Miksi Cistanche vaikuttaa PC12-solujen apoptoosiin?

Cistanchen vaikutukset PC12-solujen apoptoosiin

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tian Jiyu¹, Chen Jianzong¹, Chen Xiaoli², Yang Hao³

¹Perinteisen kiinalaisen lääketieteen laitos,²Xijingin sairaalan farmasian osasto,³PLA Institute of Neurobiology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Kiina

Abstrakti

TAVOITE:Vaikutusten tutkimiseksiCistanche1- metyyli-4-fenyylipyridinium (MPP plus ) -indusoituPC12-solujen apoptoosi.

MENETELMÄT: PC12 solutaltistettiin 200 μmol/L MPP plus yksin tai MPP plus yhdistettynä eri pitoisuuksiinCistancheUuden-Seelannin valkoisen kanin seerumi. VaikutuksetCistanchepäälläPC12-solujen apoptoosihavaittiin virtaussytometrialla, elektronimikroskopialla ja fluoresenssimikroskopialla.

TULOKSET:Seerumit kerättiin kaneista, joita ruokittiin vastaavalla annoksellaCistanchetai kaksinkertaisella vastaavalla annoksellaCistanchesillä oli ilmeisiä suojaavia vaikutuksiaPC12 solutjaPC12-solujen apoptoosinopeudetnäiden kahden seerumin kanssa inkuboidut pitoisuudet olivat 2,8 prosenttia ja 10,2 prosenttia, mikä oli selvästi pienempi kuinPC12 solutvain MPP plus -hoidolla (18,6 prosenttia, P<0>

PÄÄTELMÄ:Cistanchevoi suojataPC12 solutalkaenapoptoosiMPP plus:n aiheuttama.

Avainsanat:CistancheDeserticola, 1-metyyli-4-fenyylipyridinium,PC12 solut, apoptoosi

Johdanto

Parkinsonin taudin (Parkinsonin tauti, PD) patogeneesi on substantia nigra -dopaminergisten hermosolujen vaurioituminen ja häviäminen.apoptoosivoi olla tärkeä syy. Käytämme virtaussytometriaa (FACS), transmissioelektronimikroskooppia ja ydinmuotoanalyysin fluoresenssivärjäystä ja muita menetelmiä kiinalaisen lääketieteen havaitsemiseen.Cistanchelääkeaineseerumilla ja hermomyrkkyllä 1-metyyli-4-fenyylipyridinium (1-metyyli-4-fenyylipyridinium, M PP plus ) käsitellyt PC12-solut, tutkimaan Cistanchen vaikutusta hermosoluihin. toiminta.

cistanche deserticola benefits

VaikutuksetCistanchePC12-solujen apoptoosiin

1. Materiaalit ja menetelmät

1.1 Materiaalit

PC12 solutostettiin Japan Life Science Foundationilta; RP-MI1640-viljelyelatusaine, vasikan seerumi ja rotan hännän kollageeni ostettiin Gibcolta; MPP plus, Annexin V-FITC, PI, PBS, soluviljelypullot ja viljelylevyt ostettiin Sigmalta; kiinalainen lääketiedeCistancheostettiin Xi'an Decoction Piece Factorystä; Uuden-Seelannin isokorvainen valkoinen kani (uros, paino 2,5 ~ 3 kg) saatiin koulueläinkeskuksesta; Hoechst33342 ostettiin Biyuntian Companylta; Paraformaldehydi oli kotimaista puhdasta; LD4- Tyypin 2 sentrifugi (Beijing Medical Centrifuge Factory) Instruments Fluoresenssimikroskooppi (Laika-yhtiö), käänteinen mikroskooppi (Olympus-yhtiö), JEM-2000EX-transmissioelektronimikroskooppi (Japani), CO2-vakiolämpötila-inkubaattori (täällä) -cus HERAcell, Saksa), Coulter EPICS virtaussytometri (Beck-man Coulter, USA).

1.2 Menetelmä

PC12 solutkasvatettiin RPMI1640-soluviljelyalustassa, joka sisälsi 100 ml/l vasikan seerumia. Soluviljelypullo ja viljelylevy peitettiin 0,2 g/l rotan hännän kollageenilla ennen käyttöä. Viljellyt solut asetettiin 37 asteeseen, 50 ml/l C02-inkubaattorissa, vaihda väliaine 3 päiväksi. Kun yksikerroksiset viljelysolut ovat fuusioitumassa, pilko 1,25 g/l trypsiinillä ja alaviljelä. Kun alaviljelmäsolut siirtyvät logaritmiseen kasvuvaiheeseen, voit lisätä lääkkeitä. Kanin painon mukaan eläimen ekvivalenttiannos muunnetaan kehon pinta-alan mukaan. Perinteinen kiinalainen lääketiedeCistanchevalmistetaan pakastekuivattuna jauheena, joka laimennetaan tislatulla vedellä, kun sitä käytetään, ja eläimelle annetaan kahdesti päivässä 3 päivän ajan (Chinese Experimental Formula Chinese Journal of Science, 1998; 4:13-15), 1 h viimeisen ig:n jälkeen, kaulavaltimon verenlasku, yön yli 4 asteessa, sentrifugointi 2500 r/min 25 min, seerumin erotus, inaktivointi 56 asteessa, 30 min ja 0. Sterilointi 22 μm:n suodatinkalvolla ja säilytys -20 asteessa . Samoissa olosuhteissa valmistettiin tyhjää kanin kontrolliseerumia, 1/2, 1 ja 2 kertaa ekvivalenttiannos seerumia. Koe jaettiin 5 ryhmään: ryhmä A oli tyhjä kani Seerumiryhmä, ryhmä B on 2 kertaa ekvivalenttiannos seerumia plus MPP plus ryhmä (letkuannos on cistanche raakalääke 6,4 g/kg), ryhmä C on ekvivalentti annos seerumia plus MPP plus ryhmä (letkuannos on Cistanche-raakalääke 3,2 g/kg), ryhmä D on puoliekvivalentti annos seerumia plus MPP plus ryhmä (annoksessa Cistanchen raakalääke 1,6 g/kg), ryhmä E on tyhjä kanin seerumi plus MPP plus -ryhmä. Alaviljelmä 12 h Jatkossa tarkkaile soluja käänteismikroskoopilla ja lisää lääkeaine ennen konfluenssia. Jokaisen ryhmän seerumipitoisuus on 10 prosenttia. Kolmen päivän viljelyn jälkeen MPP plus lisätään lopulliseen konsentraatioon 200 μmol/l. Asetettu 37 asteeseen, 50 ml/l CO2-viljelmään ja tarkista se 24 tunnin inkubaation jälkeen.

1.2.1 PC12-solujen fluoresenssivärjäyshavainto

Lisää Hoechst33342 viljeltyynPC12 solutlopullisessa pitoisuudessa 10 mg/l, inkuboi 37 asteessa 30 minuuttia, sekoita 40 g/l paraformaldehydiä ja viljelyalustaa 13:ssa: jotta paraformaldehydin lopullinen konsentraatio on 10 g/l. Kiinnityksen jälkeen 5-10 min, hävitä supernatantti, pese PBS:llä ja tarkkaile fluoresenssimikroskoopilla.

1.2.2 Tarkkailu transmissioelektronimikroskoopilla

24 tunnin lääkekäsittelyn jälkeen solut kerättiin ja siirrettiin sentrifugiputkeen, sentrifugoitiin nopeudella 1500 r/min, 4 astetta 5 minuuttia ja pestiin kahdesti 10 mmol/l PBS:llä. Sentrifugoi nopeudella 1500 r/min, 4 astetta 5 minuuttia, hävitä supernatantti, lisää hitaasti 25 ml/l glutaraldehydiä pitkin putken seinämää ja kiinnitä 4 asteeseen 2 tunniksi, irrota solupaakut suoralla pipetillä, pese 3 kertaa PBS:llä, 5 min joka kerta, kiinnitä 1 tunniksi osmiumhapon jälkeen 4 asteessa. Gradientin jälkeinen asetonikuivaus, epoksihartsilla liotus ja upottaminen, viipaloitu ultraohuella LKB-2188-mikrotomilla, värjätty uranyyliasetaatilla. lyijysitraatti, tarkkailtu transmissioelektronimikroskoopilla ja valokuvattu.

1.2.3 Virtaussytometrinen tunnistus

M PP plus käsittely 24 h, digest 106 tarttuvaaPC12 solut1,25 g/l trypsiinillä, pese kahdesti PBS:llä, lisää 490 µl sitoutumispuskuria, sekoita solut huolellisesti ja lisää 5 µl Annexin V-FI TC:tä. Sekoita 10 µl liuennutta PI:tä solususpensioon, sekoita varovasti, aseta testi putkessa 4 asteessa, inkuboi 10 minuuttia pimeässä ja suorita havaitseminen virtaussytometrillä. Jokaisessa ryhmässä on 4 rinnakkaista kuoppaa.

Tilastollinen käsittely: Tietoja edustaa x ±s, useiden ryhmien vertailu suoritetaan Kruskal-Wallis-testillä ja parivertailu Mann-Whitney-testillä, ja P<0.05 is="" considered="" as="" a="" significant="">

echinacoside in cistanche (2)

Cistanchen vaikutukset PC12-solujen apoptoosiin

2. Tulokset

2.1 PC12-solujen fluoresenssimikroskooppihavainnointi

Normaalisti kasvatettuPC12 solutvoi emittoi tasaista fluoresenssia Hoechst33342:lla värjäytymisen jälkeen, ja tiheästi värjäytyneen rakeisen massafluoresenssin ja pistevalkoisen fluoresenssin voidaan nähdä apoptoottisessa solutumassa. Useimpien normaaliryhmän solujen ydin on suhteellisen yhtenäinen. Sininen fluoresenssi, heikosti näkyvä pistemäinen tiivistynyt pistemäinen fluoresenssi, sen tiivistynyt pistemäinen fluoresenssi on heikompi kuin MPP plus kontrollisolut. Normaalisti kasvatetut solut osoittavat tasaista sinistä fluoresenssia Hoechst-värjäyksen jälkeen, ja ytimen morfologia on säännöllinen (kuvio 1A); MPP plus:n jälkeen tumakromatiini näyttää konsentroituneelta tai voimakkaasti kondensoituneelta, osoittaa epäsäännöllistä pistefluoresenssia tai marginalisoitua; myöhäiset solutumat jakautuvat fragmenteiksi (kuvio 1B). Vastaava annos ja 2 kertaa vastaava annos SolutCistanchelääkeseerumi plus M PP plus -ryhmä olivat lähellä normaaleja (kuvio 1C, D).

Kuva 1PC12 solutvärjätty Hoechst33342:lla (Ho)

apoptosis of PC12 cells

A : Kontrolli: Kromatiini jakautuu tasaisesti ja värjäytyy säännöllisesti ;B : MPP plus käsitelty: Kromatiinin kondensaatio ja marginaali ydinkalvolla; C : VastaavaCistancheplus MPP plus käsitelty ed;D : Kaksinkertainen ekvivalentti Cistanche plus MPP plus käsitelty, kromatiini on normaali.

2.2 Tarkkailu projektioelektronimikroskoopilla

Normaalisti viljeltyPC12 solutniillä on yhtenäinen tumakromatiini, kirkas ja täydellinen tumakalvo, runsaasti sytoplasmisia mitokondrioita ja täydelliset organellit (kuva 2A). MPP plus -käsittelyn jälkeen PC12-solut ovat muuttuneet merkittävästi, solukalvo on ehjä, pinnan mikrovillit kadonneet ja sytoplasma on konsentroitunut, kromatiini on kondensoitunut, rikkoutunut, tiivistynyt voimakkaasti ja kerääntynyt tumakalvon sisäpinnalle, mikä osoittaa ominaisuudetapoptoosi, pääasiassa varhaisen ja keskivaiheen apoptoottisissa soluissa (kuvio 2B, C). Apoptoottiset solut kussakin ryhmässä, jotka sisältävätCistancheseerumit ovat ilmeisiä Väheneminen, tumakromatiini on jakautunut tasaisesti, tumakalvo on kirkas ja täydellinen ja organellit ovat ehjät, lähellä kuvassa 2A esitettyä solua.

2.3 Virtaussytometrian testitulokset

Fosfatidyyliseriini (PS), joka sijaitsee solukalvon sisäpuolella, siirtyi solukalvon ulkopuolelle solukalvon varhaisessa vaiheessa.apoptoosi. Kunkin ryhmän apoptoottiset määrät olivat (2,3 ± 0,11) prosenttia, (2,8 ± 0,21) prosenttia, (1{{10}}},2 ± {{ 14}},60) prosenttia , (16,0 ± 0,87) prosenttia ja (18,6 ± 0,67) prosenttia . B-, C-, D-ryhmän rank-sum-testianalyysi verrattuna E-ryhmään P<0.05. there="" is="" a="" significant="" difference="" between="" serum-containing="" chinese="" medicine="" and="" the="" blank="" serum="">

Kuva 2PC12 solutultrarakenne EM × 6000

apoptosis of PC12 cells

V: Ilman MPP:tä plus tasaisesti dispergoitunutta kromatiinia kevyesti elektronitiheä sytoplasma, normaali organellirakenne ja ehjä solukalvo; B, C: Altistettu 200 μmol/LM PP plus .Varhainen apoptoottinen vaihe, perifeerinen kromatiinin kondensaatio, lähes normaali sytoplasman rakenne(B). Myöhäinen post-otic vaihe, lisää kromatiinin kondensaatiota, lisääntynyt sytoplasminen elektronitiheys, normaalin organellirakenteen puuttuminen ja solukalvon eheyden (C) häiriintyminen.

3. Keskustelu

M PP plus:n neurotoksisuus on monikomponenttinen prosessi, joka sisältää mitokondrioiden ja synaptisten vesikkelien korvaamisen dopamiinilla reaktiivisten happiyhdisteiden tuottamiseksi [1]. Tällä hetkellä useimpien niistä uskotaan liittyvän mitokondriosoluihinapoptoosija endogeeninen Dopamiinin neurotoksinen vaikutus johtaa apoptoosiin liittyvään [,2] M PP plus:n suorittaman substantia nigra dopamiinisolulinjan SN4741 apoptoosin havainnointiprosessissa kaspaasi-1 ja kaspaasi{ aktivoituvat. {4}} [3] 0,1 μmol/L:n MPP plus vaikuttaa lisämunuaisen neuroblastooman SH-SY5Y-soluihin ja voi lisätä apoptoosiin liittyvän Bcl-2-proteiinin ilmentymistä muutaman päivän kuluttua [4].Cistancheon kuiva, hilseilevä lehti Cistanche-suvun (Cistanche) sukuunCistanche. Cistanchen mehevällä varrella on hyvä parantava vaikutus Alzheimerin taudin ja PD:n hoidossa. Cistanchen kokonaisglykosidit voivat tehokkaasti poistaa erilaisia aktiivisia happivapaita radikaaleja ja suojata OH:n aiheuttamaa DNA:n hapettumista. [5]. Sheng et ai. [6] tutkimukset vahvistivat, että Cistanche Tubulkosidi B -uute voi heikentää MPP plus -indusoitua sytotoksisuutta, heikentää reaktiivisten happilajien kertymistä soluun ja vaikuttaa antagonistisesti MPP plus -indusoituun.apoptoosija oksidatiivinen stressi. Olemme huomanneet senCistancheon antagonistinen vaikutus MPP plus -indusoituun PC12:een. Solun vaikutusapoptoosija suojaava vaikutusPC12 solutkasvaa annoksen kasvaessa.

cistanche can treat kidney disease improve renal function

Cistanchen vaikutukset PC12-solujen apoptoosiin

Viite

[1] Lotharius J, O Malley KL. Parkinsonismia aiheuttava lääke 1- metyyli-4-fenyylipyridinium laukaisee solunsisäisen dopamiinihapetuksen. Uusi toksisuuden mekanismi [J]. J Biol Chem, 2000; 275 (49):38581-38588.

[2] Maruyama W, Naoi M. Solukuolema Parkinsonin taudissa [J]. J Neurol, 2002; 249(S Suppl 2):6-10.

[3] Chun HS, Gibson GE, DeGiorgio LA, et ai. MPP:n (plus) indusoima dopaminerginen solukuolema, hapetin ja spesifiset neurotoksiset aineet jakavat yhteisen molekyylimekanismin [J]. J Neurochem, 2001; 76(4): 1010-1021.

[4] Veech GA, Dennis J, Keeney PM, et ai. Häiriintynyt mitokondrioiden elektronien kuljetustoiminto lisää anti-apoptoottisen Bcl-2- ja Bcl-XL-proteiinin ilmentymistä SH-SY5Y-neuroblastooman ja Parkinsonin taudin kybridisoluissa oksidatiivisen stressin kautta [J]. J Neurosti Res, 2000;6(1):693-700.

[5] Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Lia ym. Vapaiden radikaalien poistaminen in vitro ja suojaavat vaikutukset OH:n aiheuttamiin DNA-vaurioihin, jotka aiheutuvat kokonaisglykosidienCistanche[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2001; 36(1): 29-32. Wang XW , Ji ang XY, Wu LY jne. Tutkimus kokonaismäärästä kivituuman glykosideja, jotka eliminoivat vapaita radikaaleja ja suojaavat vahingoittunutta DNA:ta in vitro [J]. Chin Pharm, 2001;36(1):29-32.

[6] Sheng G, Pu X, Lei L, et ai. Tubulosidi B alkaencistanchesalsa pelastaa PC12-hermosolut 1-metyyli-4-fenyylipyridiniumionin aiheuttamaltaapoptoosija oksidatiivinen stressi[ J]. Play nta Med, 2002;68(11):966-970.

cistanche can enhance memory