien pintamarkkerien ilmentymiseen

Leikkaa Jinkui Shenqi Pills paloiksi, punnita tarkasti noin 2,0 g näytettä ja siirrä se tulpalliseen erlenmeyerkolviin. Lisää 25 ml 70 % metanolia, punnita kokonaismassa ja suorita ultraääniuutto (300 W, 40 kHz) 35 minuutin ajan. Huoneenlämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen lisää menetetty paino 70 % metanolilla ja ravista hyvin. Suodata liuos 0,45 μm:n mikrohuokoisen kalvon läpi testiliuoksen saamiseksi.

 

Havaitsemisaallonpituuden valitsemiseksi suoritettiin koko aallonpituuspyyhkäisy (190–400 nm). Vaikka morronisidilla ja loganiinilla on maksimiabsorptio 230–240 nm:ssä, tämä aallonpituus kärsii korkeasta peruskohinasta. 254 nm:n aallonpituus takaa vakaan vasteen ja vähäisen taustahäiriön. Paeonoli, kanelihappo, akteosidi ja 7-hydroksikumariini tuottavat kaikki vakaan ultraviolettiabsorption 254 nm:ssä. Siksi 254 nm valittiin yhtenäiseksi ilmaisuaallonpituudeksi monikomponentti-synkronisessa analyysissä.

 

Kaikista luonnollisista kasviperäisistä raaka-aineista,Cistanche tubulosa (Desertliving Cistanche)erottuu yrttinäkorkein akteosidipitoisuusmaailmanlaajuisesti. Fenyylietanoidiglykosidina akteosidi tunnetaan anti-inflammatorisesta, antioksidanttisesta, hermosuojasta ja immuunisäätelystä. Tehtaamme on erikoistunut erittäin puhtaaseen Cistanche tubulosa -uutteeseen, joka sisältää paljon enemmän akteosidia ja muita aktiivisia ainesosia kuin tavalliset kasviperäiset materiaalit, joten se on ihanteellinen raaka-aine korkealuokkaisten ravintolisien, funktionaalisten elintarvikkeiden, yrttijuomien ja ihonhoitotuotteiden kehittämiseen Euroopan ja Amerikan markkinoille.

 

 

Acteoside, Cistanche tubulosa -uutteemme tunnuskomponentti, tarjoaa useita keskeisiä etuja, jotka vastaavat eurooppalaisten ja amerikkalaisten kuluttajien terveysvaatimuksia: tulehduksen esto, immuunijärjestelmän vahvistaminen, hypoksian esto, vapaiden radikaalien poistaminen, DNA:n korjaus ja maksan suojaaminen. Yhdessä ekinakosidin (antioksidantti, hermosoluja suojaavan, sydän- ja verisuonijärjestelmän suojauksen) ja polysakkaridien (immuunisäätely) kanssa uutteemme yhdistää kaikki edellä mainittujen korkealaatuisten kasviperäisten ainesosien päätehot, mukaan lukienanti-inflammatorinen, antibakteerinen, antioksidantti, immuunijärjestelmää säätelevä ja sydän- ja verisuonia suojaava aine.