Keniasta peräisin olevien luonnonvaraisten Cistanche-kasvien lajien tunnistus ja kemiallisen koostumuksen analyysi

Abstrakti:Tässä tutkimuksessa käytettiin kasvien morfologiaa, histologiaa ja DNA:n viivakoodaustekniikoita luonnonvaraisten Cistanche-lajien tunnistamiseksi Keniassa. Tärkeimpien aktiivisten komponenttien, mukaan lukien fenyylietanoidiglykosidit, sokerialkoholit ja betaiini, pitoisuudet Keniasta peräisin olevassa luonnonvaraisessa Cistancessa määritettiin HPLC-menetelmällä. Samalla tehtiin sormenjälkianalyysi. Tulokset osoittivat, että Keniasta kerätty villi Cistanche-kasvi tunnistettiin nimellä Cistanche senegalensis (Reut.) Beck. Aktiivisten aineiden sisällöt, kutenekinakosidi,cistanosidi A, akteosidi, isoakteosidi, ja 2'-asetyylilakteosidi C. senegalensiksessa Keniasta olivat alhaisempia kuin kotimaisessa C. tubulosassa, mutta korkeammat kuin kotimaisessa C. deserticolassa. Betaiinipitoisuus oli samanlainen kuin kotimaisessa C. deserticolassa, mutta se ei sisällä glukoosia. Sormenjäljen ominaisuudet ovat samankaltaisempia kuin kotimaisen C. tubulosan. Tämä tutkimus tarjoaa perustan resurssien suojelulle, Cistanchen luonnonvarojen syvälliselle tutkimukselle ja kehittämiselle Keniassa.

Avainsanat: Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Kenia; lajien tunnistaminen; DNA-viivakoodaus; sisällön määrittäminen

 

 

 

Cistanche deserticolaYC Ma

 

Cistanche, perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä arvostettu yrtti, viittaa kuivattuihin, hilseileviin, meheviin aavikkokasvien varsiin, kuten esim.Cistanche deserticolaYC MajaCistanche tubulosa(Schenk) Wight, molemmat kuuluvat Orobanchaceae-perheeseen. Cistanchea on tunnettu kyvystään vahvistaa munuaisyangia, ravita esanssia ja verta sekä kostuttaa suolistoa ummetuksen lievittämiseksi, ja sitä on juhlittu kiinalaisissa yrttiteksteissä vuosisatojen ajan. Sen varhaisin lääketiede esiintyy muinaisessa klassikossaShennongin Materia Medican klassikko, jossa Cistanche on luokiteltu "ylimmän luokan" yrtteeksi. Historian aikana lukuisat perinteiset lääketieteelliset tekstit ovat dokumentoineet Cistanchen voimakkaat edut ja ansainneet sille arvostetun lempinimen "Aavikon ginseng".

Cistanchen monipuoliset farmakologiset vaikutukset johtuvat sen bioaktiivisten yhdisteiden valikoimasta. Niistä fenyylietanoidiglykosidit ovat tärkeimmät aktiiviset aineet, jotka ovat vastuussa Cistanchen munuaisia ​​vahvistavista ja luuydintä ravitsevista vaikutuksista. Näillä yhdisteillä, kuten ekinakosidilla ja akteosidilla, on hermostoa suojaavia, dementiaa ehkäiseviä, ikääntymistä estäviä ja hepatoprotektiivisia vaikutuksia. Erityisesti ekinakosidi ja akteosidi ovat kaksi vertailuyhdistettä, joita käytetään Cistanchen laadunvalvonnassa Kiinan farmakopean vuoden 2020 painoksen mukaisesti. Lisäksi Cistanchen laksatiivinen vaikutus johtuu pääasiassa sen oligosakkaridialkoholikomponenteista, mukaan lukien betaiini, mannitoli, fruktoosi, glukoosi ja sakkaroosi. Nämä viisi komponenttia tunnustetaan laajalti indikaattoreina Cistanchen kyvystä kostuttaa suolistoa ja edistää suolen toimintaa.

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight

Kiinassa tärkeimpiä Cistanche-lajeja ovat mmCistanche deserticolaYC Ma,Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight,Cistanche salsa(CA Mey.) G. jaCistanche sinensisG. Beck. Nämä lajit ovat kotoisin sellaisista alueista kuin Sisä-Mongolia, Ningxia, Gansu ja Xinjiang. Luoteis-Kiinan lisäksi Cistanche-lajeja esiintyy myös Euraasian kuivilla ja aavikkoalueilla sekä Pohjois- ja Itä-Afrikassa, mukaan lukien Iran, Afganistan, Kenia, Pakistan ja Mongolia.

Itä-Afrikassa sijaitseva ja päiväntasaajaa hajallaan oleva Kenia koostuu enimmäkseen ylängöistä, joiden keskikorkeus on 1 500 metriä, mutta sen pohjoiset alueet ovat autiomaa tai puoliaavikko. Kenian alkuperäiskansoilla on pitkä historia lääkekasvien parantamisessa. Alueella on runsaasti lääkekasveja – esimerkiksi uutteita hammasharjapuun kuoresta ja juurista (Salvadora persicaL.) tunnetaan anti-inflammatorisista ja antibakteerisista ominaisuuksistaan, ja niitä käytetään usein hammassärkyjen ja infektioiden hoitoon. santelipuun kuori (Osyris lanceolataHochst. & Steud.) käytetään ripulin hoitoon, kun taas Maasai-nokkosen keitteitä (Urtica massaicaMildbr.) lehtiä käytetään vatsakipuihin. Tämä rikas perinne on edistänyt elinvoimaista lääkekasvikulttuuria, mutta taloudellisen kehityksen haasteiden vuoksi näiden lääkekasvien käyttöä ei ole täysin dokumentoitu tai tutkittu systemaattisesti.

Mielenkiintoista on, että Cistanche-lajeja pidetään usein rikkakasvina Afrikassa, eivätkä ne ole saaneet paljon huomiota tai tutkimusta. Itse asiassa Afrikan Cistanchesta ei ole juuri julkaistuja tutkimuksia. Vastauksena Itä-Afrikan yhteisön kuivien ja puolikuivien maiden aluekehitysosaston kutsuun tutkimusryhmämme suoritti kenttätutkimuksen Keniassa paikallisten Cistanchen resurssien tutkimiseksi. Keräsimme luonnonvaraisia ​​Cistanche-näytteitä, suoritimme kasvitieteellisen tunnistamisen ja analysoimme niiden ensisijaiset bioaktiiviset yhdisteet. Tavoitteena oli ymmärtää Kenian Cistanchen lajien monimuotoisuutta ja kehityspotentiaalia sekä luoda tieteellinen perusta näiden arvokkaiden aavikkokasvien jatkotutkimukselle ja hyödyntämiselle.

Cistanche tubulosa kuivattu koko juuri Myynti Kiinassa

Whatsapp meiltä saadaksesi lisätietoja

 

 

Materiaalit ja menetelmät

Kasvimateriaalit

Keniasta peräisin olevat Wild Cistanche -näytteet keräsivät elokuussa 2023 professorit Pengfei Tu ja Yong Jiang School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Kajiado, Kenia (01 astetta 50'01"S; 36 astetta 47'00"E). Kaksi villiä Cistanche-kasvia kerättiin ja leimattiin K1 ja K2 sekä niiden isäntäkasvin juuret (katso kuva 1). Isäntäkasvin tunnisti Kennedy Matheka, East African Herbariumin, Kenian kansallismuseon tutkimusavustaja.Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz, joka kuuluu Amaranthaceae-heimoon. NäytteitäCistanche deserticolajaCistanche tubulosakerättiin Turpanin kaupungista ja Yutianin maakunnasta Xinjiangin Uygurin autonomisella alueella, ja professori Pengfei Tu totesi ne tuoreiksi meheviksi varreksi.Cistanche deserticolaYC Ma jaCistanche tubulosa(Schrenk) Wight. Kaikki kuponkinäytteet säilytetään laboratoriossamme.

Instrumentit

Waters Arc HPLC-järjestelmä

Quintix125D-1CN elektroninen vaaka (Sartorius, Peking)

Olympus BX-50 optinen mikroskooppi (Olympus, Japani)

NanoZoomer-SQ panoraamadiakuvaskanneri (Hamamatsu Photonics, Japani)

KQ500DE digitaalinen ultraäänipuhdistin (Kunshan Ultrasonic Instruments, Kiina)

MM400 DNA-uuttohiomakone (Retsch, Saksa)

PCR-lämpösyklilaite (Analytik Jena, Saksa)

DYY-8C elektroforeesilaite ja -säiliö (Liuyi Instrument Factory, Peking)

MINI Space 1000 -geelikuvausjärjestelmä (Tanon, Shanghai)

Vakiolämpötilan inkubaattori (Yiheng, Shanghai)

Reagenssit

Ekinakosidi (erä: DST191008-038), akteosidi (DSTDL006101), isoakteosidi (DST210601-060), D-mannitoli (DSTDG006201) ostettiin yhtiöltä Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.; tubulosidi A (MUST-15040115), 2'-asetyylilakteosidi (MUST-15071504), betaiini (MUST-23082505), vedetön D-glukoosi (MUST-23030214), fruktoosi (MUST-23031403) ja sakkaroosi (MUST-23082505) hankittiin yhtiöltä Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd., PL-laatu, metanoli (HermoletriC, HPLC) OCEANPAK), muurahaishappo (HPLC-laatu, VOKA-reagenssit) olivat kaikki kromatografisesti puhtaita. Molekyylianalyysiin käytettiin kasvien genomisen DNA:n uuttopakkausta (DP305, Tiangen Biotech, Kiina) ja ultrapuhdasta vettä.

Mehevien varren osien valmistelu, värjäys ja tarkkailu

Viitteen [10] menetelmää noudattaen tuoreet Cistanchen mehevät varret leikattiin sopivan kokoisiksi ja säilytettiin FAA-kiinnitysaineessa (70 % etanoli: jääetikka: formaldehydi=90:5:5). Kun kudokset oli pesty juoksevalla vedellä kiinnitysaineen poistamiseksi, ne pehmennettiin fluorivetyhapolla, värjättiin safraniinilla, kuivattiin, upotettiin parafiiniin ja leikattiin. Asennuksen jälkeen objektilasit paistettiin, parafiini sulatettiin ja osat värjättiin 95-prosenttisella etanoli Fast Green -liuoksella ja suljettiin sitten neutraalilla hartsilla. Kudosmorfologiaa tarkkailtiin mikroskoopilla, ja hyvin muodostuneita leikkeitä skannattiin käyttämällä panoraamaskanneria korkearesoluutioisten kuvien saamiseksi.

DNA:n erottaminen, PCR-monistus ja sekvensointi

Cistanche-näytteistä ja isäntäkasvin juurista saatu kokonais-DNA uutettiin käyttämällä kasvin genomisen DNA:n uuttopakkausta (Tiangen) valmistajan ohjetta noudattaen. DNA-pitoisuudet ja OD260/OD280-suhteet mitattiin mikrotilavuus-UV-spektrofotometrillä laadun arvioimiseksi ennen jatkamista.

PCR-monistus kohdistui ribosomaalisen DNA:n sisäiseen transkriptoituun spacer 2 (ITS2) -alueeseen ja kloroplastin psbA-trnH-geeniin molekyylien tunnistamista varten [11]. Alukesekvenssit olivat seuraavat:

ITS2 eteenpäin: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'

ITS2 kääntöpuoli: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'

psbA-trnH eteenpäin: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'

psbA-trnH käänteinen: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'

PCR-reaktiot (25 µl) sisälsivät 12,5 µl 2× Taq Master Mixiä, 1 µl kumpaakin eteenpäin ja käänteistä aluketta (2,5 µmol·L⁻¹), 2 µl DNA-templaattia ja 8,5 µl ddH₂O. ITS2-vahvistus: 94 astetta 5 min; sitten 35–40 sykliä 94 astetta 30 s, 56 astetta 30 s, 72 astetta 45 s; lopullinen pidennys 72 asteessa 10 min. psbA-trnH-amplifikaatio: 95 astetta 4 min; 35 sykliä 94 astetta 30 s, 55 astetta 1 min, 72 astetta 1 min; lopullinen pidennys 72 asteessa 10 min. PCR-tuotteet analysoitiin geelielektroforeesilla, ja kohdejuovat alistettiin Sangerin kaksisuuntaiselle sekvensoinnille. Sekvenssikromatogrammit analysoitiin käyttämällä CodonCode Aligneria (v3.7.1, CodonCode Co., USA) kohde-DNA-sekvenssien saamiseksi, jotka tunnistettiin käyttämällä kiinalaista Materia Medica DNA -viivakoodijärjestelmää ja BLAST-analyysiä GenBank-tietokannassa. Fylogeneettiset puut rakennettiin MEGA X -ohjelmistolla lajien tunnistamista varten.

Viiden fenyylietanoidiglykosidin kvantitatiivinen määritys

Viiden fenyylietanoidiglykosidin pitoisuus määritettiin aiemmin vakiintuneiden menetelmien mukaisesti [13]. Vertailuliuosten valmistus: punnitaan tarkasti ekinakosidi, tubulosidi A, akteosidi, isoakteosidi ja 2'-asetyylilakteosidi ja liuotetaan 50-prosenttiseen metanoliin ennalta määrätyn pitoisuuden omaavan sekastandardiliuoksen valmistamiseksi. Kromatografiset olosuhteet: Phenomenex Luna C18 -kolonni (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); liikkuva faasi A: asetonitriili-metanoli (6:1, tilavuus:tilavuus); liikkuva faasi B: 0,1 % muurahaishappopuskuri; gradienttieluointi: 0–5 min, 10–18 % A; 5–15 min, 18–24 % A; 15–20 min, 24–26 % A; 20–28 min, 26–30 % A; 28–35 min, 30–35 % A. Virtausnopeus: 1,0 ml·min⁻¹; kolonnin lämpötila: 30 astetta; tunnistusaallonpituus: 330 nm. Menetelmä: ruiskuta 10 μl kutakin standardiliuosta ja näyteliuosta HPLC:hen analysointia varten.

Betaiinin, mannitolin, fruktoosin, glukoosin ja sakkaroosin kvantitatiivinen määritys

Näiden komponenttien määrä määritettiin aikaisempien menetelmien mukaisesti [14]. Vertailuliuokset: punnitaan tarkasti betaiini, mannitoli, fruktoosi, glukoosi ja sakkaroosi, liuotetaan veteen sekastandardiliuoksen valmistamiseksi. Näyteliuokset: laimenna Cistanchen näyteliuos (valmistettu kuten edellä) 50 % metanolilla 1/5 alkuperäiseen pitoisuuteen, sekoita hyvin ja suodata 0,22 μm:n mikrohuokoisen kalvon läpi. Kromatografiset olosuhteet: Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E-kolonni (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); liikkuva faasi: asetonitriili-vesi (77:23); virtausnopeus: 0,7 ml·min-1; kolonnin lämpötila: 25 astetta; ilmaisu haihdutusvalonsirontadetektorilla (ELSD): drift-putken lämpötila 100 astetta, kantokaasun virtaus 3 L·min⁻¹. Kvantitointi suoritettiin injektoimalla 5 µl ja 10 µl standardiliuoksia ja 5 µl näyteliuosta ja laskemalla sisältö käyttämällä ulkoista standardia kahden pisteen logaritmista yhtälöä.

Sormenjälkien samankaltaisuuden arviointi

Näyteliuokset valmistettiin edellä kuvatulla tavalla, ja HPLC-olosuhteet ja -menetelmät olivat samat kuin fenyylietanoidiglykosidin kvantifioinnin yhteydessä. Kromatografiset tiedot tuotiin "Perinteisen kiinalaisen lääketieteen kromatografiseen sormenjälkien samankaltaisuuden arviointijärjestelmään (2012 Edition)". Näytteen K1 kromatogrammia käytettiin vertailuna, ja viisi fenyylietanoidiglykosidipiikkiä oli merkitty monipistekorjausta varten, luoden päällekkäisiä ja vertailukromatogrammeja ja laskemalla sormenjälkien samankaltaisuutta.

 

 

Tulokset ja analyysi

1. Cistanchen morfologinen tunnistus

Keniassa kerätyillä luonnonvaraisilla Cistanche-näytteillä on erityisiä morfologisia ominaisuuksia. Kukinto on piikki, jossa on yksi pitkä soikea-lansolaattinen suojuslehti ja kaksi pientä varsilehteä, joiden molemmat puolet ovat kaljuja. Verhiö on putkimainen, ja sen kärjessä on viisi tylppä lohkoa. Terä on putkimainen, kampimainen, pituudeltaan 3–4 cm, noin 2,5 kertaa verhiön pituus, jossa on viisi lohkoa huipussa ja kaarevat reunat. Terä on väriltään keltainen (kuva 1A, B), muuttuu ruskeaksi kuivuessaan. Filamentit ovat noin 3 cm pitkiä, ja tyvessä on muutama hieno karva. Tyyli on hieman pidempi kuin heteet, ja leima on lähes pallomainen, sileä ja kalju. Heteitä on neljä, ja ponnet ovat pitkät, soikeat, jotka ovat tiheästi pitkien villakarvojen peitossa; ponnen pohja on äkillisesti terävä. Tämä ominaisuus on yhdenmukainen kuvausten kanssaCistanche deserticolajaCistanche salsa"Kiinan kasvistossa"; sen sijaan ponnen pohjaCistanche tubulosaon tylppä ja pyöreä, mikä erottaa sen selvästi muista saman suvun lajeista [7].

Lisäksi isäntäkasvi,Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz on paljon haarautunut pensas. Sen nuoret oksat ovat tiheästi vaaleankeltaisten tai valkoisten villakarvojen peitossa. Lehdet ovat leveästi spatuli-obovaaleja ja kapea pohja (kuva 1D, E). Kukinnot ovat tiiviisti ryhmittyneet kantapäätä pitkin, joka yhdessä kukinnan akselin kanssa on peitetty harmaanvalkoisilla tai vaaleanharmailla tai valkoisilla villakarvoilla.

Luonnonvaraisen Cistanchen mehukas varsi on litteä-sylinterimäinen, ja sen pinta on vaaleankeltainen tai ruskehtava, ja sen pinta on tiiviisti peitetty riveihin järjestetyillä neulamaisilla, mehevillä suomuilla. Rakenne on kiinteä, mutta hieman joustava (kuva 2A). Mehevän varren poikkileikkaus on vaaleankeltainen tai ruskehtava, ja paljaalla silmällä näkyy hajallaan vaaleanruskeita verisuonikimppuja (kuva 2B). Mikroskoopin alla verisuonikimput näyttävät munamaisilta tai fuusimuotoisilta, koostuvat ksyleemistä ja floeemista, esiintyvät usein yksittäisinä hajallaan kimpuina tai ryhmiteltyinä pareiksi tai kolmioksi, ja floeemi on suunnattu eri suuntiin (kuva 2C, D). Kiinan farmakopean vuoden 2025 painoksen mukaan poikkileikkausCistanche deserticolaon ruskehtava, ja siinä on vaaleanruskeita pistemäisiä verisuonikimppuja, jotka on järjestetty aaltoilevaan renkaaseen, muodostaen usein sisäpuolisen renkaan muotoisen nipun; sitä vastoinCistanche tubulosanäyttää hajallaan olevia pistemäisiä verisuonikimppuja, mikä on keskeinen erottava piirre näiden kahden tyyppisten Cistanche-viipaleiden tunnistamisessa [1]. Keniasta peräisin olevan villin Cistanchen poikkileikkauksessa on myös hajallaan olevia pistemäisiä verisuonikimppuja, jotka ovat yhdenmukaisiaCistanche tubulosa.

 

 

Kuva 2 Luonnonvaraisen Cistanche-kasvin (K2) ulkonäkö ja poikkileikkausominaisuudet Keniassa. V: Varren ulkonäkö; B: mehevän varren poikkileikkaus; C: Mehevän varren parafiiniosa (safraniinin nopea vihreä värjäytyminen); D: Suurennettu kuva verisuonikimppusta parafiiniosassa