Aromikomponenttien ja erilaisten aineenvaihduntatuotteiden analyysi Cistanche Musalais'ssa GC-MS:n ja metabolomiikan perusteella
Nov 28, 2025
Abstrakti:Tässä tutkimuksessa valmistettiin Cistanche Musalais perinteisillä tekniikoilla Xinjiang Hetianin punaisista rypäleistä ja vaihtelevista Cistanche-lisäyksistä. Optimaaliset käsittelyolosuhteet määritettiin yksisuuntaisella ANOVA:lla. Aromikomponenttien ja erilaisten metaboliittien analysointiin käytettiin GC–MS:tä ja kohdentamatonta metabolomiikkaa, ja aktiiviset aineosat, kuten kokonaisflavonoidit ja kokonaispolyfenolit, määritettiin. Optimaaliset olosuhteet olivat: alkusokeripitoisuus 32 astetta Bx, käymislämpötila 25 astetta ja 7 % Cistanche deserticolan lisäys. Näissä olosuhteissa alkoholipitoisuus, kokonaishappamuus, kokonaisflavonoidit ja kokonaispolyfenolit saavuttivat vastaavasti (12,6 ± 0,6) tilavuus-%, (3,82 ± 0,19) g/l, (0,80 ± 0,01) g/l ja (0,60 ± 0,00) g/l. GC-MS havaitsi 38 aromiyhdistettä, joista esterit olivat runsain luokka (24 yhdistettä), jota seurasivat 6 alkoholia, 2 ketonia ja 2 aldehydiä. Verrattuna yksinomaan rypälemehusta valmistettuun Musalaisiin Cistanche deserticola Musalais osoitti merkittävästi enemmän keskeisiä estereitä, mukaan lukien etyyliasetaatti (6,42 % vs. 2.42 %) ja etyylipalmitaatti (3,75 % vs. 1.18 %), kun taas korkeammat alkoholit, kuten isobutanoli, vähenivät huomattavasti (2.{1} % vs. 2,1} %). Metabolomiikka tunnisti 230 erilaista metaboliittia (VIP suurempi tai yhtä suuri kuin 1, P < 0,05), jotka olivat rikastuneet ABC-kuljettajiin ja aminohappojen biosynteesiin liittyvillä reiteillä. Komponentit, kuten trigonelliini ja krosiini, olivat merkittävästi koholla. Aminohappoaineenvaihdunta vaikutti tyypillisen makuprofiilin muodostumiseen. Tämä tutkimus tarjoaa teoreettisen ja teknisen perustan Cistanche Musalaisin kehittämiselle ja laadun parantamiselle. Tulevaisuuden tutkimukseen tulisi sisällyttää molekyylisensorisia tekniikoita, kuten GC-O, jotta voidaan paremmin tunnistaa keskeiset aktiiviset yhdisteet, jotka ovat vastuussa yleisestä makuprofiilista.
Avainsanat: Cistanche;Musalais; GC-MS; metabolomiikka
CistancheMusalais
Cistanche Musalais -listauksen tiedot
Musalais (Msalais)on perinteinen, Xinjiangille ainutlaatuinen fermentoitu juoma, joka on valmistettu punaisista Awati-rypäleistä tai Hetian (Hotan) punaisista rypäleistä. Se valmistetaan mehustamalla, väkevöimällä ja spontaanilla käymisellä, ja sitä luonnehditaan primitiiviseksi, luonnolliseksi ja vihreäksi. Ainutlaatuisena kiinalaisena luonnollisesti käymisenä alkoholipitoisena juomana Musalaisilla on selkeitä alueellisia piirteitä aistinvaraisissa ominaisuuksissa, ravintoarvossa ja toiminnallisissa toimissa. Käymisen aikana syntyvät alkoholit, esterit, aldehydit, hapot, fenolit ja terpeenit eivät ainoastaan anna ainutlaatuista makua, vaan niihin liittyy myös etuja, kuten verenkiertoa edistävä, veren lipidien alentaminen, munuaisten virkistys ja kehon vahvistaminen, kolesterolin säätely sekä sydämen ja aivoverenkierron terveyden ylläpitäminen, joten se sopii eri-ikäisille kuluttajille [1].
Viime vuosina terveellisten juomien kuluttajakysynnän kasvaessa funktionaalisten juomien markkinat ovat laajentuneet nopeasti. Perinteisen panimon pohjalta funktionaaliset liköörit sisältävät erityisiä toiminnallisia komponentteja, jotka vastaavat hyvinvoinnin, terveyden ylläpidon tai tietyn fysiologisen säätelyn tarpeita. Niiden laatuun vaikuttavat raaka-aineet, prosessit, mikrobiyhteisöt ja toiminnallisten komponenttien stabiilisuus [2]. Eteläisen Xinjiangin kansankäytännössä paikallisia lisäaineita, kuten goji-marjaa, saflori, Cistanche ja sahrami, lisätään usein Musalaisin valmistuksen aikana parantamaan terveyshyötyjä ja rikastuttamaan makujen monimuotoisuutta [3]. Näistä Cistanchella, joka sisältää runsaasti polysakkarideja, aminohappoja, fenyylietanoidiglykosideja, iridoidiglykosideja ja alkaloideja, on tonisoiva vaikutus munuaisten yangiin, se moduloi neuroendokriinista toimintaa ja taistelee väsymystä vastaan, mikä ansaitsee nimen "aavikon ginseng" [4–5].
Cistanche Musalais'n teollistuminen kohtaa kuitenkin tällä hetkellä haasteita, kuten tuotantostandardien puute, epätäydellinen prosessointiteknologia ja riittämätön makuaineiden tutkimus, mikä rajoittaa sen markkinoiden edistämistä ja laadun parantamista. Tässä tutkimuksessa Cistanchea käytettiin apuaineena Musalais'n käymisprosessin optimoinnissa. GC–MS:ää ja kohdentamatonta metabolomiikkaa käytettiin aromin ainesosien ja erilaisten metaboliittien systemaattiseen selvittämiseen. Tavoitteena oli tarjota teoreettinen perusta ja tekninen tuki Cistanche Musalaisin standardoidulle tuotannolle, maun moduloinnille ja toiminnallisuuden parantamiselle, mikä edistää tämän perinteisen juoman modernisointia ja arvon kehittämistä.
1 Materiaalit ja menetelmät
1.1 Materiaalit ja reagenssit
Cistanche tubulosa (putkimainen Cistanche): ykkösluokan kaupalliset näytteet, jotka on hankittu Hetianista (Hotan), Xinjiangista, täyteläinen rakenne ja vapaa homeesta ja epäpuhtauksista.
Hetianin punaiset viinirypäleet: kaupalliset hedelmät, joilla on ehjä ulkonäkö ja voimakas tuoksu, peräisin Hetianista, Xinjiangista.
Metanoli ja asetonitriili: Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
Muurahaishappo: TCI (Shanghai) Development Co., Ltd.
L-2-kloorifenyylialaniini: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Välineet ja laitteet
08-2T vakiolämpötilainen magneettisekoitin, Shanghai Meiyingpu Instrument Co., Ltd.
57330-U SPME-laite ja 57348-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME-kuitu, Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.
6890N-5973 GC–MS-järjestelmä, Agilent Technologies (China) Co., Ltd.
5430R jäähdytetty sentrifugi, Eppendorf (Shanghai) International Trading Co., Ltd.
TL-48R suuritehoinen pehmopaperihiomakone, Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.
SCIENTZ-1LS-tyhjiökonsentraattori, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.
Vanquish Flex UHPLC, Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
SDAJ-0.5 Kiinalaistyylinen viinin tuotantolinja, Shandong Anji Bio-Fermentation Equipment Technology Co., Ltd.
1.3 Koemenetelmät
1.3.1 Prosessikulku
Cistanche höyrytettiin myöhempää käyttöä varten. Hetianin punaiset rypäleet pestiin ja valikoitiin, kuorittiin ja murskattiin. Rypälemehu uutettiin puristimella, sitten kuumennettiin ja väkevöitiin mehupitoisuuden indikaattoreiden säätämiseksi. Lopuksi höyrytetty Cistanche-tuote sekoitettiin tiivistetyn viinirypälemehun kanssa ja käytettiin kontrolloiduissa lämpötila- ja aikaparametreissa. Fermentoinnin jälkeen tuote kirkastettiin, jolloin saatiin Cistanche Musalais.
1.3.2 Cistanchen valmistus
Pienillä muutoksilla Gong et al. [6], korkealaatuinen, pilaantumaton kuivattu Cistanche kuorittiin, viipaloitiin, käärittiin sideharsoon ja höyrytettiin 20 minuuttia myöhempää käyttöä varten.
1.3.3 Rypälemehun valmistus
Käytettiin Hetian-punaisia rypäleitä, joiden liukoisen kiintoaineen (sokeri) alkuarvo oli 18 astetta Bx. Mädät, huonokuntoiset ja epätasaisesti kypsyneet viinirypäleet poistettiin. Pesun ja kuorimisen jälkeen viinirypäleet puristettiin. Mehu keitettiin (väkevöitiin) korkeassa lämpötilassa ja väkevöinti lopetettiin, kun sokeri saavutti 26, 29 tai 32 astetta Bx. Mehu jäähdytettiin huoneenlämpöön myöhempää käyttöä varten.
1.3.4 Cistanche Musalais'n käymisprosessi
Höyrytetty Cistanche lisättiin määritellyissä suhteissa (3 %, 5 %, 7 %) 600 ml:aan väkevää rypälemehua fermentorissa. Jäännössokeri mitattiin 24 tunnin välein fermentaation aikana edistymisen seuraamiseksi. Kun jäännössokeri putosi 4 g/l:aan, käyminen lopetettiin. Supernatantti kerättiin ja pastöroitiin 85 asteessa 30 minuutin ajan, jolloin saatiin Cistanche Musalais.
1.3.5 Yhden tekijän kokeellinen suunnittelu Cistanche Musalaisille
Cistanchen lisäyksen (3 %, 5 %, 7 %), alkusokeripitoisuuden (26, 29, 32 astetta Bx) ja käymislämpötilan (22, 25, 28 astetta) vaikutuksia fysikaalis-kemiallisiin ominaisuuksiin ja bioaktiivisuuteen tutkittiin.
1.3.6 Analyysit ja mittaukset
Alkoholipitoisuus, liukoiset kuiva-aineet ja kokonaishappopitoisuus: määritetty GB/T 15038-2006 "Yleiset analyysimenetelmät viinille ja hedelmäviinille" mukaisesti.
Flavonoidit yhteensä: määritetty viittaamalla Xu et ai. [7]. Kalibrointikäyrä valmistettiin rutiinikonsentraatiolla (X) abskissalla ja absorbanssilla (Y) 510 nm:ssä ordinaatalla, jolloin saatiin Y=0.8043X − 0,0278, R2=0.9999, mikä osoittaa hyvää lineaarisuutta.
Polyfenolien kokonaismäärä: määritetty käyttämällä Folin–Ciocalteu-menetelmää [8]. Kalibrointikäyrä valmistettiin gallushapon pitoisuuden (X) abskissana ja absorbanssin (Y) aallonpituudella 760 nm ordinaattana, jolloin saatiin Y=0.4177X + 0.1048, R2=0.9975, mikä osoittaa hyvää lineaarisuutta.
1.3.7 GC-MS-analyysi
Näytteille kahdesta ryhmästä - kokeellinen (32 astetta Bx, 25 astetta, 7 % Cistanchea) ja kontrollista ilman Cistanchea - suoritettiin GC-MS.
Näytteen esikäsittely: Näyte laitettiin 20 ml:n uuttopulloon; 100 µl 50 ug/ml isoamyylifenyyliasetaattia lisättiin sisäiseksi standardiksi. Pullo suljettiin ja tasapainotettiin 60-asteisessa vesihauteessa magneettisekoituksella 250 r/min 20 minuutin ajan. SPME-kuitu lisättiin sitten 30 minuutin uuttoon. Ennen käyttöä SPME-kuitua käsiteltiin GC-sisääntulossa 250 asteessa 20 minuutin ajan.
GC–MS-olosuhteet: HP-INNOWax-kolonni (60 m × 250 μm × 0,25 μm); sisääntulo 250 astetta; siirtolinja 250 astetta; kantokaasun virtaus 1,5 ml/min; jako 4:1. Uunin ohjelma: 40 astetta (5 min), ramppi 5 astetta/min 250 asteeseen, pito 10 min. Ionilähde 230 astetta; kvadrupoli 150 astetta; EI 70 eV; täysi skannaus 35–550 Da.
1.3.8 Kohdistamaton metabolomiikka
1.3.8.1 Näytteen valmistelu
Kaksi ryhmää testattiin: kokeellinen (32 astetta Bx, 25 astetta, 7 % Cistanchea) ja kontrolli ilman Cistanchea; n=3 biologista toistoa ryhmää kohden, yhteensä 6 näytettä. Sulatuksen ja vorteksoinnin jälkeen 300 µl kutakin näytettä siirrettiin 1,5 ml:n putkeen ja sentrifugoitiin nopeudella 12 000 r/min, 4 astetta 15 minuutin ajan. Sitten 100 µl supernatanttia siirrettiin 2 ml:n putkeen, pikajäädytettiin nestetypessä ja lyofilisoitiin. Lisää 1 ml esijäähdytettyä metanoli:asetonitriiliä (1:1, tilavuus/tilavuus), vorteksoi 30 s; pakasta -20 asteessa 30 minuuttia; sentrifugoi nopeudella 12 000 r/min, 4 astetta 10 minuuttia; Kerää 850 µl supernatanttia ja tyhjiökuivaa täydellisesti; liuotetaan 150 µl:aan 50 % metanolia (jossa on 5 ppm 2-kloorifenyylialaniinia), sekoita 30 s; sentrifugoi 12 000 r/min, 4 astetta 10 minuuttia; suodata 0,22 μm:n kalvon läpi ja siirrä suodos injektiopulloihin. Yhdistä 10–20 μl jokaisesta näytteestä QC-näytteen luomiseksi instrumentin vakauden ja tietojen luotettavuuden arvioimiseksi; QC jätetään pois, jos mukana on vähemmän kuin 5 näytettä.
1.3.8.2 Analyyttiset olosuhteet
Kromatografia: ACQUITY UPLC HSS T3 -kolonni (100 Å, 1,8 μm, 2,1 mm × 100 mm); virtaus 0,4 ml/min; pylväs 40 astetta; automaattinen näytteenottolaite 8 astetta; injektio 2 μl. Liikkuva faasi A: vesi, jossa on 0,1 % (v/v) muurahaishappoa; liikkuva faasi B: asetonitriili 0,1 % (v/v) muurahaishapolla.
Massaspektrometria: suihkujännite +3.5 kV/−3,0 kV; vaippakaasu 40 arb; apukaasu 10 arb; kapillaari 320 astetta; apukaasun lämpötila 300 astetta; MS1-resoluutio 60 000; skannausalue m/z 70–1 000; AGC Target Standard; Max IT 100 ms; tiedoista riippuvainen MS/MS 4 ylimmän ionin päällä dynaamisella poissulkemisella 4 s; MS2-resoluutio 15 000; HCD törmäysenergia 30%.
1.3.8.3 Metaboliitin tunnistaminen
Metaboliitin tunnistaminen perustui PSNGM:ään (PerSonalbio Next-Generation Metabolomics Database), joka sisälsi talon sisäisen standardikirjaston, mzCloud (https://www.mzcloud.org/), LIPID MAPS (https://www.lipidmaps.org/), HMDB (https://hmdb.ca/), Moadaucehn (https://hmdb.ca/), Moadaucehn.fi. NIST_2020_MSMS ja tekoälyn ennustama MS/MS-spektrikirjasto.
Huomautus huomautuksessa käytetyistä ulkoisista tietokannoista:
HMDB: Kattava ihmisen aineenvaihduntatietokanta (versio 5.0), joka sisältää yksityiskohtaisia kemiallisia, kliinisiä ja biokemiallisia tietoja 220 945 metaboliitista, laajat ristilinkit KEGG:hen, PubChemiin, MetaCyciin, ChEBI:iin, PDB:hen, UniProtiin ja GenBankiin ja tukee kehittynyttä teksti-/sekvenssi-/NMR-hakua. Liittyy myös DrugBankiin, T3DB:hen, SMPDB:hen ja FooDB:hen.
LIPID MAPS: An open-access lipidomics resource providing databases (e.g., LMSD with >50 000 kuratoitua lipidirakennetta), spektrit, reitit, työkalut MS-analyysiin, rakenteen piirtämiseen ja nimikkeistö-/luokitusresurssit.
mzCloud: Edistyksellinen massaspektrikirjasto, joka tukee spektri-, rakenne-, ali-, puu- ja m/z-pohjaisia hakuja, 32 330 yhdistettä, 51 002 spektripuuta ja 16 531 567 spektriä (huomattavia lisäyksiä vuonna 2024), optimoitu Firefox/Chrome-työpöytäkäyttöön.
1.3.8.4 Monimuuttujatilastollinen analyysi
Kuudesta näytteestä saatuihin metaboliittitietoihin sovellettiin monimuuttujaanalyysejä PCA:n suorittamiseksi, mikä selvensi aineenvaihdunnan eroja Cistanche Musalaisin ja Musalaisin välillä. Erilaiset metaboliitit ryhmien välillä seulottiin käyttämällä OPLS-DA:n vaihtelevaa merkitystä projektiossa (VIP), kertamuutoksia ja P-arvoja (VIP-kynnys ja merkitsevyys, kuten edellä), mitä seurasi biologinen tulkinta, mukaan lukien KEGG-reitin rikastaminen [9].
Viitteet
[1] Zhu LX, Wang LL, Song HZ, et ai. Laadullinen analyysi tärkeimmistä aromiyhdisteistä, jotka liittyvät perinteiseen Musalais-käsittelyyn Xinjiangissa Kiinassa. Journal of Institute of Brewing. 2012;118(2):236–242.
[2] Zhao B, Li DD, Yuan Y, et ai. Nykyaikainen tutkimus edistyy fermentoidussa funktionaalisessa nesteessä. Alkoholin valmistus. 2025;52(2):43–49.
[3] Zhu LX, Hou XJ, Xu Q. Keskustelu Xinjiang Msalais -rypäleviinin kehitysstrategioista. Alkoholinvalmistustiede ja teknologia. 2008(7):111–113.
[4] Song ZH, Lei L, Tu PF. Edistystä Cistanche Hoffingin kasvien farmakologisen aktiivisuuden tutkimuksessa. et Link. Perinteiset kiinalaiset ja yrttilääkkeet. 2003;34(9):U018.
[5] Shi TT, Ge WH. Cistanche Hoffmg:n tutkimuskehitys. Et Link. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy. 2009;18(9):7–9.
[6] Gong X, Zhong T, Zhou JY, et ai. Tutkimus uuden fermentoidun Cistanche-viinin teknologiasta. Moderni ruoka. 2019(5):64–68;79.
[7] Xu HT, Li H, Zhao YZ, et ai. Nervilia fordii -lajin flavonoidien antioksidanttinen ja antibakteerinen vaikutus. Northern Horticulture. 2017(16):161–165.
[8] Yu H, Xu X, Hao JX, et ai. Sitruunankuoren puristemassan sekafermentointi Trichoderma koningiin, Aspergillus oryzaen ja Lactobacillus casein kanssa: prosessin optimointi, antioksidanttiaktiivisuus ja ei-kohdennettu metabolomiikka-analyysi. Food Bioscience. 2025;66:106180.
[9] Zhou JN, Hou DH, Zou WQ, et ai. Luonnonvaraisen Ophiocordyceps sinensisin laajalti kohdistetun metabolomiikan ja kohdentamattoman metabolomiikan vertailu. Molekyylit. 2022;27(11):3645.
[10] Li XH. Rosa kwangsiensis var. sterilis fermentoitu viini [pro gradu]. Chongqing: Southwest University; 2017
[11] Li ZJ, Zhang XD, Long BX, et ai. Msalais-päärynän tuotekehityksen ja vasteen pinnan optimoinnin tutkimus. Maataloustuotteiden jalostus. 2025;3:1–10.
[12] Zhang L, Jiang XF. Kuparin määritysmenetelmän soveltuvuuden varmistaminen viinin ja hedelmäviinin yleisessä analyysimenetelmässä GB/T15038-2006. Alkoholinvalmistus. 2020;47(5):104–107.
[13] Zhong DL, Yang H, Wang Z et ai. Malolaktisen käymislämpötilan vaikutus Cabernet Sauvignon -viinin laatuun. Zhejiang Agricultural Sciences. 2025;66(7):1724–1732.
