Cistanche Deserticola -polysakkaridit parantavat suoliston ikääntymistä estämällä NLRP3-tulehdusaktivaatiota

 

 

Ikääntyminen johtaa useiden fysiologisten toimintojen asteittaiseen heikkenemiseen ja lisää ikääntymiseen liittyvien sairauksien riskiä [1]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että ikääntymisellä on merkittävä vaikutus suoliston rakenteeseen ja toimintaan [2]. Ruoansulatuksen, aineenvaihdunnan ja immuunipuolustuksen ydinelimenä suolen ikääntyminen voi aiheuttaa ravintoaineiden imeytymishäiriöitä, aineenvaihduntahäiriöitä ja heikentynyttä immuunitoimintaa [3–4], mikä lisää alttiutta maha-suolikanavan sairauksille [5]. Krooninen tulehdus on suoliston ikääntymisen tunnusmerkki, mutta sen molekyylimekanismeja ei ole vielä täysin selvitetty. Tällä hetkellä ikääntymistä estäviä aineita ovat pääasiassa beeta-nikotiiniamidimononukleotidi (NMN), rapamysiini, dasatinibi plus kversetiini ja muut [3]. Näistä NMN on olennaisen koentsyymin NAD+ avainesiaste, ja useat tutkimukset ovat vahvistaneet, että se viivyttää merkittävästi suolen ikääntymistä luonnollisesti ikääntyneillä hiirillä; Se on laajalti tunnustettu alalla tehokkaaksi toimenpiteeksi [4–5]. Siksi asiaankuuluvien mekanismien ja interventiostrategioiden tutkiminen on erittäin tärkeää.

Cistanche-oraaliliuos ikääntymiseen liittyviin sairauksiin

Ota nyt yhteyttä ja tutustu kiinalaisiin kiviviljelijöihin

Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin säiliön viejä:
Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

 

 

Nukleotidia sitova oligomerisaatiodomeenin kaltainen reseptoriperheen pyriindomeenia sisältävä 3 (NLRP3) -tulehdus on synnynnäisen immuniteetin avainsäätelijä ja sillä on tärkeä rooli ikääntymiseen liittyvissä sairauksissa. Sen aktivointi vaatii kaksi signaalia. Ensimmäinen signaali: patogeeneihin liittyvät molekyylimallit (PAMP) ja vaurioihin liittyvät molekyylimallit (DAMP) indusoivat NLRP3:n ja interleukiini-1:n esiasteen (pro-IL-1) ilmentymisen. Toinen signaali (kuten kaliumin ulosvirtaus ja mitokondriovaurio) laukaisee tulehduksen muodostumisen, aktivoi kaspaasi-1:n ja pilkkoo pro-IL-1 ja pro-IL-18 muodostaen kypsiä IL-1 ja IL-18, mikä aiheuttaa tulehdusta [6]. Ikääntymisen aikana suoliston homeostaasi häiriintyy, mikä johtaa tulehdusta edistävien tekijöiden, kuten lipopolysakkaridin (LPS) vapautumiseen, mikä aktivoi jatkuvasti NLRP3-tulehduksen muodostaen kroonisen matala-asteisen tulehduksen. Tämä pahentaa entisestään suoliston estevaurioita ja dysbioosia, muuttaa tiiviiden liitosproteiinien ilmentymistä, lisää suoliston läpäisevyyttä ja nopeuttaa suoliston ikääntymistä [7–10].

Cistanche deserticola, arvostettu perinteinen kiinalainen lääke- ja elintarvikehomologinen yrtti, joka tunnetaan nimellä "aavikon ginseng", tonisoi munuaisten yangia, ravitsee esanssia ja verta sekä kosteuttaa suolistoa ummetuksen lievittämiseksi. Sen aktiivisilla polysakkarideilla on ikääntymistä estäviä, antioksidanttisia ja suolistoa suojaavia ominaisuuksia [11–12]. Suoliston suojauksen kannalta Cistanche deserticola -polysakkaridit (CDP:t) voivat muuttaa suoliston mikrobiotatasapainoa estämällä Toll-like reseptori 4 (TLR4) / ydintekijä-kappa B (NF-κB) -reitin aktivaatiota, mikä vähentää LPS-tasoja ja korjaa suoliston estetoimintoa [13–14]. CDP:t voivat myös parantaa mitokondrioiden toimintaa aktivoimalla AMP-aktivoitua proteiinikinaasi (AMPK) / sirtuiini 1 (SIRT1) -reittiä, viivästyttää solujen vanhenemista, säädellä lipidien aineenvaihduntaa ja lievittää lipotoksisia vaurioita suoliston epiteelisoluissa [15].

Vaikka CDP:iden suolistoa suojaavat vaikutukset on osoitettu, on edelleen epäselvää, parantavatko ne suoliston ikääntymistä estämällä NLRP3-tulehdusreittiä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on tutkia mekanismia, jolla CDP:t estävät NLRP3-tulehdusaktivaatiotaparantaa suoliston ikääntymistä.

Materiaalit

 

1.1 Koeeläimet

Viisikymmentä tervettä urospuolista C57BL/6J-hiirtä (10 2 kuukauden iässä; 40 20 kuukauden iässä) ostettiin Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd:ltä. Tuotantolisenssi: SYXK (Peking) 2023-0011. Eläimiä pidettiin esteympäristössä Hebein provinssin perinteisen kiinalaisen lääketieteen sairaalan Experimental Animal Facilityssä seuraavissa olosuhteissa: lämpötila 22 ± 2 astetta, suhteellinen kosteus 50 % ± 10 % ja 12 tunnin valo/12 tunnin pimeysjakso. Kaikki hiiret totutettiin 1 viikon ajan. Tämän tutkimuksen hyväksyi Hebein provinssin perinteisen kiinalaisen lääketieteen sairaalan Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-HPHCM-2025001).

 

1.2 Instrumentit ja reagenssit

 

Kryostaatti (Thermo Fisher; CryoStar NX50)

Laserpyyhkäisykonfokaalinen mikroskooppi (Nikon; AX)

Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Thermo Fisher; 7500)

Monimuotoinen levylukija (Tecan; Spark)

Beeta-nikotiiniamidimononukleotidi (Bontac, Kiina; luettelo BT05N120A005)

SA- -gal värjäyssarja (Solarbio, Peking; Cat. 250003003)

Hiiren LPS ELISA -pakkaus (CUSABIO/Huamei, Wuhan; Cat. CSB-E13066m)

TransZol Up Plus RNA -pakkaus (TransGen Biotech, Peking; Cat. ER501-01-V2)

MonAmp ChemoHS qPCR Mix (Monad; Cat. MQ00501S)

Lgr5-polyklonaalinen vasta-aine (Wuhan Sanying; Cat. 30007-1-AP)

ZO-1 monoklonaalinen vasta-aine, monoklonaalinen NLRP3-vasta-aine, monoklonaalinen kaspaasi-1-vasta-aine, monoklonaalinen ASC-vasta-aine, monoklonaalinen GAPDH-vasta-aine, monoklonaalinen Ki67-vasta-aine (Abcam; Cats. ab307799, ab263899, ab263899, ab263899, ab179,08, ab179,08 ab15580)

menetelmät

 

2.1 Cistanche deserticola -polysakkaridien valmistus

Cistanche-materiaalia (50 g) uutettiin kahdesti keittämällä 8-kertaisella tilavuudella vettä, 1 tunti kullakin kerralla. Suodattimet yhdistettiin ja jäähdytettiin huoneenlämpötilaan. Vedetöntä etanolia lisättiin loppupitoisuuteen 80 % saostusta varten. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti heitettiin pois. Sakka liuotettiin veteen, dialysoitiin, sitten lyofilisoitiin näytteen saamiseksi.

 

2.2 Eläinten ryhmittely ja hallinta

Sopeutuksen jälkeen neljäkymmentä 20 kuukauden ikäistä C57BL/6J-hiirtä jaettiin satunnaisesti: luonnollisen ikääntymisen ryhmään, pienen annoksen CDP-ryhmään (2,5 g · kg–1), suuren annoksen CDP-ryhmään (5,0 g · kg–1) ja NMN-ryhmään (200 mg · kg–1). Kymmenen ylimääräistä 2 kuukauden ikäistä SPF C57BL/6J -hiirtä toimi nuorena kontrolliryhmänä. Pienet ja korkeat CDP-annokset annettiin suun kautta letkuruokinnalla 2,5 g·kg-1 ja 5,0 g·kg-1. Kun käytetään kehon pinta-alan muuntamista ja ihmisen ja hiiren välistä muuntokerrointa 12 [16], nämä vastaavat noin 1x ja 2x aikuisen kliinistä ekvivalenttiannosta. NMN-ryhmä sai NMN:ää 200 mg·kg-1 letkulla. Nuoret kontrolliryhmät ja luonnolliset ikääntymisryhmät saivat yhtä suuret määrät fysiologista suolaliuosta (10 ml·kg-1). Hoitoja annettiin jatkuvasti 2 kuukauden ajan.

 

2.3 Pakasteiden valmistus

Hiiret nukutettiin intraperitoneaalisella natriumpentobarbitaali-injektiolla (30 mg·kg-1) ja lopetettiin. Vatsa avattiin nopeasti, suoliliepe erotettiin ja sykkyräsuolen kudos kerättiin ja leikattiin 5 μm:n pituudelta pakasteleikkeitä varten [17].

 

2.4 SA- -gal-määritys suoliston -galaktosidaasiaktiivisuuden määrittämiseksi

Värjäys suoritettiin SA- -gal Kitin ohjeiden mukaan. Inkuboinnin jälkeen värjäysliuos poistettiin ja leikkeet pestiin PBS:llä. Kuvat kerättiin käänteisellä mikroskoopilla.

 

2.5 Reaaliaikainen PCR vanhenemiseen liittyvälle eritysfenotyypille (SASP)

Kokonais-RNA ileaalikudoksesta uutettiin käyttämällä TransZol Up Plus -pakkausta. Käänteistranskriptio suoritettiin GoScript-järjestelmällä seuraavissa olosuhteissa: 42 astetta 15 minuuttia, 70 astetta 15 minuuttia, 4 astetta 10 minuuttia. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä MonAmp ChemoHS qPCR Mixiä seuraavalla syklillä: 95 astetta 10 min; sitten 40 sykliä 95 astetta 15 s, 60 astetta 1 min. Sulamiskäyrä: 95 astetta 15 s, 60 astetta 15 s, 95 astetta 15 s. GAPDH toimi sisäisenä referenssinä, ja suhteellinen kvantifiointi käytti 2^-ΔΔCt-menetelmää. Pohjamaalit ostettiin Promegalta. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa 1.

 

2.6 Immunofluoresenssivärjäys ZO-1-ilmentymistä varten

Ileaalikudos kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä ja leikattiin parafiinilla 5 μm:n kohdalla. Leikkeet permeabilisoitiin 0,3 % Tritonilla X-100 15 minuutin ajan ja estettiin 10 % vuohen seerumilla 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Primääristä vasta-ainetta ZO-1 (1:200) vastaan ​​levitettiin yön yli 4 asteessa. PBS-pesujen jälkeen Cy3-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1:500) inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa pimeässä. Tumat vastavärjättiin DAPI:lla 5 minuutin ajan. Objektilasit kiinnitettiin haalistumista estävällä väliaineella ja kuvattiin konfokaalimikroskopialla. Fluoresenssin intensiteetti määritettiin käyttämällä Image-Pro-ohjelmistoa.

2.7 Immunohistokemia Ki67- ja Lgr5-ilmentymiselle

Ileal sections were incubated with primary antibodies Ki67 (1:1000) and Lgr5 (1:200) overnight at 4 ℃ following the IHC kit protocol, then with corresponding secondary antibodies. DAB was used for chromogenic development. Results were observed by light microscopy. Mean optical density was quantified using Image-Pro software.

 

2.8 ELISA LPS-tasoille

Standardit ja näytteet (100 µl per kuoppa) lisättiin levylle ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 1,5 tuntia. Sitten lisättiin HRP-konjugoitua streptavidiiniliuosta (100 µl per kuoppa) ja inkuboitiin 30 minuuttia. Substraatti lisättiin valolta suojatuissa olosuhteissa ja sen annettiin reagoida 30 minuuttia. Reaktio lopetettiin pysäytysliuoksella ja absorbanssi mitattiin 450 nm:ssä.

 

2.9 Western blot NLRP3:lle, Caspase-1:lle ja ASC:lle

Noin 30 mg sykkyräsuolen kudosta jauhettiin nestetypessä. RIPA-lyysipuskuria, joka sisälsi proteaasi/fosfataasi-inhibiittoreita, lisättiin; lysaatteja inkuboitiin jäillä 30 minuuttia ja sentrifugoitiin 12 000 x g, 4 astetta 15 minuutin ajan supernatanttien keräämiseksi. Proteiinipitoisuus määritettiin BCA-määrityksellä ja säädettiin arvoon 2 ug/μl. Samat määrät proteiinia (20-40 ug) erotettiin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille. Kalvot estettiin 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla 1 tunnin ajan huoneenlämmössä, inkuboitiin primaaristen vasta-aineiden kanssa (NLRP3 1:1000, Kaspaasi-1 1:500, ASC 1:1000) yön yli 4 asteessa, sitten HRP-konjugoidulla sekundaarisilla vasta-aineilla 501 h00 huoneenlämpötilassa. TBST-pesujen jälkeen signaalit kehitettiin. Kaistan intensiteetit normalisoitiin GAPDH:ksi.

 

2.10 Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± standardipoikkeama. Tilastollinen analyysi ja kuvaaja suoritettiin käyttämällä SPSS 26.0:aa ja GraphPad Prism 8.0.2:ta. Yksisuuntaista ANOVAa käytettiin ryhmien välisten erojen arvioimiseen, mitä seurasi Tukeyn post hoc -testi. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin arvoon P < 0,05.

 

Käytännön muistiinpanoja lukijoille, jotka ovat kiinnostuneita suolen motiliteettista ja ravintolisien kehittämisestä

 

Cistanche deserticolan toiminnallinen painopiste: Perinteisesti käytetty suoliston kostuttamiseen ja ummetuksen lievittämiseen; moderni data tukee estetukea, tulehduksen modulaatiota (TLR4/NF-κB) ja mitokondrioiden toimintaa AMPK/SIRT1:n kautta.

Mahdollista ikääntymistä estävää suoliston mekanismia tutkitaan tässä: NLRP3-tulehdusaktivaation tukahduttaminen; LPS:n aiheuttaman matala-asteisen tulehduksen vähentäminen; tiiviiden risteysten säilyttäminen (esim. ZO-1); epiteelin proliferaatio-/varsimarkkerien ylläpito (Ki67, Lgr5).

Tyypilliset kokeelliset suun kautta annettavat annokset hiirille: 2,5–5,0 g·kg–1 CDP:tä 2 kuukauden ajan; NMN 200 mg·kg-1 positiivisena kontrollina.

Käännösvaroitus: Hiiren annokset eivät ole suoria ihmisille annettuja suosituksia. Tutkimuksessa käytetään kehon pinta-alan skaalausta; Ihmisiä vastaava formulaatio ja turvallisuus, identiteettitestaus ja GMP-valmistus ovat välttämättömiä ennen tuotekehitystä.