Cistanche Deserticola -uute lisää luun muodostumista osteoblasteissa
Mar 05, 2022
Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com
Te-Mao Lia, Hsin-Chih Huangb, Chen-Ming Suc, Tin-Yun Hoa, Chi-Ming Wua, Wen-Chi Chend, Yi-Chin Fonga,eja Chih-Hsin Tangf,c
Abstrakti
Tavoitteet:Tutkimme vaikutustaCistanche deserticola Ma. (CD) viljeltyjen osteoblastien luun muodostukseen.menetelmätMineralisoituneiden kyhmyjen muodostumismääritystä käytettiin CD:n in vitro -vaikutusten tutkimiseen luun muodostukseen. Alkalinen fosfataasi (ALP), luun morfogeneettiset proteiinit (BMP)-2 ja osteopontiinin (OPN) mRNA:n ilmentyminen analysoitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella polymeraasiketjureaktiolla. CD-uutteen vaikutusmekanismia tutkittiin Western blot -menetelmällä. CD-uutteen osteoporoosia estävä vaikutus in vivo arvioitiin hiirillä, joilta oli poistettu munasarjat.AvainlöydöksetCD-uutteella ei ollut vaikutusta viljeltyjen osteoblastien lisääntymiseen, migraatioon tai haavan paranemiseen, mutta ne lisäsivät ALP-, BMP-2- ja OPN-mRNA- ja luun mineralisaatiota. Mitogeenilla aktivoidut proteiinikinaasin (MAPK) tai ydintekijän (NF)-kB:n estäjät vähensivät CD-uutteen aiheuttamaa luun muodostumista ja ALP-, BMP-2- ja OPN-ilmentymistä. CD-uute ei kuitenkaan vaikuttanut osteoklastogeneesiin. Lisäksi CD-uute esti munasarjojen poiston aiheuttaman luukadon in vivo.JohtopäätöksetCD voi olla uusi luunmuodostusaine osteoporoosin hoitoon.
Johdanto
Luu on monimutkainen kudos, joka koostuu useista solutyypeistä, jotka käyvät läpi jatkuvan uusiutumis- ja korjausprosessin, jota kutsutaan "luun uudelleenmuodostumiseksi". Kaksi pääasiallista luun uusiutumisesta vastuussa olevaa solutyyppiä ovat osteoklastit, jotka resorboivat luuta, ja osteoblastit, jotka muodostavat uutta luuta. Luuston uusiutumista säätelevät useat systeemiset hormonit (esim. lisäkilpirauhashormoni, 1, 25-hydroksi-D3-vitamiini, sukupuolihormonit ja kalsitoniini) ja paikalliset tekijät (esim. typpioksidi, prostaglandiinit, kasvutekijät ja sytokiinit).[1]
Osteoporoosi syntyy, kun luun resorptio ja muodostuminen ovat koordinoimattomia ja liiallinen luun hajoaminen ylittää luun rakentamisen.[2] Nykyisiä osteoporoosin hoitoja ovat bisfosfonaatit, kalsitoniini ja estrogeeni, jotka ovat luun resorption estäjiä, jotka ylläpitävät luumassaa estämällä osteoklastien toimintaa.[3] Näiden lääkkeiden vaikutus luumassan lisäämiseen tai palautumiseen on kuitenkin suhteellisen pieni, ei varmasti enempää kuin 2 prosenttia vuodessa.[3] Siksi tarvitaan luuta rakentavia aineita, kuten teriparatidia, jotka stimuloivat uuden luun muodostumista ja korjaavat trabekulaarisen mikroarkkitehtuurin muutosta, joka on tyypillistä vakiintuneelle osteoporoosille.[4,5] Koska uuden luun muodostuminen on ensisijaisesti seurausta osteoblasti, aineet, jotka vaikuttavat joko lisäämällä osteoblastisen linjan solujen lisääntymistä tai indusoimalla osteoblastien erilaistumista, voivat edistää luun muodostumista.[5,6]
Vaikka osteoporoosin mekanismit ovat edelleen epäselviä, ne liittyvät todennäköisesti luun kasvutekijöiden, kuten luun morfogeneettisten proteiinien (BMP:iden), saatavuuden vähenemiseen tai vaikutuksiin.[7] BMP:t, jotka liittyvät rakenteellisesti trans-muodostavan kasvutekijä-b-superperheeseen, tunnistettiin alun perin niiden kyvystä indusoida kohdunulkoisen luun muodostumista jyrsijöissä.[8] BMP:illä on tärkeä rooli luun muodostumisessa ja luusolujen erilaistumisessa stimuloimalla alkalisen fosfataasin (ALP) aktiivisuutta sekä proteoglykaanin, kollageenin ja osteopontiinin (OPN) synteesiä.[9] Äskettäisessä tutkimuksessa havaittiin yhteys osteoporoosin ja tiettyjen BMP-2-, ALP- ja OPN-geenien polymorfismien välillä, mikä viittaa siihen, että ne liittyvät osteoporoosin kehittymiseen.[10]
Cistanche deserticola Ma.(Orobanchaceae; lyhennettynä CD) on kotoperäinen yrtti Kiinassa, ja sitä käytetään laajasti perinteisessä lääketieteessä terapeuttisena aineena sen rauhoittavien, kipua lievittävien ja immunostimulatoristen ominaisuuksiensa vuoksi.[11] Nykyaikaiset farmakologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että CD-uutteet voivat stimuloida immuniteettia,[12] poistaa vapaita radikaaleja[13] ja lisätä superoksididismutaasin aktiivisuutta[14]. Anti-inflammatorisilla ja antioksidanttisilla aineilla on potentiaalia hoitaa osteoporoosia lisäämällä luun muodostumista ja/tai estämällä luun resorptiota.[15,16] CD:n vaikutusta luusolujen toimintaan ei kuitenkaan ole vielä määritetty. Tässä raportoimme, että CD-uute ei vaikuttanut viljeltyjen osteoblastien lisääntymiseen, migraatioon tai haavan paranemisaktiivisuuteen, mutta lisäsi ALP:n, BMP:n-2 ja OPN:n ilmentymistä ja luun mineralisaatiota. Lisäksi osoitamme, että mitogeenin aktivoima proteiinikinaasi (MAPK) ja ydintekijä (NF) -kB-signalointireitit voivat olla osallisena CD-välitteisessä geeniekspression ja luun mineralisaatiossa. Sitä vastoin CD-uute ei suppressoi osteoklastogeneesiä in vitro. Erityisesti hiirten hoito CD-uutteella esti munasarjojen poiston aiheuttaman luukadon in vivo. Näin ollen tietomme viittaavat siihen, että CD:tä voidaan käyttää stimuloimaan luun muodostumista osteoporoosin hoidossa.
Cistanche deserticola
Materiaalit ja menetelmät
Cistanche deserticola -uute ja materiaalit
CD-uute ostettiin Chuang Song-Zong Pharmaceutical Companylta (Kaohsiung, Taiwan). CD:n uuttamista ja eristämistä seurattiin aiemmin kuvatulla tavalla (spektritietojen perusteella he ovat tunnistaneet kemiallisen koostumuksen, mukaan lukien beeta-sitosteroli, daukosteroli, meripihkahappo, triakontanoli, akteosidi, betaiini ja polysakkaridi).[17] Kanin polyklonaaliset vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä p-ekstrasellulaarisille signaalisäädellyille kinaaseille (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminaalisille kinaaseille (JNK), JNK, p-p65 ja p65, ostettiin Santa Cruz Biotechnologylta ( Santa Cruz, Yhdysvallat). Osteokalsiini ELISA -pakkaus ostettiin Biosource Technologylta (Nivelles, Belgia). Tyypin I kollageenin ELISA-sarjan C-terminaaliset telopeptidit saatiin Cross Lapsilta (Herlev, Tanska). Dominantti-negatiivisen p38-mutantin toimitti tohtori J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA). JNK-dominantti-negatiivisen mutantin toimitti tohtori M. Karin (University of California, San Diego, USA). ERK2-dominantti-negatiivisen mutantin toimitti tohtori M. Cobb (South-Western Medical Center). Kaikki muut reagenssit hankittiin Sigma-Aldrichilta (St Louis, USA).
Soluviljely
Hiiren osteoblastisolulinja MC3T3-E1 ostettiin American Type Culture Collectionilta (ATCC; Rockville, USA). Soluja viljeltiin 95 prosentissa ilmassa, 5 prosentissa CO2:ssa a-MEM:llä, jota oli täydennetty 20 mm HEPES:llä ja 10 prosentilla lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia, 2 mm-glutamiinia, penisilliiniä (100 U/ml) ja streptomysiiniä (100 mg) /ml).
Mineralisoituneiden kyhmyjen muodostumisen mittaus
Mineralisoituneiden kyhmyjen muodostuminen arvioitiin kuvatulla tavalla.[18] Lyhyesti sanottuna osteoblasteja viljeltiin väliaineessa, joka sisälsi C-vitamiinia (50 mg/ml) ja b-glyserofosfaattia (10 mm) kahden viikon ajan, ja alusta vaihdettiin joka kolmas päivä. 12 päivän CD-uutteen kanssa inkuboinnin jälkeen solut pestiin kahdesti 20 mm Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi
0,15 m NaCl (pH 7,4), kiinnitetty jääkylmään 75-prosenttiseen (v/v) etanoliin 30 minuutin ajan ja ilmakuivattuna. Kalsiumin kerrostuminen määritettiin käyttämällä alitsariinipuna-S-värjäystä. Lyhyesti sanottuna etanoliin kiinnitetyt solut ja matriisi värjättiin 1 tunnin ajan 40 mm alitsariinipuna-S:llä (pH 4,2) ja huuhdeltiin perusteellisesti vedellä. Sitoutunut tahra eluoitiin 10-prosenttisella (paino/tilavuus) setyylipyridiniumkloridilla, ja alitsariinipuna-S näytteissä määritettiin mittaamalla absorbanssi 550 nm:ssä ja verrattiin standardikäyrään. Yksi mooli alitsariinipuna-S:ää sitoo selektiivisesti noin kaksi moolia kalsiumia.
Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio
Kokonais-RNA uutettiin osteoblasteista käyttämällä TRIzol-sarjaa (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). Käänteistranskriptio suoritettiin käyttämällä 2 mg kokonais-RNA:ta ja oligo(dT)-aluketta.[19,20] Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qPCR) suoritettiin käyttämällä TaqMan® yksivaiheista PCR Master Mixiä (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Kokonais-cDNA lisättiin (100 ng per 25- ml reaktiota) sekvenssispesifisten alukkeiden ja Taqman®-koettimien kanssa. Kaikki kohdegeenialukkeet ja -koettimet ostettiin kaupallisesti, mukaan lukien b-aktiini sisäisenä kontrollina (Applied Biosystems). qPCR-määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena StepOnePlus-sekvenssin havaitsemisjärjestelmällä (Applied Biosystems). Jaksoolosuhteet olivat 10-min polymeraasiaktivaatio 95 asteessa, mitä seurasi 40 sykliä 95 astetta 15 s ja 60 astetta 60 s. Kynnys asetettiin ei-templaattikontrollitaustan yläpuolelle ja kohdegeenin monistumisen lineaarisen vaiheen sisällä sen syklin numeron laskemiseksi, jossa transkripti havaittiin (merkitty CT:ksi).
Western blot -analyysi
Solulysaatit valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla.[21,22] Proteiinit erotettiin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin Immobilon-polyvinyylidifluoridikalvoille (Millipore, Billerica, USA). Blotit blokattiin 4-prosenttisella naudan seerumialbumiinilla 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja sitten tutkittiin kanin anti-ihmisvasta-aineilla p-65:tä tai p-p65:tä (1:1000) vastaan 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kolmen pesun jälkeen blotteja inkuboitiin peroksidaasilla konjugoidun aasin anti-kanin sekundaarivasta-aineen (1:1000) kanssa 1 tunti huoneenlämpötilassa. Blotit visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssilla käyttämällä X-OMAT LS -kalvoa (Eastman Kodak, Rochester, USA).
Munasarjan poiston aiheuttama osteoporoosi
Tässä tutkimuksessa käytettiin naaraspuolisia ICR-hiiriä, neljä viikkoa vanhoja, 22-28 g. Hiiriltä poistettiin munasarjat molemmin puolin triklooriasetaldehydi-anestesiassa (100 mg/kg) ja vertailuhiiriltä tehtiin valeleikkaus (Sham). Luun mineraalitiheys ja luun mineraalipitoisuus mitattiin erilaisten CD-uutteiden pitoisuuksien oraalisen antamisen jälkeen joka toinen päivä neljän viikon ajan. Koko kehon luun mineraalitiheys ja luun mineraalipitoisuus määritettiin kaksoisenergiaröntgenabsorptiometrillä (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) käyttämällä pienten koehenkilöiden tilaa, kuten aiemmin on kuvattu.[18, 23] Kaikki protokollat olivat institutionaalisten ohjeiden mukaisia, ja Kiinan lääketieteellisen yliopiston eläinhoitokomitea hyväksyi ne.
Tilastollinen analyysi
Tilastollinen analyysi suoritettiin Prism 4.{6}}1-ohjelmistolla. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Annetut arvot ovat keskiarvo ± SEM. Tilastollinen analyysi kahden näytteen välillä suoritettiin Studentin t-testillä. Useamman kuin kahden ryhmän tilastolliset vertailut suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä Bonfer-Ronin posthoc-testillä. Kaikissa tapauksissa P < 0,05="" katsottiin="">
Cistanche deserticola -uute
Tulokset
Cistanche deserticola -uute lisää luun mineralisaatiota osteoblastien vaikutuksesta
CD-uutteen lisääminen 24 tai 48 tunnin ajan ei vaikuttanut hiiren osteoblasti-MC3T3-E1-solujen proliferaatioon MTT-määrityksessä (tietoja ei esitetty). Koska osteoblastien erilaistuminen on monimutkainen prosessi, johon liittyy solujen lisääntymistä ja migraatiota, testasimme myös MC3T3-E1-solujen migraatiokykyä CD-uutteella käsittelyn jälkeen. Käyttämällä Transwell- ja haavan paranemismäärityksiä havaitsimme, että CD-uute ei vaikuttanut osteoblastien migraatioon (tietoja ei näytetä). Mineralisoituneiden kyhmyjen muodostuminen on yksi osteoblastien kypsymisen merkkiaineista. Alizariinipunainen S-värjäys osoitti, että mineralisoituneita kyhmyjä muodostui, kun osteoblasteja viljeltiin kahden viikon ajan C-vitamiinia (50 mg/ml) ja b-glyserofosfaattia (10 mm) sisältävässä elatusaineessa, ja tämä lisäys lisääntyi pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. CD-levyltä (kuva 1a). Siksi CD-uute aiheutti viljeltyjen osteoblastien luun kyhmyjen muodostumista, mutta ei niiden lisääntymistä tai migraatiota. Tutkimme myös CD-uutteen roolia RANKL-indusoidussa osteoklastogeneesissä, mutta emme löytäneet vaikutusta (tietoja ei näytetä).
Cistanche deserticola -uute lisää alkalista fosfataasia, luun morfogeneettistä proteiinia-2 ja osteopontiinin ilmentymistä viljellyissä osteoblasteissa
Erilaistuneilla osteoblasteilla on kohonnut ALP-aktiivisuus, mikä korreloi entsyymien ilmentymisen korkeiden tasojen kanssa.[18] Havaitsimme, että hoito CD-uutteella 72 tunnin ajan lisäsi merkittävästi osteoblastien ALP-aktiivisuutta (kuvio 1b). Ottaen huomioon BMP-2:n, ALP:n ja OPN:n ratkaisevan roolin osteoblastien erilaistumisessa, testasimme, vaikuttaako CD-uute osteoblastien erilaistumiseen säätelemällä BMP-2-, ALP- ja OPN-ilmentymistä. Solujen käsittely CD-uutteella lisäsi ALP:n, BMP-2:n ja OPN:n mRNA:n ilmentymistä pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (kuva 1c), mikä osoittaa, että CD-uute indusoi osteoblastien erilaistumista lisäämällä ALP:tä, BMP:tä-2 , ja OPN-lauseke.
Cistanche deserticola -uute lisää luun kyhmyjen muodostumista mitogeenin aktivoiman proteiinikinaasireitin kautta
On raportoitu, että MAPK:lla on tärkeä rooli luun muodostumisessa [24,25], joten tutkimme seuraavaksi, liittyykö tämä signalointireitti CD-uutteen aiheuttamaan luun mineralisaatioon. Solujen esikäsittely ERK-estäjillä U0126, p38-estäjillä SB203580 tai JNK-estäjillä SP600125 vähensi CD-uutteen lisäämää luun mineralisaatiota (kuviot 2a, 3a ja 4a). Lisäksi estäjät estivät myös CD-uutteen aiheuttaman ALP-, BMP-2- ja OPN-ilmentymisen (kuvat 2b–4c). Solujen transfektio ERK2-, p38- tai JNK-mutantilla vähensi CD-uutteen lisääntymistä ALP-, BMP-2- ja OPN-mRNA-ilmentymisessä (kuvat 2c, 3c ja 4c). Seuraavaksi tutkimme suoraan ERK-, p38- ja JNK-aktivaatiota CD-uutteen käsittelyn jälkeen. Solujen inkubointi CD-uutteen kanssa indusoi ERK:n, p38:n ja JNK:n fosforylaation (kuviot 2d, 3d ja 4d). Siksi ERK, p38 ja JNK välittävät osteoblastien CD-hoidon aiheuttamaa lisääntynyttä luun muodostumista.
Cistanche deserticola -uute lisää luun kyhmyjen muodostumista ydintekijä-kB-reitin kautta
Kuten aiemmin mainittiin, NF-kB:n aktivaatio on välttämätöntä luun muodostumiselle.[26,27] Seuraavaksi käsittelimme osteoblasteja NF-kB:n estäjillä pyrrolidiiniditiokarbamaatti (PDTC) ja N-tosyyli-L-fenyylialaniinikloorimetyyliketoni (TPCK) Calbiochem (Darmstadt, Saksa) selvittääkseen, liittyykö NF-kB:n aktivaatio CD-uutteen aiheuttamaan luun mineralisaatioon. Kuva 5a osoittaa, että osteoblastien esikäsittely PDTC:llä tai TPCK:lla esti CD-uutteen indusoimaa luukyhmyjen muodostumista ja vähensi myös ALP-, BMP-2- ja OPN-ilmentymisen lisääntymistä (kuvio 5b ja 5c). NF-kB:n p65-alayksikön fosforylaatio on NF-kB-aktivaation indikaattori; [28] tämän mukaisesti havaitsimme, että CD-uute lisäsi p65-fosforylaatiota osteoblasteissa (kuvio 5d). Nämä tulokset osoittivat, että NF-kB:n aktivaatio on tärkeää CD-uutteen aiheuttaman ALP-, BMP-2- ja OPN-ilmentymiselle ja luukyhmyjen muodostumiselle.
Luukadon esto Cistanche deserticola -uutteella hiirillä, joilta on poistettu munasarjat
CD-uutteen vaikutuksen tutkimiseksi luun häviämiseen naarashiirillä aiheutettiin osteoporoosi munasarjan poistolla. Kuten odotettiin, hiirillä, joilta oli poistettu munasarjat, oli vähentynyt kehon luun mineraalitiheys ja luun mineraalipitoisuus (kuvio 6a ja 6b). Käsittely CD-uutteella neljän viikon ajan esti luun mineraalitiheyden ja luun mineraalipitoisuuden menetystä annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 6a ja 6b). ALP-pitoisuudet veressä voivat heijastaa osteoblastista aktiivisuutta.[29] Kuten kuviossa 6c esitetään, CD-uute esti munasarjojen poiston aiheuttamaa seerumin ALP-aktiivisuuden vähenemistä. Lisäksi CD-uute lisäsi myös osteokalsiinin, luun muodostumisen merkkiaineen, tasoa ja alensi tyypin I kollageenin, luun resorption merkkiaineen, C-pään telopeptidien tasoa (kuvio 6d ja 6e). Nämä havainnot siis tukevat CD-uutteen tehoa ja tehoa luukadon estämisessä in vivo.
Keskustelu
Cistanche deserticolaMa, Kiinassa kotoperäistä yrttiä, käytetään laajasti perinteisessä lääketieteessä erilaisiin terapeuttisiin hoitoihin sen rauhoittavan, analgeettisen ja immunostimulatorisen vaikutuksensa vuoksi.[11–15] Tässä osoitimme, että CD-uute indusoi luun mineralisaatiota viljellyissä osteoblasteissa, mutta ei eivät vaikuta niiden solujen migraatioon tai lisääntymiseen. Lisäksi havaitsimme, että ALP, BMP-2 ja OPN ovat CD-uutteen indusoiman signaloinnin kohdeproteiineja, mikä vaatii ERK:n, p38:n, JNK:n ja NF-kB:n aktivoinnin.
Luu on monimutkainen kudos, joka koostuu useista solutyypeistä, jotka ovat jatkuvassa uusiutumis- ja korjausprosessissa.[30] Kun resorptio ja luun muodostuminen ovat epätasapainossa, luun hajoaminen ohittaa luun muodostumisen ja aiheuttaa osteoporoosia.[30] Tutkimme CD-uutteen osteoporoottista vaikutusta hiirillä, joilta oli poistettu munasarjat. Hiirillä, joilta oli poistettu munasarjat, oli alentunut kehon luun mineraalitiheys ja luun kivennäisainepitoisuus, mitä lievensi hoito CD-uutteella. CD-uute lisäsi myös osteogeenisen markkerin ALP:n ja osteokalsiinin tasoja seerumissa. Siksi CD on luunmuodostusaine, joka estää munasarjojen poiston aiheuttaman luukadon in vivo.
Vaikka osteoporoosin mekanismit eivät ole täysin selviä, ne liittyvät todennäköisesti luun kasvutekijöiden, kuten ALP:n, BMP:n-2 ja OPN:n, vähentyneeseen saatavuuteen tai heikentyneeseen vaikutukseen. Näillä kolmella tekijällä on tärkeä rooli luun muodostumis- ja uusiutumisprosessissa[31], ja on hyvin dokumentoitu, että osteoblastisolujen erilaistumisen stimulaatiolle on ominaista pääasiassa ALP:n, BMP:n-2 ja OPN:n lisääntynyt ilmentyminen.[32] ] Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että CD-uute lisäsi ALP-, BMP-2- ja OPN-ilmentymistä ja tehosti luun mineralisaatiota. Siksi CD-uute välittää luun muodostumista osittain lisäämällä ALP:n, BMP-2:n ja OPN:n ilmentymistä.
On raportoitu, että p38 osallistuu ALP:n ilmentymisen säätelyyn osteoblastisten solujen erilaistumisen aikana; [33] samoin ERK1/2 on tärkeä osteoblastien lisääntymiselle ja erilaistumiselle.[34,35] JNK osallistuu osteoklastien muodostumiseen. [36] Osoitimme tässä, että CD-uute aiheutti ERK-, p38- ja JNK-fosforylaation, ja näiden entsyymien estäjät antagonisoivat CD-uutteen välittämää luun mineralisaation voimistumista, mikä viittaa siihen, että ERK-, p38- ja JNK-aktivaatiolla on pakollinen rooli CD-uutteen aiheuttamassa luun muodostumisessa. osteoblastit. Lisäksi ERK:n, p38:n ja JNK:n entsyymi-inhibiittorit ja dominanttinegatiiviset mutantit vähensivät CD-uutteella tehostettua ALP-, BMP-2- ja OPN-ilmentymistä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että ERK-, p38- ja JNK-reittien aktivointia tarvitaan CD-uutteen aiheuttaman ALP-, BMP-2- ja OPN-ilmentymisen ja kypsymisen lisääntymiseen osteoblasteissa. ERK:n on raportoitu lisäävän osteoblastien lisääntymistä ja erilaistumista.[34,35] Emme kuitenkaan havainneet CD-uutteen vaikutusta osteoblastien lisääntymiseen. Siksi muut reitit ovat saattaneet vastustaa ERK-vaikutusta CD-uutteen stimulaation jälkeen tai olla välttämättömiä lisääntymiselle. Tässä suhteessa olemme havainneet, että PI3K- ja Akt-inhibiittorit vähentävät myös CD-uutteen aiheuttamaa luun mineralisaatiota ja ALP-, BMP-2- tai OPN-mRNA-ilmentymistä (tietoja ei näytetä). Siksi näitä reittejä voidaan tarvita CD-uutteen aiheuttamaan luun muodostukseen.
NF-kB:n on osoitettu säätelevän osteoblastien toimintaa luussa.[37] Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että NF-kB:n aktivaatio edistää CD-uutteen aiheuttamaa luun mineralisaatiota ja ALP-, BMP-2- ja OPN-ilmentymistä viljellyissä osteoblasteissa ja että NF-kB-riippuvaisen signalointireitin (PDTC ja TPCK) estäjät ) esti CD-uutteen aiheuttamaa luun mineralisaatiota ja ALP-, BMP-2- ja OPN-ilmentymistä. p65 fosforyloituu Ser536:ssa useiden kinaasien toimesta useissa signalointireiteissä, mikä lisää p65:n transaktivaatiopotentiaalia.[38] Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että CD-uute lisäsi p65:n fosforylaatiota. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että NF-kB-aktivaatiota tarvitaan CD-uutteen aiheuttamaan luun muodostukseen viljellyissä osteoblasteissa. Havaitsimme myös, että ERK-, p38- ja JNK-inhibiittorit käänsivät CD-uutteen indusoiman NF-kB-lusiferaasiaktiivisuuden (tietoja ei esitetty), mikä on yhdenmukainen sen kanssa, että nämä entsyymit ovat CD-uutteen indusoiman NF-kB-aktivaation ylävirran välittäjiä. Siksi CD-uute indusoi luun muodostumista ERK/p38/JNK/- ja NF-kB-reittien kautta.
Johtopäätökset
Tämä tutkimus osoitti, että CD-uute indusoi osteoblastien erilaistumista ja kypsymistä, mutta ei lisääntymistä tai migraatiota. CD-uute lisäsi myös ALP-, BMP{0}}- ja OPN-ilmentymistä ja luun mineralisaatiota. Osoitimme, että ERK-, p38-, JNK- ja NF-kB-reitit osallistuvat CD-uutteen välittämään luun muodostukseen ja ALP-, BMP-2- ja OPN-ilmentymiseen. Lisäksi CD-uute esti munasarjojen poiston aiheuttaman in vivo luukadon. Siksi CD voi olla hyödyllinen luun muodostuksen stimuloinnissa osteoporoottisten sairauksien hoidossa.
