Rotan plasman absorboituneiden komponenttien analyysi Cistanchen kvasi-estrogeenifraktion oraalisen antamisen jälkeen

Rotan plasman absorboituneiden komponenttien analyysi Cistanchen kvasi-estrogeenifraktion oraalisen antamisen jälkeen

Lisätietoja: Ali.ma@wecistanche.com

Napsauta kohtaan etäisyys edut ja sivuvaikutukset

Abstrakti:

Rotan plasman ainesosien analysoimiseksi ja tunnistamiseksi aktiivisen fraktion oraalisen annon jälkeencistanche, rotan plasman komponentit havaittiin korkean suorituskyvyn nestekromatografia-elektrospray-ionisaatio-lento-massaspektrometrian nelinkertainen aika (HPLC-Q-TOF MS). Komponenttien rakenteet selvitettiin vertaamalla niiden retentioaikoja ja MS/MS-spektrejä vertailuyhdisteiden spektraatioihin ja kirjallisuudessa raportoidut tiedot.Cistanoside A, Echinacoside, Acteoside, Cistanoside D,7 metaboliittien komponentteja, kuten 3,4-dihydroksifenyylietanoliglykosideja, metylaatioaktieosidia, asetyyliaatiota Cistanoside G,3,4-dihydroksifenyylietanolia, asetyyli tubulosidi B:tä, cistanoidi B-glukuronidimetaboliittia ja metylaatio-3,4 dihydroksifenyylietanolia.cistanche．

Avainsanat:

cistanche; seerumia sisältävä lääke; kvasi estrogeeni; korkean suorituskyvyn nestekromatografia-elektrospray-ionisaatio-lentomassaspektrometrian nelinkertainen aika (HPLC-Q-TOFMS)

Cistanche deserticolaon loiskasvi aavikkopuiden juuressa (kuten haloxylon ammodendron, tamarix jne.). Eräänlaisena ravitsevana ja vahvana arvokkaana kiinalaisena perinteisenä lääketieteenä sillä on erilaisia farmakologisia vaikutuksia, kuten munuaisten Yangin ravitseminen, immuniteetin säätely, ikääntymisen viivästyminen, säteilynesto ja keskushermoston suojaaminen. Se tunnetaan nimellä " aavikon ginseng ". Tällä hetkellä useimmat tutkimukset c. deserticolan aktiivisuudesta kotimaassa ja ulkomailla rajoittuvat farmakologisen aktiivisuuden arviointiin, kun taas sen farmakodynaamisten aineiden perustaa ei ole selvitetty, mikä haittaa vakavasti rationaalista kehitystä ja soveltamistaCistanche deserticola.

Perinteisen kiinalaisen lääketieteen komponentit ovat monimutkaisia ja monipuolisia, ja vasta sen jälkeen, kun komponentit on annettu asianmukaisesti imeytymisen ja aineenvaihdunnan kautta kehossa, komponentit voivat lopulta päästä vereen perinteisen kiinalaisen lääketieteen farmakodynaamisen aineen perustaksi. Nämä vaikuttavat aineet voivat olla perinteisen kiinalaisen lääketieteen prototyyppi tai metaboliitti, tai ne voivat olla uusia ainesosia, jotka muodostuvat perinteisen kiinalaisen lääketieteen eri komponenttien keskinäisestä reaktiosta, tai ne voivat olla endogeenisiä fysiologisia vaikuttavia aineita, jotka syntyvät lääkkeiden suorasta vaikutuksesta kehoon. Siksi nämä veren komponentit voivat edustaa perinteisen kiinalaisen lääketieteen ja yhdistelmälääkkeiden farmakodynaamista ainepohjaa. Analysoimalla komponentteja ja metaboliitteja, jotka voivat päästä vereen suun kautta annon jälkeen, ja etsimällä komponenttien vuorovaikutussääntöjä, voi tarjota tietyn perustan farmakodynaamisten aineiden perustutkimukselle.

Hiirien kohdun painonnousumenetelmää ja MTT-kolorimetriaa käytettiin seulomaan estrogeenin kaltaisia aktiivisia osia ja cistanche deserticolan annostusta. Alustavat kokeelliset tulokset osoittivat, että epäkypsien hiirien kohdun kerrointa nostettiin merkittävästi antamalla intragastrista etanolia (95%) cistanche deserticola -uutetta 30 g /kg päivässä, ja lääkettä sisältävä seerumi edisti McF-7-solujen lisääntymistä merkittävästi (P< 0.="" 01),="" which="" was="" the="" active="" part="" of="" the="" estrogen-like="" effect="" of="" cistanche="">

Tässä tutkimuksessa korkean suorituskyvyn nestekromatografia-nelinkertaistamisaikaa (HPLC-Q-TOF MS) käytettiin analysoimaan ja tunnistamaan cistanchen aktiivisten osien verikomponentit, prototyyppikomponentit ja metaboliitit sen jälkeen, kun estanchea on annettu estrogeenillä, ja spekuloimaan metabolista reittiä, jotta voidaan tarjota perusta perustutkimukselle, joka koskee estanchen farmakodynaamisia aineita estrogeenin kanssa.

1 Kokeellinen osa

1.1 Kojeet ja reagenssit

Waters-600 Nestemäinen kromatografi: Waters Co., LTD., varustettu neljän elementin gradienttipumpulla, automaattisella näytteenottimella, tyhjiökaasunpoistokoneella, kolonnin lämpötilalaatikolla, DAD-ilmaisimella, Empower-kemiallisella työasemalla;

Agilent-1290 6530 -sarjan Q-TOF LC-MS -massaspektrometri: American Agilent -yrityksen tuotteet;

Xw-80a-pyörresekoitin: Shanghai Yugong Machinery Co., LTD.

Dk-80 Sähköinen termostaattinen vesihaude: Shanghai Yiheng Technology Co., LTD.

Alk-110. 4 Analyyttinen tasapaino: Shanghai Renhe Scientific Instrument Co., LTD.

H66MC ultraäänioskillaattori: Ohaus Technology Co., LTD.

Cistanche deserticola: osti San Ke Shu -lääkeyrtemarkkinoilta, jonka professori Zhang Delian Harbinin kaupallisen yliopiston professori Zhang Delian tunnisti Cistanche deserticolaksi.

Mullein (erä nro 111530-200505), echinoside (erä nro 111670-200503), salidroside (erä nro 110736-200628): kaikki kiinan kansallisen farmaseuttisten ja biologisten tuotteiden valvontainstituutin toimittama;

Eteenistilbestrol: Guangzhou Hampden Pharmaceutical Co., LTD. Metanoli ja asetonitriili: HPLC-laatu, Shandong Yuwang Reagenssi Co., LTD. Muut reagenssit olivat analyyttisesti puhtaita.

Kokeellinen vesi: puhdas vesi.

Naaraspuoliset Wistar-rotat: Eränumero SCXK-(JI) 2003 -- 2004, paino (220 ± 20) g, jonka tarjoaa Changchun National Biological Industry Basen kokeellinen eläinkeskus.

1.2 Intragastrisen lääkeliuoksen valmistaminen

Cistanche deserticolan raakajauhe uutetaan refluksiuutolla 95-prosenttisella etanolilla ja uutetaan sitten 8-kertaisella liuottimella 150 minuutin ajan, 6 kertaa liuottimella 75 minuutin ajan ja 6 kertaa liuottimella 75 minuutin ajan peräkkäin. Sitten nämä kolme uutetta yhdistettiin ja kondensoitiin paineen alaisena uutteen saamiseksi, joka säilytettiin jääkaapissa myöhempää käyttöä varten. Ennen käyttöä tislatusta vedestä valmistettiin intragastrinen liuos, jonka konsentraatio oli 1,5 g/ml.

1.3 Vertailuliuoksen valmistaminen

Tarkka määrä mulleinia, salidrosidia ja echinakosidea otettiin ja liuotettiin kokonaan metanoliin 1 ml: n sekakontrastiliuoksen valmistamiseksi, joista kukin sisälsi 0,2 mg kolmea vertailuainetta. Vertailuaineliuos pannaan 0,45 μm:n suodatinkalvon läpi ja asetetaan sivuun.

1.4 Lääkeseerumin ja nollaseerumin valmistus

Lääkeainetta sisältävän seerumin valmistus: punnitse naaraspuoliset Wistar-rotat, anna heille 1 ml /100 g päivässä, anna heille tislattua vettä ja ikeää liuosta kahdesti aamulla ja illalla, 3 peräkkäisenä päivänä, 60 min viimeisen annoksen jälkeen, nukuttaa 2 ml/kg 10%: lla kloorihydraattia intraperitoneaalisella injektiolla. Veri otettiin maksan porttilaskimosta ja sentrifugoidaan 3 000 r/min:n nopeudella 10 minuutin ajan täyden hyytymisen jälkeen. Supernatantti oli silloin huumeita sisältävä seerumi.

Tyhjän seerumin valmistus: rotat olivat intragastrisia, joissa oli yhtä suuri määrä tislattua vettä joka päivä, ja muut valmistusmenetelmät olivat samat kuin lääkeainetta sisältävä seerumi.

mL-lääkettä sisältävää seerumia otettiin, 5 kertaa metanolin määrä lisättiin ja pyörre suoritettiin sentrifugiputkessa 10 minuutin ajan. Sentrifugointi suoritettiin nopeudella 14 000 r /min 10 minuutin ajan, supernatantti imeytyi ja liuotin kuivattiin. Mikropipetillä lisättiin 0,5 ml metanolia jäännöksen liuottamiseksi. Jäännös suodatettiin 0: lla. 22 μm mikrohuokoinen kalvo ja analysoitu kromatografialla.

1.5 Koeolosuhteet

Kromatografiset olosuhteet: Vesien symmetriakilpiTM RP18 -kolonni (4,6 mm × 250 mm × 5 μm); Esipylväs: Nova - PakC18 Guard - PakTM; Virtausnopeus: 0,5 ml/min; Injektiotilavuus: 10 μl; Liikkuva faasi: asetonitriili-0,2% muurahaishapon vesiliuos; Kaltevuusolosuhteet: 0-35 min, 5-34% asetonitriiliä, 35-65 min, 24-26% asetonitriiliä; Kolonnin lämpötila: 30 °C; Havaitsemisen aallonpituus: 254 nm.

Massaspektrometrian ehdollinen ionilähde: Ilmakehän paineen elektrospray-ionisaation (ESI) lähde; Virtausnopeus: 0,5 ml/min; Sumuttava kaasunpaine: 0,2 MPa; Kuivan kaasun virtausnopeus :8. 0 l/min; Kuiva lämpötila:30 °C; Kapillaarijännite: 3,5 kV; Vaippakaasun virtausnopeus: 12,0 l/min; Huotran lämpötila:400 °C. Positiivinen ja negatiivinen ioniskannaustila on valittu, ja massaskannausalue on m/z 100 ~ 3 000.

2 Tulokset ja keskustelu

2.1 HPLC-ESI-Q-TOF MS/MS -analyysi Cistanche deserticolan estrogeeniaktiivisten osien seerumin seerumin kemiallisista ainesosista

Kvalitatiivinen analyysi suoritettiin lääkkeitä sisältäville seeruminäytteille rotilta Cistanche deserticolan estrogeeniaktiivisessa osassa ESI-MS-ilmaisimella. Skannaukseen käytettiin positiivista ionitilaa ja negatiivista ionitilaa, ja tulokset on esitetty kuvassa 1. Vertaamalla kuvan 1 kahden skannaustilan ensimmäisen tason massaspektrometrian kokonaisionivirtauskaavioita havaittiin, että negatiivisessa ionitilassa saadulla kokonaisionivirtauksella oli vahvat ominaisuudet ja suuri herkkyys, joten tässä kokeessa valittiin negatiivinen ionitilan skannaus.

Negatiivisessa ionitilassa esI-MS-ilmaisinta käytettiin rotan seerumin kvalitatiivisen analyysin suorittamiseen Cistanche deserticolan estrogeeniaktiivisen osan antamisen jälkeen. Nollaseerumin ja antoseerumin ensimmäisen tason skannauksen kokonaisionivuokaavion vertailevan analyysin avulla merkittiin yhteensä 13 molekyyli-ionihuippua, kuten kuvassa 2 esitetään. Huippujen 2, 3, 5, 7, 9 ja 10 oletettiin olevan prototyyppikomponentteja, ja huippujen 1, 4, 6, 8, 11, 12 ja 13 oletettiin olevan aineenvaihduntakomponentteja.

Kunkin kromatografisen piikin negatiivisessa ionitilassa havaitsemien molekyyli-ionipiikkien ja vastaavan tyypillisen fragmentin antaman suhteellisen molekyylipainon mukaan merkittiin yhteensä 13 ms:n piikkejä. 13 piikin kemialliset ainesosat tunnistettiin vertaamalla kunkin standardiaineen UV-MS-tietoja ja viittaamalla kirjallisuudessa ilmoitettuihin komponentteihin, jotka on lueteltu taulukossa 1.

Kuusi prototyyppikomponenttia olivat geniposidi, salidrosidi, Cistanche-glykosidi a, Echinacea-glykosidi, Mullein-glykosidi ja Cistanche-glykosidi D;

Seitsemän metabolista komponenttia olivat 3,4-dihydroksifenyylietanyyliglykosidi, metyloitu Mullein-glykosidi, asetyylioitu Cistanche-glykosidi g, 3,4-dihydroksifenyylietanoli, asetyyli tubulosidi B, Cistanche-glykosidi B-glukuronihappometaboliitti ja metyloitu-3,4-dihydroksifenyylietanoli. Seitsemästä metaboliitista arvellaan, että huippu 1 (3,4-dihydroksifenyylietanoli), huippu 8 (3,4-dihydroksifenyylietanoli) ja huippu 13 (metyloitu 3,4-dihydroksifenyylietanoliglykosidi) ovat fenyylietanoliglykosidien hydrolyyttisiä fragmentteja Cistanche deserticolassa; Huippu 4 (metyloitu Mullein-glykosidi) on Mullein-glykosidin metaboliitti; Huippu 6 (asetyylioitu Cistanche-glykosidi g) on Cistanche-glykosidi G:n metaboliitti; Huippu 11 (asetyyliguanosiini b) on guanosiini B:n metaboliitti; Huippu 12 (Cistanche-glykosidin b glukonihapon metaboliitti) on Cistanche-glykosidin B metaboliitti.

Kiinalaiset merkit laaja selitys:

质谱信息 edustaa massaspektritietoa.

相对分子质量 edustaa suhteellista molekyylimassaa

化合物推测结果 edustaa yhdistetyn spekulaation tuloksia

代谢 edustaa aineenvaihduntakomponentteja

原型 edustaa prototyyppikomponentteja

2.2 Keskustelu

Tässä kokeessa hplc-q-tof MS:ää käytettiin tunnistamaan seerumin 13 pääkromatografista huippua estrogeenin antamisen jälkeen, kuten Cistanche deserticolan aktiivinen osa. Nämä voivat olla Cistanche deserticolan suoravaikutteisia aineita in vivo. Samalla se heijastaa myös sitä, että perinteisen kiinalaisen lääketieteen tehokkuus on seurausta monikomponenttisesta koordinoinnista, täydentävyydestä tai rajoittamisesta. Analysoimalla 13 siirtymäkomponenttia veressä osoitettiin, että fenyylietanoliglykosidit olivat Cistanche deserticolan tärkeimmät aktiiviset komponentit. Seurantatutkimuksessa vastaava spektrivaikutussuhde muodostetaan lääkevaikutuskorrelaation tutkimiseksi, jotta voidaan edelleen selventää lääkevaikutuksen aineellista perustaa ja määrittää monikomponenttien annos-, aika- ja vaikutussuhde kehon eri aikapisteissä Cistanche deserticolan metabolisen reitin ja metabolisen tilan paljastamiseksi.

3 Päätelmät

Tässä kokeessa hplc-esi-q-tof MS / MS -tekniikkaa käytettiin estrogeenin verikomponenttien, kuten Cistanche deserticolan aktiivisten osien, analysointiin, ja tunnistettiin 13 kemiallista komponenttia, mikä on erittäin tärkeää estrogeenin farmakodynaamisen materiaaliperustan selvittämiseksi, kuten Cistanche deserticolan aktiiviset komponentit, ja se voi myös tarjota luotettavan perustan Cistanche deserticolan lisätutkimukselle ja kliiniselle lääkityksellä.