Munuaisten hyljintäriskin karakterisointi ennen siirtoa ja sen jälkeistä B-solujen immuunijärjestelmän sekvensointia

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Immuunirepertuaarin tutkiminen elinsiirron yhteydessä tarjoaa tärkeää tietoa siitä, kuinka adaptiivinen immuniteetti voi edistää ja muuttaa siirteen hylkimistä. Tässä luonnehdimme yksilöiden ääreisveren immuunijärjestelmää ennen ja jälkeenmunuainenelinsiirto käyttäen B-solureseptorisekvensointia pitkittäistutkimuksessa. Henkilöillä, joille kehittyy hylkimisreaktio elinsiirron jälkeen, on monimuotoisempi immuunijärjestelmä ennen siirtoa, mikä viittaa taipumukseen siirroksen jälkeiseen hyljintäriskiin. Lisäksi yli 2 vuoden seurannan aikana potilailla, joille kehittyy hyljintäreaktio, on tietty joukko laajennettuja klooneja, jotka säilyvät hylkimisreaktion jälkeen. Vaikka perifeeristen B-solujen monimuotoisuus on yleisesti vähentynyt, mikä johtuu todennäköisesti lisääntyneestä yleisestä immunosuppressioaltistuksesta tässä kohortissa, spesifisen IGHV-geenin käytön havaitseminen kaikissa hyljintäpotilaissa tukee sitä, että yhteinen immunogeenisten antigeenien pooli voi aiheuttaa transplantaation jälkeistä hylkimistä. Löydöillämme voi olla kliinisiä vaikutuksia munuaissiirteen hylkimisreaktion ennustamiseen ja kliiniseen hoitoon.

Munuainenelinsiirto on loppuvaiheen munuaissairauden (ESRD) ja kroonisen edullinen hoitomunuainensairaus. Vaikka tekniikoissa ja kudosten yhteensovittamisessa on tapahtunut merkittäviä parannuksia luovuttajan/vastaanottajan ihmisen leukosyyttiantigeenien (HLA)l:n histoyhteensopivuustestien perusteella, siirteen lopputuloksen ennustaminen on edelleen ratkaisematon ongelma. Mitattu kudosten yhteensopimattomuus muissa vähäisissä, ei-HLA-lokuksissa23 voi myös aiheuttaa alloimmuunivaurioita, joihin liittyy akuutti ja krooninen hyljintä, mikä johtaa huonoihin pitkäaikaisiin siirrännäisiin4. Lisäksi noin 50 prosenttiamunuainenallograftit, joissa ei ole merkittäviä HLA-yhteensopivuuksia, menetetään edelleen 10 vuoden sisällä siirrosta². Olemme aiemmin olettaneet, että ei-HLA-lokukset voivat vaikuttaa vastaanottajan immuunivasteeseen hänenmunuainendonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1013 erilaista vasta-ainetta0, joiden avulla ne voivat tunnistaa suuren joukon vieraita antigeenejä. Ihmisen BCR tai Ig koostuu kahdesta identtisestä raskaasta ketjusta (I), jotka muodostuvat viidestä isotyypistä: IgM, IgD, IgA, IgE ja IgG, ja kahdesta kevyestä ketjusta. Ehjä vasta-aine sisältää vaihtelevan ja vakiodomeenin. Antigeenisitoutuminen tapahtuu variaabelissa domeenissa, joka syntyy muuttujan (V), monimuotoisuuden (D) ja yhdistävien (J) geenisegmenttien rekombinaatiolla, jotka muodostavat B-solujen immuunivalikoiman, ja sen monimuotoisuus keskittyy pääasiassa komplementaarinen määräävä alue 3 (CDR3). Affiniteettikypsymisprosessin aikana vaihtelevalla alueella tapahtuu somaattista hypermutaatiota (SHM). Tehokas adaptiivinen immuunivaste on riippuvainen B-solukloonien laajentumisesta ja prosessista, jota kutsutaan affiniteettikypsymiselle, jonka aikana Ig-geenien uudelleenjärjestelyihin tuodaan somaattisia mutaatioita ja valitaan B-soluja, joilla on korkeampi affiniteetti tiettyyn antigeeniin.

Elinsiirron immuunijärjestelmän tutkiminen on ratkaisevan tärkeää, jotta voidaan ymmärtää, mikä laukaisee ja ylläpitää hyljintäprosessia ja kuinka se voi lopulta nopeuttaa tietä siirteen epäonnistumiseen. Seuraavan sukupolven sekvensoinnin ja vankkojen laskennallisten lähestymistapojen ansiosta voimme tutkia VDJ-aluetta yksityiskohtaisesti,12. Tähän mennessä T-solujen immuunijärjestelmän analyysimunuainenelinsiirto on tehty hyvin rajallisille potilaille3-15, ja vaikka BCRSeq:ia on sovellettu muihin sairauksiin ja ihmisen immuunivasteisiin, kuten multippelissdleroosiin6, influenssarokotteeseen7tai immuunikatohäiriöihin8, siirtotutkimukset ovat puutteellisia. hylkääminen. Jonkin sisällämunuainenelinsiirto, BCRSeq on suoritettu vain toleranssin yhteydessä, HLA-herkistettymunuainenelinsiirtoehdokkaat, joille tehdään herkkyyshoitoa20, ja B-soluinfiltraatio vertaamalla kloonin laajentumista veressä ja graft2l:ssä. Toinen BCRSeq-sovellus siirrossa julkaistiin aiemmin pienessä 12 sydämensiirtopotilaan ryhmässä.

Tunnistaen immuunivasteen humoraalisen haaran merkityksen myöhäisessä siirteen hylkimisreaktiossa ja kroonisessa allograftin vajaatoiminnassa, karakterisoimme perifeerisen veren immuunijärjestelmän käyttämällä BCRSeq:ia prospektiivisessa pitkittäistutkimuksessa. Havaitsemme, että immuunijärjestelmän monimuotoisuus ennen elinsiirtoa on suurempi niillä yksilöillä, jotka hylkäävätmunuainenjoka osoittaa myös tiettyjen kloonien ja IGHV-geenien laajentumisen 24 kuukauden seurannan aikana. Nämä tulokset voivat auttaa ennustamaan hyljintäriskiä ennen istutusta, ja niillä voi olla kliinisiä vaikutuksia tiettyjen hylkimisreaktiota aiheuttavien antigeenien havaitsemiseen.

Cistanche on hyvä munuaisten toiminnalle

Tulokset

Opiskeluaineita. Suoritimme BCRSeq:n 83 ääreisverinäytteessä 27 ainutlaatuiselta potilaalta ja toteutimme kuvassa 1 esitetyn analyyttisen putkilinjan. Tässä tutkimuksessa otettiin huomioon kolme kliinistä fenotyyppiryhmää, jotka määriteltiin Banff-kriteereillä 23, 24 ja kroonisten allograftivaurioindeksin (CADI) pisteytyksen perusteella saaduilla allograftibiopsioiden keskeisten patologioiden sokkotuloksilla: Ei-progressoivat (NP; n{6}}) oli alhainen ei-inkrementaalinen CADI-pistemäärä ilman akuuttia hyljintäreaktiota, edistyneillä ilman hylkäämistä (PNR;n=10) ​​oli CADI-pisteiden lisäys yli 2 vuoden aikana ilman hylkäämistä, ja progressiivisilla, joilla oli hylkäys (PR; n=7) lisääntyvät korkeat CADI-pisteet yli 2 vuoden aikana hylkäysjaksoilla. Väestötiedot, syytmunuainenTaulukossa 1 on esitetty immunosuppression käyttö. On tärkeää korostaa joitakin näiden potilaiden ominaisuuksia. Vanhempaintutkimuksessa, johon nämä potilaat otettiin mukaan, oli yleisesti alhainen (17 prosenttia) biopsialla vahvistettujen akuuttien hylkimisreaktioiden määrä (keskimääräinen {min, max}=12 {6,24}kk hyljintäaika). Kaikilla näillä potilailla oli alhainen immunologinen hylkimisriski (reaktiivisen vasta-aineen herkistymisen huippupaneeli).<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">

B-solujen immuunijärjestelmän sekvensointi. BCRSeq tehtiin verihyytymistä uutetuilla genomi-DNA-näytteillä (gDNA) 81 näytteellä 27:stämunuainenelinsiirtojen vastaanottajat kolmena ajankohtana (0,6,24 kuukautta). Sekvensointi tuotti yhteensä 327 703 lukua (keskiarvo 4045/näyte) laadunvalvonnan jälkeen (katso menetelmäosa). Tulosten validointia ja kunkin isotyypin lisäarviointia varten loimme lisäksi RNA:ta yhteensopivista PBMC:istä, jotka olivat saatavilla 55 näytteelle, kerättiin samaan aikaan verihyytymän kanssa, ja suoritimme komplementaarisen DNA:n (cDNA) sekvensoinnin suuremmalla syvyydellä, jolloin saatiin 1 773 330 lukua. IgD:lle (keskiarvo 31 667/näyte), 1 708 227 lukua IgM:lle (keskiarvo 30 504/näyte), 973 444 lukua IgA:lle (keskiarvo 17 383/näyte), 139 7345 lukemaa IgG:lle, 9,2,24 ample,{3,24 ample }} lukee IgE:lle (keskiarvo 5178/näyte) (lisäkuva 1). Jokaisen isotyypin kirjastot monistettiin erikseen ja yhdistettiin sitten sekvensointia varten; siksi vertaileva ristiin isotyyppianalyysi ei ole mahdollista.

Kuten kuvassa 1b on esitetty, määritimme kloonin ryhmäksi soluja, jotka polveutuvat yhteisestä esi-isämolekyylistä, jolla on sama IGHV- ja IGHJ-segmentti, sama CDR3-pituus ja 90-prosenttinen nukleotidi-identtisyys CDR3-solujen välillä, kuten aiemmin määriteltiin adaptiivisen B:n tutkimuksissa. -soluvasteet'8. Tämän määritelmän avulla voidaan tutkia monimuotoisuutta, yhteisiä tai yhteisiä kartioita ja kloonin laajenemista alloimmuniteetin yhteydessämunuainenelinsiirrot. Ainutlaatuisten kartioiden lukumäärä yksilöä kohti kullakin aikapisteellä on esitetty pylväskuvana lisämateriaalissa (lisäkuva 1). Tietojen analysoinnin tiukuuden vuoksi diskontasimme näytteitä<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">munuainenelinsiirto, jolle on ominaista Epstein Barrin lisääntyminen

Kuva 1Yleinen tutkimusputki.a Kaavioesitys vasta-ainerakenteesta ja VDJ-rekombinaatioprosessista, joka on vastuussa immuunijärjestelmän tuottamasta monimuotoisuudesta.b ​​B-soluklooni, joka määritellään soluiksi yhteisestä esi-isästä ja tutkimuksen analyyttinen putki: B-solu gDNA:n ja cDNA:n sekvensointi, monimuotoisuusanalyysi ottaen huomioon kloonien lukumäärä (rikkaus) ja kunkin kloonin tiheys (Shannon-entropia), verkkoanalyysi sekä klooni- ja IGHV-geenianalyysi

viruksella (EBV) infektoituneet B-solut. Havaitsimme lisääntyneen kloonien määrän hetkellä 6 tässä potilaassa, jolloin klooninen monimuotoisuus oli aiemmin pienempimunuainen24 kuukautta munuaisensiirron jälkeen. Koska kirjastot monistettiin muuttumattomasta määrästä templaattia, suurempi B-solujen osuus veressä on saattanut johtaa suurempaan määrään klonotyyppejä, jotka ovat edustettuina sekvensoiduissa tuotteissa. Tämän potilaan erilaisen ja ainutlaatuisen patologisen prosessin vuoksi tämä näyte jätettiin pois tulevasta analyysistä.

Elinsiirtoa edeltävä B-solujen monimuotoisuus liittyy hylkimiseen. Kuten kuvasta 1c näkyy, tutkimme B-solujen immuunijärjestelmän monimuotoisuutta ottaen huomioon lajien rikkauden (yksilöllisten kloonien lukumäärä) ja Shannonin entropian (yhtälö (1) menetelmistä) eri aikapisteissä ja kliinisissä tuloksissa käyttämällä lineaarista regressiomallia ottaen huomioon lukumäärän. kloonien tai entropian riippuvainen muuttuja ja kliininen tulos tai SHM riippumattomana tekijämuuttujana. Repertuaari ennenmunuainensiirto PR:ssa oli huomattavasti monimuotoisempi kuin NP:ssä (rikkaus: P-arvo=0,005, entropia: P-arvo=0,01) ja sama trendi jatkui 6 kuukauden kuluttuamunuainensiirto (rikkaus: P-arvo=0.02, entropia: P-arvo=0,02), eikä erottelevia ryhmäeroja 2 vuoden kuluttua siirrosta (kuva 2a ja täydentävä kuva 2). cDNA-sekvensointitiedot transplantaation jälkeen osoittivat saman suuntauksen suuremmassa valikoimassa 6 kuukautta siirron jälkeen, pääasiassa IgD-isotyypeillä (rikkaus: P-arvo=0.02, entropia: P-arvo=0). 03) (Kuva 2b ja lisäkuva 2). Ei ollut hämmentävää vaikutusta tietoihin useista demografisista ja kliinisistä muuttujista, kuten vastaanottajan ikä, sukupuoli, rotu, luovuttajan lähde, immunosuppression tyyppi, HLA-epäsopivuus ja munuaisten vajaatoiminnan syy. Koska 1-vuotiaan (tiedoissa vähimmäisikä) ja 19-vuotiaan (tiedoissa oleva enimmäisikä) B-soluvaste saattaa olla hyvin erilainen, suoritimme herkkyyden analyysi, jossa nämä kaksi potilasta jätettiin pois, ja tulokset pysyivät merkittävinä (NP vs. PR hetkellä 0: rikkaus: P-arvo=0.01, entropia: P-arvo=0.03). Toisessa immuunijärjestelmän monimuotoisuuden mittauksessa arvioimme SHM:n, joka määriteltiin mutaatioiden esiintymistiheydeksi kussakin V-geenisegmentissä, ja havaitsimme trendin suuremmalle SHM-määrälle PR:lle ennen siirtoa ja trendin korkeammalle SHM:lle IgD-isotyypissä. PR:ssa 6 kuukautta siirron jälkeen (P-arvo=0,06).

B-solujen monimuotoisuus muuttuu ajan mittaan kliinisen tuloksen mukaan. Selvittääksemme, muuttuuko immuunijärjestelmän monimuotoisuus ajan mittaan kliinisen tuloksen mukaan, mallisimme pitkittäistiedot käyttämällä lineaarisia sekavaikutusmalleja ottaen huomioon kliinisen tuloksen ja ajan välisen vuorovaikutuksen. Havaitsimme, että NP ja PR käyttäytyivät eri tavalla ajan kuluessa siirron jälkeen, mikä osoitti NP:n monimuotoisuuden lisääntymistä ja PR:n monimuotoisuuden vähenemistä, kun taas PNR:n monimuotoisuus pysyi muuttumattomana ajan kuluessa. Tämä havaittiin gDNA:lle (rikkaus: P-arvo=0.007, entropia: P-arvo=0.001, kuva 3a) ja kaikille cDNA:n isotyypeille. Merkittävimmät erot entropiassa olivat IgM- ja IgD-isotyypeille (IgA: P-arvo=0.07, IgD: P-arvo=0.02, IgG: P-arvo=0.05, IgM: P-arvo=0.04, kuva 3b). Rikkauskäyrät vastaavien P-arvojen kanssa on esitetty lisäkuvassa 3. Kuten käyrissä havaittiin, yhdellä yksilöllä on ylimääräinen näyte 32 kuukauden kohdalla, mikä saattaa vääristää tuloksia, joten herkkyysanalyysi suoritettiin jättämällä tämä näytettä pois analyysi ja samanlaisten tulosten havainnointi lukuun ottamatta IgG- ja IgM-isotyyppejä, joissa merkitys katoaa (gDNA-entropia: P-arvo=0.004. cDNA-entropia: IgA: P-arvo=0.1) , IgD: P-arvo=0.05, IgG: P-arvo=0.08, IgM: P-arvo=0.1).

Biologinen ja tekninen näytteenotto voi vaikuttaa monimuotoisuuteen. Näytteen monimuotoisuus voi poiketa huomattavasti repertuaarin yleisestä monimuotoisuudesta, koska vain murto-osa miljardeista soluista on edustettuna, mikä tunnetaan puuttuvan lajin ongelmana. Tekninen näytteenotto voi olla olemassa, koska jokainen näyte voi vaihdella sekvensointisyvyydeltään ja jossain määrin kokeellisia virheitä. Puuttuvien lajien ongelman ratkaisemiseksi käytimme Recon-työkalua (arvioitujen kloonien rekonstruointi havainnoista)29, joka arvioi kloonin kokonaiskokojakauman. Recon tuottaa tarkkoja ja vankkoja arvioita monimuotoisuuden mittareista, mukaan lukien rikkaus ja entropia, mikä mahdollistaa yksilöiden välisen monimuotoisuuden luotettavan vertailun. Sekvensointisyvyyden ja jonkinasteisten kokeellisten virheiden käsittelemiseksi suoritimme alasnäytteenottostrategian; erittäin hyvin käytetty strategia immuunirepertuaarianalyysissä11,17,30. Recon-analyysissä (lisäkuva S4: A-E) sekä rikkaus että monimuotoisuus toistettiin gDNA-tiedoille. cDNA-tiedoissa aika 6 IgD-isotyyppi osoittaa trendin, mutta se ei saavuttanut merkitystä, vaikka pitkittäiset tulokset IgA-, IgD- ja IgG-isotyypeille toistettiin. Alasnäytteenottoanalyysissä (lisäkuva S4: F–J) kaikki toistetaan, mutta gDNA-tietojen aika on 0. Tämä saattaa johtua näytteenottoa koskevasta rajoituksesta

Kuva 2 Viulukaaviot, jotka osoittavat kloonien lukumäärän (rikkauden) kolmen kliinisen tuloksen välillä. useita klooneja ajoittain 0, 6 ja 24 gDNA-näytteistä. b Kloonien lukumäärä hetkellä 6 IgD-isotyypillä cDNA-näytteistä. P-arvot saadaan säätämällä lineaarista regressiomallia, jossa kloonien lukumäärä on riippuvainen muuttuja ja kliininen tulos riippumaton tekijämuuttuja (n=27 näytettä). Viulukaaviot edustavat datan todennäköisyystiheyttä kullakin arvolla. Pistemerkki edustaa mediaaniarvoa kvartiilivälillä. Lähdetiedot toimitetaan lähdetietotiedostona

Kuva 3 Pitkittäiset tiedot, jotka on piirretty kullekin kliiniselle tulokselle sovitetulla viivalla. a Shannonin entropialla mitattu monimuotoisuus, joka edustaa eri aikapisteitä kolmella gDNA:n kliinisellä tuloksella (NP, PNR, PR). b Shannonin entropialla mitattu monimuotoisuus, joka edustaa eri aikapisteitä kolmella kliinisellä tuloksella (NP, PNR, PR) cDNA:n isotyypeillä. P-arvot vastaavat vuorovaikutustermiä, jonka määrittää aika × kliininen tulos mukauttamalla lineaarista sekavaikutusmallia (n=27 näytettä). Jokainen piste edustaa entropiaa näytettä kohti ajan mittaan sovitetulla viivalla ja luottamusvälillä. Lähdetiedot toimitetaan lähdetietotiedostona

strategioita, erityisesti gDNA-datalle, jossa sekvenssien lukumäärä on paljon pienempi kuin cDNA-datalla. gDNA:ssa rajoitimme analyysin yksilöihin, joilla oli vähintään 1000 kloonia, jotta säilytettiin riittävästi sekvenssejä. Alasnäytteenotto suoritettiin vähintään 1062 kloonille verrattuna 62 173 klooniin cDNA:ssa. Tästä rajoituksesta huolimatta havaitsimme trendin ajalle 0, säilytimme gDNA:n pitkittäisanalyysin merkityksen ja toistimme kaikki assosiaatiot cDNA:ssa. Molemmissa analyyseissä (recon ja downsampling) toistimme tulokset huolimatta joistakin tässä korostetuista rajoituksista, mikä osoitti aiemmin raportoitujen tulosten pätevyyden.

B-soluverkot osoittavat eroja kloonaalisessa laajenemisessa. B-soluvalikoima voidaan luonnollisesti esittää sekvenssidiversiteettiin perustuvana verkkona31. Tiedoissamme kehitimme jokaiselle näytteelle visuaalisen verkon (Kuva 4 ja täydentävät kuvat 5-7), jossa kukin huippu edusti ainutlaatuista BCR:ää ja identtisten BCR:ien lukumäärä niiden nukleotidisekvenssien perusteella määritteli kärjen koon. Piikkien välillä on reuna, kun ne kuuluvat samaan klooniin, joten B-solujen klusterit voidaan esittää toisiinsa yhdistettyjen kärkien ryhminä, jotka muodostavat kloonin. Verkon kvantifiointiin käytimme Gini-indeksiä, joka on epätasaisuusmitta, jota sovellettiin kärki- ja klusterijakaumiin. Vertexin kokoon Gini(V) sovellettaessa yleisklonaalinen luonne on edustettuna. Jos Gini(V) on lähempänä arvoa 1, kärjet ovat eriarvoisia osoittaen joidenkin niistä laajenemista, ja muuten lähempänä 0. Klusterin kokoon Gini(C) sovellettu klooninen dominanssi on edustettuna. Jos lähempänä arvoa 1, klusterit ovat eriarvoisia ja edustavat siksi hallitsevia klooneja, jos lähempänä arvoa 0, kaikki klusterit ovat samankokoisia.

Kuvassa 4 näytämme esimerkin merkittävistä visuaalisista ja kvantitatiivisista eroista edustavien B-soluvalikoiman välillä kustakin kolmesta kliinisestä tulosryhmästä kolmella eri aikapisteellä (ennen siirtoa ja siirron jälkeen 6 ja 24 kuukautta) . PR-valikoimassa on runsaasti B-solusekvenssejä, jotka muodostavat enemmän ja suurempia klooniklustereita verrattuna NP:hen, kun taas PNR sijaitsee niiden välissä. Ajan mittaan PR-ryhmä osoittaa BCR:n ja ainutlaatuisten kloonien määrän laskua NP:hen verrattuna. Jokaisen tutkimukseen osallistuneen henkilön yksityiskohtaiset B-soluverkot on esitetty lisäkuvissa 5–7. On mielenkiintoista tarkkailla B-soluverkoston hyvin monimuotoista mallia yksilössä, jolle kehittyi PTLD NP-ryhmässä (täydentävä kuva 5), ​​ilman B-solujen laajentumista ennen siirtoa, minkä jälkeen B-solujen lisääntyminen kuuden vuoden jälkeen kuukautta ja selkeä klooninen laajeneminen, johon liittyy monimuotoisuuden väheneminen 24 kuukautta siirron jälkeen.

Gini-indeksimittauksen lisäarvioinnissa (kuva 5) PR-ryhmä osoitti jatkuvasti huomattavasti korkeampia mittareita sekä kärjessä että klusterissa NP-ryhmään verrattuna, mikä viittaa siihen, että PR-ryhmän potilailla oli suurempi klooninen laajeneminen lähtötasolla.

Kuva 4 B-solujen repertuaariverkostot kolmelta yksilöltä, jotka edustavat kolmea kliinistä tulosta eri aikapisteissä. Jokainen kärki edustaa ainutlaatuista BCR:ää, joka on huippupisteen koko, jonka määrittää identtisten BCR:ien lukumäärä ottaen huomioon nukleotidisekvenssit. Piikkien välillä on reuna, kun ne kuuluvat samaan klooniin kuin aiemmin on määritelty, joten klusterit ovat toisiinsa kytkettyjen kärkien ryhmiä, jotka muodostavat kloonin. Jokainen näyte näyttää gini-indeksin, joka on saatu kärjen koolle (Gini(V)) ja klusterin koolle (Gini(C)). BCR heijastaa kyseisen näytteen B-solureseptorien kokonaismäärää ja kloonit yksilöllisten kloonien kokonaismäärää. Lähdetiedot toimitetaan lähdetietotiedostona

ja hallitsevien kloonien osajoukon siirron jälkeinen lisälaajennus (P-arvo [lineaarinen regressio] < 0.05,="" kuva="" 5).="" pnr-ryhmä="" sijoittuu="" np:n="" ja="" pr:n="" väliin,="" kuten="" aiemmin="" on="" esitetty,="" vaikka="" tämä="" aika="" on="" merkittävästi="" erilainen="" kuin="" np-ryhmä="" hetkellä="" 24="" (p-arvo="" [lineaarinen="" regressio]="">< 0,05).="" vaikka="" tiedot="" kuviolle="" 5="" luotiin="" gdna-tiedoista,="" cdna:n="" igm-isotyyppi="" osoitti="" samat="" erot="" (p-arvo="" [lineaarinen="" regressio]="0.05)" (täydentävä="" kuva="">

Tietyt kloonit ja IGHV-geenit liittyvät hylkimiseen.

Vaikka ensisijaisena tavoitteenamme oli luonnehtia B-soluvalikoimaa kliinisten tulosryhmien mukaan, mikä antaa kokonaiskuvan immuunivasteesta ennen ja jälkeen siirtoa, tietomme mahdollistivat myös Ig-sekvenssispesifisen analyysin kloonissa ja IGHV:ssä. geenitaso.

Kloonianalyysiä varten arvioimme kunkin tietyn kloonin (118 223 kloonin kokonaismäärä) läsnäolon tai puuttumisen yhteyttä kliiniseen tulokseen (PR, PNR, NR) kullakin aikapisteellä. Käyttämällä Fisherin tarkkaa testiä löysimme 8, 4 ja 21 kloonia, jotka liittyivät nimellisesti kliinisiin tuloksiin kunkin 0, 6 ja 24 kuukauden kohdalla (lisätaulukko 1). Vaikka yksikään ei läpäissyt usean testauksen korjausta, pääasiassa tehon puutteen vuoksi, koska meillä on rajoitettu näytekoko analyysissä tuhansien parametrien (kloonien) kanssa, voimme havaita, että muutamat kloonit, jotka lähestyivät merkitsevyyttä (P-arvo < {{="" 11}}.05)="" jaettiin="" vain="" pr-ryhmän="" potilaille="" ja="" rikastutettiin="" 24="" kuukautta="" siirron="">

Pohdimme myös, säilyivätkö jotkin kloonit näytteenottoajan yli, enemmän kuin toiset, kunkin kliinisen tuloksen sisällä (lisäkuva 9). Otamme huomioon kaksi eri mittaa: (1) pysyvien kloonien lukumäärä ja (2) kloonien laajeneminen. Havaitsimme, että kloonit, jotka olivat pysyviä PR:ssa, olivat huomattavasti laajentuneempia (P-arvo [lineaarinen regressio]=0,01, PR vs. NP) ja osoittivat trendin, että pysyvien kloonien määrä oli suurempi (P- arvo [lineaarinen regressio]=0.09). Tutkimme edelleen, jaettiinko nämä pysyvät kloonit myös eri yksilöiden kesken kunkin kliinisen tuloksen sisällä. 263 havaitusta pysyvästä kloonista 23 jaettiin yksilöiden kesken. Viisi jaettiin samassa PNR:ssä ja kuusi PR-ryhmässä, eikä klooneja jaettu NP-ryhmän välillä. Yhteensä 12 yhteistä kloonia oli yhteisiä molemmissa potilasryhmissä, joilla oli ajan mittaan etenevä krooninen siirtovaurio ja fibroosi (PR ja PNR). Luettelo yksilöiden kesken jaetuista klooneista on lisämateriaalissa (lisätaulukko 2).

Seuraavaksi suoritimme IGHV-geenianalyysin tarkastelemalla IGHV-geenin käyttöä näytettä kohti, joka määriteltiin kuinka monta kertaa kutakin IGHV-geeniä on käytetty, normalisoitiin kloonien lukumäärällä (jota vältetään tiettyjen IGHV-geenien näytteenottopoikkeama), suodatettiin pois heikosti ilmentyneet.

Kuva 5 Vertex Gini -indeksi piirrettynä Cluster Gini -indeksiä vastaan. Sirontakaavio edustaa kutakin näytettä aikoina 0, 6 ja 24. Laatikkokaaviot osoittavat Gini(V)- ja Gini(C)-erot hetkellä 24. P-arvot saadaan lineaarisen regressiomallin säädöstä pitäen Gini(V) ja Gini(C) riippuvaisena muuttujana ja kliininen tulos riippumattomana tekijämuuttujana kullekin aikapisteelle (n=27 näytettä). Boksikaaviossa näytetään vain aika 24, mutta aika 0 ja 6 ovat myös merkityksellisiä NP vs. PR:lle: aika 0: P (Gini (V))=0.1, P ( Gini(C))=0.05; aika 6 P (Gini(V))=0.02, P (Gini(C))=0.01; aika 24: P (Gini(V))=0.003, P (Gini(C))=0.01. Laatikon sisällä oleva juova edustaa mediaaniarvoa, laatikko määrittää kvartiilivälin (IQR) ja viikset määrittelevät ensimmäisen ja kolmannen kvartiilin ± 1,5 × IQR. Lähdetiedot toimitetaan lähdetietotiedostona

geenit (IGHV-geenin käyttö > {{0}.05 vähintään 10 prosentissa näytteistä) ja käyttämällä lineaarista regressiomallia niiden geenien löytämiseksi, jotka liittyivät jokaisen kliinisen tuloksen kanssa, joka ajankohtana. Niistä 27 IGHV-geenistä, jotka läpäisivät alhaisen ilmentymisen suodattimen, löysimme merkittäviä geenejä PR- ja NP-ryhmän välillä (P-arvo < 0,05)="" kolmella="" geenillä="" hetkellä="" 0,="" 7="" hetkellä="" 6="" ja="" 16="" klo.="" aika="" 24="" (kuvat="" 6a–c).="" näistä="" geeneistä="" 1="" (ighv3-11)="" hetkellä="" 0,="" 5="" geeniä="" (ighv3-7,="" ighv3-15,="" ighv3-21,="" ighv3-23,="" ighv{="" {22}})="" ajanhetkellä="" 6="" ja="" 16="" geeniä="" (ighv1-8,="" ighv1-18,="" ighv1-46,="" ighv2-="" 5,="" ighv3-7,="" ighv{{="" 30}},="" ighv3-15,="" ighv3-23,="" ighv3-30,="" ighv3-33,="" ighv3-48,="" ighv3-74,="" ighv{{37="" }},="" ighv4-59,="" ighv4-61,="" ighv5-51)="" hetkellä="" 24="" läpäisi="" väärän="" havaitsemisnopeuden="" (fdr)="" usean="" testauksen="" korjauksen.="" mielenkiintoista="" on,="" että="" havaitsimme,="" että="" ighv3-23="" oli="" merkittävin="" ja="" runsain="" geeni="" kaikissa="" kolmessa="" aikapisteessä="" np="" vs.="" pr="" -vertailussa="" (aika="" 0:="" p-arvo="0.04," aika="" 6:="" p-="" arvo="0.003," aika="" 24:="" p-arvo="0.02)" (kuva="" 6d).="" lisäksi="" arvioimme,="" olivatko="" ighv{56}}-sekvenssit="" yliedustettuina="" edellisen="" kloonianalyysin="" jaettujen="" sekvenssien="" joukossa.="" rikastusanalyysin="" ja="" fisherin="" tarkan="" testin="" avulla="" havaitsimme,="" että="" ighv3-23-sekvenssit="" olivat="" huomattavasti="" yliedustettuina="" molemmissa="" pysyvissä="" klooneissa,="" jotka="" jakautuivat="" yksilöiden="" kesken="" (lisätaulukko="" 2)="" (p-arvo="">< 2,2="" ×="" 10="" -="" 16="" )="" ja="" kloonit,="" jotka="" liittyvät="" kliiniseen="" lopputulokseen="" hetkellä="" 24="" (lisätaulukko="" 1)="" (p-arvo="">< 2,2="" ×="" 10-16).="" havaitsimme,="" että="" nr-ryhmän="" yksilö="" 9,="" jonka="" oli="" havaittu="" jakavan="" joitain="" pysyviä="" klooneja="" edistyneiden="" kanssa="" edellisissä="" analyyseissä,="" luokiteltiin="" pr-ryhmään="" kaikkina="" aikoina.="" ei="" ollut="" hämmentävää="" vaikutusta="" tietoihin="" useista="" demografisista="" ja="" kliinisistä="" muuttujista,="" kuten="" vastaanottajan="" ikä,="" sukupuoli,="" rotu,="" luovuttajan="" lähde,="" immunosuppression="" tyyppi,="" hla-epäsopivuus="" ja="" munuaisten="" vajaatoiminnan="" syy.="" lisäksi="" tämän="" geenin="" havaittiin="" olevan="" myös="" merkittävä="" sekä="" igm="" (p-arvo="" [lineaarinen="" regressio]="0.008)" että="" igd="" (p-arvo="" [lineaarinen="" regressio]="0.05)" isotyypeissä.="" cdna:n="" perusteella="" 24="" kuukautta="" siirron="" jälkeen,="" edellisten="" tulosten="" mukaisesti,="" jotka="" osoittavat="" yhdenmukaisuutta="" näiden="" kahden="" isotyypin="" kanssa,="" jotka="" ovat="" eniten="" rikastuneita="" pr-ryhmässä.="" vain="" kolme="" muuta="" geeniä="" havaittiin="" merkittävinä="" cdna-analyysissä,="" ja="" kaikki="" olivat="" 24="" kuukautta="" siirron="" jälkeen="" igd-="" ja="" igm-isotyypeissä="" (ighv3-15="" ja="" ighv4-="" 61="" igd:ssä="" ja="" ighv{85}}="">

Keskustelu

Monimuotoisuus on immuunijärjestelmän olennainen ominaisuus, ja terveillä ihmisillä se on kriittinen taudinaiheuttajia vastaan ​​sairauksien torjumiseksi. Elinsiirrossa tarkoituksellinen terapeuttinen manipulointi aloitetaan kliinisesti, jotta vieras elin voidaan aktiivisesti jättää huomiotta tai oman potilaan immuunijärjestelmä hyväksyy sen, jotta se ei saa alloimmuunivastetta, mikä johtaa hylkimiseen. B-solut ovat tärkeä osa tätä prosessia, ja ryhmämme ja muut ovat osoittaneet, että ne ovat keskeisiä sekä antigeenin esittelyssä32,33 että allovasta-aineiden tuotannossa34,35. Tässä työssä olemme käyttäneet korkean suorituskyvyn B-solusekvensointia ymmärtääksemme paremmin B-solujen monimuotoisuutta ja klonaalisuuttamunuainensiirrännäisen vastaanottajan verenkierto sekä ennen istutusta että 24 kuukauden seurannan jälkeen B-solujen immuunijärjestelmän pitkittäisarvioinnin kanssa. Kaiken kaikkiaan analyysimme osoittaa suuremman B-solujen monimuotoisuuden ennen istutusta, eroja pituussuunnassa ja monimuotoisuuden vähenemistä, johon liittyy klooninen laajeneminen, ja tietyn IGHV-geenin käytön lisääntymisen niiden keskuudessa, jotka hylkäävät siirteet.

Elinsiirron keskeinen kliininen tarve on ei-invasiivisen, herkän ja tarkan ennusteen puute elinsiirtovauriosta ja huonoista tuloksista. Tätä tehtävää mutkistaa se, että on olemassa erilaisia ​​tekijöitä, jotka vaikuttavat siirteen eloonjäämiseen36. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että stabiileilla yksilöillä oli pienempi B-solujen immuunijärjestelmän monimuotoisuus ennen elinsiirtoa verrattuna niihin, jotka hylkäsivät elimen. Seuraava askel olisi osoittaa B-soluvalikoiman monimuotoisuuden ennustearvo, tarjoten mahdollisia parempia biomarkkereita hylkimisen ennustamiseen ennen siirrännäistä ja mahdollisuus ottaa käyttöön kliinisessä hoidossa ja immunosuppressiovalinnoissa ennen ja jälkeen.munuainenelinsiirto. Jos tämä ominaisuus on seurausta jostain tekijästä, joka vaikuttaa monimuotoisuuden vähenemiseen stabiileissa yksilöissä, kuten ympäristötekijöistä tai geneettisistä tekijöistä, emme voisi vain ennustaa hylkäämistä, vaan myös estää sen. Todellakin, aivan viimeaikaiset löydöt osoittivat, että immuunijärjestelmän vaihtelu johtuu ympäristöllisistä ja geneettisistä tekijöistä37, 38. Emme löytäneet tutkimuksessamme mitään yhteyttä demografisiin tai muihin potilaan kliinisiin ominaisuuksiin (ikä, sukupuoli, rotu, immunosuppressio, elinten lähde, HLA-epäsopimattomuus ja ESRD). Tässä suhteessa tarvitsemme uuden analyysin vahvistaaksemme, vaikuttavatko tietyt tekijät B-soluvalikoiman monimuotoisuuteen ja siirtotuloksiin.

Toinen mielenkiintoinen havainto tutkimuksessamme osoittaa, että immuunijärjestelmä käyttäytyy eri tavalla ajan mittaan riippuen kliinisestä tulosryhmästä. Niillä, joilla esiintyy elimen hylkimisreaktiota transplantaation jälkeen, B-solujen monimuotoisuus on aluksi suurempi ja vähenee sitten ajan myötä, kun taas käänteinen monimuotoisuustrendi on havaittavissa potilailla, joille ei kehitty hyljintäreaktiota tai kroonista siirteen vauriota. Vaikka kaikki yksilöt saivat saman immunosuppressiokuorman elinsiirron jälkeen, jokin mahdollinen selitys hyljintäreaktion saaneiden potilaiden vähentyneelle monimuotoisuudelle voi liittyä siihen tosiasiaan, että nämä potilaat saavat tilapäisesti huomattavasti lisääntynyttä immunosuppressiotaakkaa hyljintäreaktion hoitoon ja sitten pidetään korkeammalla lähtötasolla. Vaikka tämä voisi selittää B-solujen monimuotoisuuden vähenemisen ajan myötä ja selittää eron 24 kuukautta siirron jälkeen, tämä ei todennäköisesti ole syynä, koska PR-ryhmän vähentynyt monimuotoisuus on

Kuva 6 IGHV-geenien käyttöanalyysin lämpökartta ja boxplot. Lämpökartta, joka näyttää nimellisesti merkitseviksi valitut IGHV-geenit (P-arvo < 0.05)="" hetkellä="" 0="" (a),="" 6="" (b)="" ja="" 24="" (c)="" np:lle="" vs.="" pr.="" punainen="" väriasteikko="" edustaa="" kunkin="" geenin="" ilmentymistä="" näytteissä.="" yläpuolella="" olevat="" juovat="" osoittavat="" kliinisen="" lopputuloksen="" ja="" esrd:n="" syyn.="" laatikkokuvaaja,="" joka="" näyttää="" ighv3-23-lausekkeen="" aikapisteiden="" välillä="" np:lle="" vs.="" pr:lle="" (aika="" 0:="" p-arvo="0.04," aika="" 6:="" p-arvo="0.003," aika="" 24:="" p="" -arvo="0.02)" (d).="" laatikon="" sisällä="" oleva="" juova="" edustaa="" mediaaniarvoa,="" laatikko="" määrittää="" kvartiilivälin="" (iqr)="" ja="" viikset="" määrittelevät="" ensimmäisen="" ja="" kolmannen="" kvartiilin="" ±="" 1,5="" ×="" iqr.="" p-arvot="" saadaan="" säätämällä="" lineaarista="" regressiomallia,="" jossa="" v-geenit="" pidetään="" riippuvaisena="" muuttujana="" ja="" kliininen="" tulos="" riippumattomana="" muuttujana.="" (n="12" näytettä).="" lähdetiedot="" toimitetaan="">

havaitaan myös 6 kuukautta siirron jälkeen, jolloin potilaille ei ole vielä kehittynyt hyljintäreaktio, mikä viittaa siihen, että muita aktiivisia prosesseja on todennäköisesti mukana. Selektiivisen kloonilaajenemisen havainnointi hallitsevammilla klooneilla vain potilailla, joille kehittyy sekä hylkimisreaktio että/tai etenevä krooninen sairausmunuainenTransplantaattivamma viittaa biologisesti merkitykselliseen, alloantigeeniin perustuvaan tiettyjen kloonien valintaan, pysyvyyteen ja laajenemiseen ajan myötä, mikä selittää ajallisen monimuotoisuuden yleisen vähenemisen. Vaikka voimme olettaa, että näiden kloonien laajeneminen liittyy todennäköisesti siirteen alloimmuunivaurioon, suora todiste siitä, että näiden kloonien laajeneminen on alloimmuunista, vaatii lisätutkimuksia in vitro ja eläinkokeissa.

Akuutti hyljintä on edelleen vahvin negatiivinen tekijä pitkän aikavälin siirteen eloonjäämiselle huolimatta immunosuppressiohoitojen nopeasta parantumisesta39,40. Tämä tutkimus löytää myös yhteyden joidenkin IGHV-geenien käyttöön hylkimisreaktioon, vaikka syy-yhteyttä tulisikin tutkia tulevissa tutkimuksissa. IGHV3-23 on mielenkiintoisin geeni gDNA-analyysissä, koska sitä käytetään huomattavasti enemmän potilailla, joille kehittyy hylkimisreaktio kaikilla mitatuilla aikapisteillä, ja se on yliedustettuna yksilöiden kesken jaetuissa pysyvissä klooneissa ja klooneissa, jotka on rikastettu hylkineet potilaat 24 kuukautta siirron jälkeen. Tämä geeni validoidaan myös 24 kuukautta siirron jälkeen sekä IgD- että IgM-isotyypeissä cDNA-analyysissä. IGHV3-23 on yhdistetty laajalti huonoon ennusteeseen kroonisessa lymfaattisessa leukemiassa41, ja on osoitettu, että suurin osa IGHV3-23-sekvensseistä säilytti kykynsä välittää superantigeenivuorovaikutuksia42. B-solujen superantigeenejä tuottavat virukset ja bakteerit, joiden tiedetään sitoutuvan immunoglobuliineihin tavanomaisten antigeenia sitovien kohtien ulkopuolella43. B-solujen kohtaamisen superantigeenin kanssa on osoitettu indusoivan proliferaatiota, aktivaatiota, migraatiota ja deleetiota44. Siirretyssämunuainen, on olemassa mahdollisuus jatkuvaan altistumiseen virukselle ja bakteeriantigeeneille, mikä liittyy joko primaarisen vesikoureterisen refluksin etiologiaan ESRD:n syynä tai sekundaariseen virtsarefluksiin siirteen virtsajohdin uudelleenistutuksen jälkeen tai virtsatieinfektion jälkeiseen refluksiin. mikä lisääntyy altistuessa krooniselle immunosuppressiolle transplantaation jälkeen. Mukautimme analyysituloksia munuaisten vajaatoiminnan syyn, muiden kliinisten ja demografisten tekijöiden ohella; aiemmin käsitellyt tulokset ovat edelleen merkittäviä, vaikka ymmärsimme, että NP:llä analyysissä väärin luokitellulla potilaalla (kuva 6) oli refluksitauti. Cheng et ai. ovat myös aiemmin havainneet, että B-soluilla infiltroituneiden munuaissiirteen saajien biopsiakudoksessa olevissa klooneissa oli hallitseva IGHV3-23-geeni muun muassa45. Grover et al.46 osoittivat, että tämän nimenomaisen geenin vasta-aineet eivät tunnistaneet luovuttajan HLA-antigeenejä, vaan olivat pikemminkin spesifisiä E. colille ja Modena ym.47 osoittivat, että virtsassa olevien bakteerien määrä oli paljon suurempi potilailla, joilla oli interstitiaalinen fibroosi ja tubulusatrofia kuin niillä, joiden siirteet toimivat hyvin. Laajennamme näitä havaintoja osoittaen, että IGHV3-23-geenin käyttö on huomattavasti yleisempää useilla hylkimispotilailla ääreisveressä ja että tietyt yleiset antigeenit voivat vaikuttaa hylkimisreaktioon. Tulevaisuudessa IGHV:n3-23 ilmentymistä voitaisiin mahdollisesti käyttää immuunivasteen seuraamiseen siirrettyä henkilöä kohtaan.munuainen.

Laajentamalla tutkimustamme cDNA-sekvensoinnilla, voimme toistaa suurimman osan tuloksistamme kahdessa isotyypissä (IgM ja IgD), jotka osoittavat pienempää monimuotoisuutta ennen siirtoa NP:ssä, jotka ovat kaksi merkittävintä pitkittäisanalyysissä, jossa on enemmän laajenemista ja hallitsevampia. kloonit verkkoanalyysissä ja myös replikoivat IGHV3-23-geeniä. Ensimmäiset humoraalisessa immuunivasteessa muodostuvat vasta-aineet ovat aina IgM ja ne etenevät nopeasti kaikkien eri isotyyppien, IgD:n, IgA:n, IgG:n ja IgE:n, tuotantoon, mutta erityinen kiinnostus vaatii IgD-isotyyppiä48. IgD ilmentyy yhdessä IgM:n kanssa ja erittynyttä IgD:tä on olemassa ja sillä on toimintaa veressä, limakalvon eritteissä ja synnynnäisten immuuniefektorisolujen, kuten basofiilien, pinnalla49. Basofiilit ovat valkosoluja, jotka taistelevat viruksia, bakteereja, loisia ja sieniä vastaan, ja ne ovat osallisia munuaissairauksissa ja siirteen hylkimisreaktiossa50. Siten toinen todiste, joka liittyy B-soluvasteisiin virusten ja bakteerien hylkimisprosessiin.

Tulevia tutkimuksia tarvitaan osoittamaan, että tämä aktivaatio johtuu eroista vastaanottajan mikrobiomissa, mikä vaikuttaa diagnostiikkaan ja terapiaan.

Tämän tutkimuksen avulla pystyimme tunnistamaan joidenkin näiden BCR-kloonien merkityksen, tunnistamaan kliinisesti merkitykselliset BCR-kloonit allograftin hyljintäreaktion kanssa ja osoittamaan, että näillä klooneilla, joilla on heterologinen immuniteetti, on todennäköistä merkitystä, kun otetaan huomioon näiden kloonien rikastuminen potilailla, joilla on kolonisoidut virtsatiet ennen siirtoa ja niiden biologinen merkitys patogeenivasteisiin. Parempi ymmärrys immuunijärjestelmän käyttäytymisestämunuainensiirrot eivät olisi olleet mahdollisia ilman BCRSeqin soveltamista yhdessä laskennallisten ja tilastollisten putkien vankan toteutuksen kanssa. Lähestymistapallamme on kuitenkin useita rajoituksia, jotka on tunnustettava: Ensinnäkin otoskokomme on erittäin valittu ja suhteellisen pieni joukossa lapsipotilaita, ja vaikka saavutimme tilastollisen merkityksen analyysissämme ja validoimme sen kahdessa eri tietolähteessä, lisäanalyysiä tarvitaan tulostemme vahvistamiseksi. Toiseksi tulokset eivät ole vapautettuja vaikutuksista, joita biologisella ja teknisellä näytteenotolla voi olla analyysiimme. Monimuotoisuusmittaukset riippuvat useista seikoista: siitä, että vain murto-osa repertuaarissa olevista miljardeista soluista on edustettuna näytteessä, erot sekvensointisyvyydessä ja mahdolliset kokeelliset virheet. Olemme valvoneet kaikkia näitä ongelmia laajasti, ensinnäkin laboratoriossa, suorittamalla saman määrän verta jokaisesta näytteestä samassa erässä ja toiseksi laskennallisesti ja tilastollisesti arvioimalla kokonaisrepertuaaria ja suorittamalla alennusnäytteitä sekvensointisyvyyden hallitsemiseksi. ja kokeelliset virheet. Kolmanneksi olemme suorittaneet BCRSeq:n käyttämällä kahta eri lähdettä, gDNA:ta ja cDNA:ta. gDNA:n sekvensointi helpottaa tietyn Ig-sekvenssin klonaalisuuden arviointia, koska sekvenssilukemien lukumäärä on verrannollinen gDNA-molekyylien lukumäärään. cDNA:n sekvensointi tarjoaa arvion valikoiman eri Ig-sekvenssien suhteellisesta ilmentymistasosta. On osoitettu, että T-solureseptoreille cDNA:lle suoritettu klonotyypin karakterisointi ei ole yhtä hyvä kuin gDNA:ssa, mikä osoittaa, että yksittäisten kloonien suhteellinen osuus erosi suuresti15 tai että HIV-spesifisten kloonien jäljitys onnistuu vain gDNA:lla, mutta ei mRNA51. Neljänneksi, immunosuppression vaikutus voi olla hämmentävä tekijä tämäntyyppisissä analyyseissä. Tässä tutkimuksessa kaikki näytteet ovat peräisin kliinisestä tutkimuksesta, jossa kaikki potilaat saivat saman immunosuppressiokuorman elinsiirron jälkeen. Siitä huolimatta kontrolloimme kahta steroidipohjaista ja steroiditonta tyyppiä varmistaaksemme, että tämä ei ollut ongelma, emmekä havainneet eroja tuloksissa. Lopuksi, tässä esittämämme kohortti on lastensiirtojen ryhmä. Suurin osa siirretyistä kliinisistä näkökohdista on samanlaisia ​​lapsilla ja aikuisilla. Immunosuppressio ja käytetyt hoito-ohjelmat ovat samankaltaisia, kreatiniini on tärkein seerumin biomarkkeri, akuutti hyljintä määritetään ensisijaisesti biopsialla Banff-kriteereitä käyttäen ja hylkimismekanismitmunuainensiirteet ovat yleensä samanlaisia52, joten suurin osa aikuisilla tai lapsilla tehdyistä tutkimuksista voi koskea molempia. Muut näkökohdat, kuten immunosuppression noudattamatta jättäminen / noudattamatta jättäminen, immunologiset näkökohdat, primaariset munuaissairaudet, jotka johtavat munuaisten vajaatoimintaan, joka usein liittyy urologisiin ongelmiin, ja ennen elinsiirtoa vaadittavat rokotukset voivat vaihdella, joten lisäanalyysit Aikuinen väestö on tarpeen näiden havaintojen yleistämiseksi.

Näistä rajoituksista huolimatta tietomme paljastavat, että yksilöillä, jotka hylkäävät elimen edelleen, havaitaan suurempaa monimuotoisuutta ennen siirtoa, mikä viittaa hylkimisalttiuteen, jolla voi olla tulevaisuuden vaikutuksia hyljintäriskin ennustamiseen ennen istutusta, immunosuppressiivisiin valintoihin ja kliiniseen hoitoon. käytännöt. 24 kuukauden seurannan jälkeen monimuotoisuuden yleinen väheneminen ajan myötä, johon liittyy tiettyjen kloonien pysyminen ja laajeneminen sekä useiden IGHV-geenien lisääntynyt käyttö hyljintäryhmässä, mikä saattaa vaikuttaa tiettyihin yhteisiin antigeeneihin hylkimisreaktioon. Erityistä kiinnostusta on havaittu IGHV3-23-geenin lisääntyneen käytön suhteen hyljintäpotilaiden keskuudessa, koska se on aiemmin liitettymunuainenelinsiirto, ja se voisi olla keskeinen osa hyljintäprosessia. Tämä työ esittelee pitkittäisanalyysin B-solujen immuunivalikoimasta elinsiirtoissa ja edistää enemmän tutkimuksia näiden havaintojen vahvistamiseksi, koska niillä voi olla kliinisiä vaikutuksia ennustamiseen, hallintaan, seurantaan ja hoitoon.munuainenhylkääminen.

menetelmät

Opintojen suunnittelu. Tutkimme 81 näytettä gDNA:lle ja 56 vastaavaa näytettä cDNA:lle pitkittäissuunnassa aikoina 0, 6 ja 24 kuukautta yhteensä 27 lapsipotilaalta, jotka saivat ensisijaisen hoidon.munuainenelinsiirto. Tämän tutkimuksen koehenkilöt ovat peräisin kliinisestä tutkimuksesta (SNSO1-monikeskustutkimus), jossa koehenkilöt satunnaistettiin (1:1) perinteiseen pieniannoksiseen steroideihin perustuvaan immunosuppressiohoitoon (steroidit, tavallinen daklitsumabin induktio toiseen kuukauteen transplantaation jälkeen, ja ylläpito-immunosuppressio takrolimuusilla (Prograf, Astellas Pharma) ja MMF:llä (CellCept, Hoffman-La Roche) tai steroidittomalla immunosuppressio-ohjelmalla (pitkittynyt daklitsumabin induktio kuudenteen elinsiirron jälkeiseen kuukauteen asti, takrolimuusi ja MMF). otettiin mukaan IRB-hyväksynnän jälkeen ja heillä oli tietoinen suostumus. Tässä tutkimuksessa 14 potilasta sai steroidien välttämisohjelman ja 13 steroidipohjaisen immunosuppressiivisen hoito-ohjelman53. Yksikään näistä potilaista ei saanut immunosuppressiota ennen elinsiirtoa, koska tämä oli yksi poissulkemiskriteeri. koostui kolmesta suonensisäisen kortikosteroidin (10 mg/kg) pulssista ja immunosuppression tehostamisesta.

Kaikille tutkimuksessa käytetyille näytteille oli yhdistetty allograftibiopsia, jonka keskuspatologi luki semikvantitatiivisilla histologisilla pisteillä. Kliininen akuutti hylkimisreaktio määriteltiin akuutiksi hyljintäjaksoksi, joka liittyy siirteen toimintahäiriöön ja joka perustui seerumin kreatiniinin yli 10 prosentin nousuun perusarvoista, ja se vahvistettiin biopsioiden keskeisellä patologisella lukemalla päivitetyn Banff-luokituksen23,24 mukaisesti. Krooninen allograft-vaurio määritettiin käyttämällä CADI-pistemäärää. Potilaat luokiteltiin kolmeen kliiniseen tulokseen, jotka määriteltiin CADI-pisteiden ja hyljintäjaksojen perusteella. Ei-progressiivisten (NP) CADI-pisteet olivat alhaiset kolmessa sarjabiopsiassa kahden vuoden aikana, ilman akuuttia hyljintäreaktiota. pisteet sarjabiopsioistaan ​​2 vuoden ajalta ja asteittain ilman hylkimistä, ja hylkimisreaktion saaneiden (PR) CADI-pisteiden lisääntyminen sarjabiopsioissaan 2 vuoden aikana hylkimisjaksojen kanssa. Nämä potilaat valittiin erittäin huolellisesti suuremmasta 120 potilaan kohortista, jotka vastaavat demografisia muuttujia ja kaikkia NP:tä ja PNR:ää, jotta niillä ei ollut näyttöä tulehduksesta biopsian tai subkliinisen vaurion perusteella mitattuna puuttuvilla luovuttajaspesifisillä vasta-aineilla. Yhdelläkään ei ollut HLA:ta tai haploidenttistä siirrettä, koska tämä oli ilmoittautumisen poissulkemiskriteeri54. Kaikki näytteet kerättiin 12:sta eri Yhdysvaltain lastensiirto-ohjelmasta vuosina 2004–2006 IRB-hyväksyttyjen protokollien mukaisesti. Tutkimuksen hyväksyivät myös Kalifornian yliopiston San Franciscon ja Stanfordin yliopiston Human Research Protection Program (HRPP) biopankkinäytteiden analysoinnin mahdollistamiseksi. Kaikki potilaat/huoltajat antoivat tietoisen suostumuksensa osallistua tutkimukseen Helsingin julistuksen mukaisesti. Raportoidut kliiniset ja tutkimustoimet ovat yhdenmukaisia ​​Istanbulin julistuksen periaatteiden kanssa, sellaisina kuin ne on esitetty Istanbulin julistuksessa elinkaupasta ja elinsiirtomatkailusta.

gDNA:n ja RNA:n eristäminen. Verinäytteet (4,5 ml) kerättiin 5 ml:n punaiseen putkeen ja inkuboitiin huoneenlämmössä 30 minuuttia, kunnes hyytymä muodostui. Sitten näytettä sentrifugoitiin 2000 x g:llä 5 minuuttia käyttämällä heiluvaa kauharoottoria. Sen jälkeen ylempi seerumikerros siirrettiin toiseen kryoputkeen ja hyytymää säilytettiin samassa putkessa -80 asteessa käyttöön asti. Kokoverihyytymien genominen DNA uutettiin käyttämällä Clotspin Basketsia ja Gentra PuregeneBlood Kit -sarjaa (Qiagen, Valencia, CA).

RNA:n uuttamiseenmunuainenneulabiopsia (Qiagen, Valencia, CA) ja säilytetty -80 asteessa; kokonais-RNA uutettiin käyttämällä master-seosta, jossa oli 790 ui TRIzolia ja 10 ui glykogeenia. Kudosnäytteet homogenisoitiin, inkuboitiin 15-25 asteessa 5 minuuttia ja 160 ui kloroformia lisättiin faasien erottamista varten. Seosta inkuboitiin jälleen 25 asteessa 2 minuuttia, minkä jälkeen sentrifugoitiin 4 asteessa ja käytettiin RNA:n uuttamiseen käyttämällä RNeasy Micro Kit -sarjaa (Qiagen-luettelonro 4004). RNA:n määrä ja eheys määritettiin Thermo Scientific NanoDrop ND-2000 UV-Vis -spektrofotometrillä ja vastaavasti Agilent Bioanalyzerilla.

B-solujen sekvensointi. Genomisen DNA:n temploituja PCR-reaktioita valmistettiin

100 ng gDNA-eristä kuuden itsenäisen viivakoodikirjaston luomiseksi näytettä kohti. Käytettiin multipleksoituja alukkeita IgH J- tai FR1- tai FR2-runkoalueille BIOMED-2-mallin mukaisesti55. Kymmenen nukleotidin "viivakoodisekvenssejä" alukkeissa käytettiin osoittamaan näytteen identiteetti ja replikaattikirjaston identiteetti jokaiselle PCR-reaktiolle. PCR suoritettiin AmpliTaq Gold (Roche) -polymeraasilla seuraavalla ohjelmalla: 94 astetta 5 min; 35 sykliä (94 astetta 30 sekuntia, 60 astetta 45 sekuntia, 72 astetta 90 sekuntia); ja lopullinen pidennys 72 asteessa 10 min. Toinen PCR-reaktio suoritettiin sen varmistamiseksi, että kirjastot eivät monistuneet kyllästymiseen ennen geelipuhdistusta ja sekvensointia. Kaiken kaikkiaan 0,4 ul kutakin ensimmäistä PCR-tuotetta temploitui toisen PCR-reaktion käyttämällä ulkoisia alukkeita, jotka olivat spesifisiä 454 linkkerisekvenssille; vahvistus suoritettiin ohjelmalla: 94 astetta 15 min, 12 sykliä (94 astetta 30 s, 60 astetta 45 s, 72 astetta 90 s) ja lopullinen pidennys 72 astetta 10 min. AmpliTaq Goldin virhesuhteella pitäisi olla minimaalinen vaikutus kloonisesti toisiinsa liittyvien sekvenssien tunnistamiseen tai sekvenssien somaattisten mutaatioiden arvioimiseen, kuten jossain muualla on käsitelty56. cDNA syntetisoitiin yhteensä 300 ng:sta RNA:ta satunnaisten heksameerien alukkeella. Templaatit monistettiin PCR:llä käyttämällä Biomed IGHV -alukkeita rungossa 1 (FR1) ja isotyyppispesifisiä alukkeita, jotka sijaitsevat vakioalueiden ensimmäisessä eksonissa. Nämä alukkeet18,57 koodasivat myös noin puolet Illumina-linkkerisekvensseistä, joita tarvitaan klusterin muodostamiseen ja sekvensointiin MiSeq-laitteella. Näytteen identiteettiä koodasivat kahdeksan nukleotidin multipleksitunnisteen viivakoodit kussakin alukkeessa. Illumina-klusterin tunnistamista varten neljä satunnaistettua nukleotidia koodattiin alukkeisiin välittömästi Illumina-linkkerisekvenssin jälkeen vakioalueen alukkeissa. Jokaisen näytteen jokainen vasta-aine-isotyyppi monistettiin erillisessä PCR-reaktiossa ristikkäisten isotyyppisten kimeeristen PCR-tuotteiden muodostumisen estämiseksi. PCR suoritettiin AmpliTaq Goldilla (Roche) valmistajan ohjeiden mukaisesti ja käytettiin ohjelmaa 94 astetta 7 min, 35 sykliä (94 astetta 30 s, 58 astetta 45 s, 72 astetta 120 s) ja lopullista. pidennys 72 asteessa 10 min. Toista PCR-vaihetta käytettiin lisäämään jäljellä oleva osa Illumina-linkkereistä amplikoneihin, ja se suoritettiin Qiagen Multiplex PCR -pakkauksella (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttämällä 0,4 mikrolitraa ensimmäistä PCR-tuotetta templaattina 30 mikrolitran reaktio. Toisen PCR-vaiheen PCR-ohjelma oli 94 astetta 15 minuuttia, 12 sykliä (94 astetta 30 sekuntia, 60 astetta 45 sekuntia, 72 astetta 90 sekuntia) ja lopullinen pidennys 72 asteessa 10 minuuttia. Kunkin PCR-reaktion tuotteet yhdistettiin arvioituina ekvimolaarisina määrinä, suoritettiin elektroforeesi agaroosigeeleillä ja geeli uutettiin QIAquick-pakkauksilla (Qiagen). Genomisen DNA:n temploitujen kirjastojen korkean suorituskyvyn sekvensointi suoritettiin 454 (Roche) -alustalla käyttäen Titanium-kemiaa. cDNA-kirjaston sekvensointi suoritettiin Illumina MiSeq -laitteella käyttämällä 600-syklisekvensointipakkauksia. Täydellinen luettelo MiSeqin (M154 ja M155) ja 454 Titanium (T7) kanssa käytetyistä alukkeista sisältyy lisätietoihin 1.

Sekvensointilukemat prosessoitiin seuraavasti: paripään lukemat yhdistettiin käyttämällä FLASH58:aa, jossa sekvenssit demultipleksoitiin ja leikattiin viivakoodeista ja IGHV-alukesekvensseistä. V-, D- ja J-alueet sekä V–D (N1), D–J (N2) -liitokset tunnistettiin käyttämällä kohdistusohjelmaa IgBLAST59. Sekvenssit suodatettiin poistamaan ei-IGH-artefaktit, sekvenssit, joissa oli V-geenin insertio tai deleetioita, kimeeriset sekvenssit ja ei-toiminnalliset sekvenssit. Otostasolla poistimme ne, joilla oli<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">

Monimuotoisuusanalyysi. Monimuotoisuutta mitataan lajirikkaudella ottaen huomioon kloonien lukumäärä näytettä kohti. Tämä mitta ei ota huomioon kunkin lajin esiintymistiheyttä, joten käytimme myös Shannonin entropiaa (H) monimuotoisuuden mittaamiseen.

tietoa lajien kokojakaumasta populaatiossa. H määritellään seuraavasti:

missä N on yksilöllisten kloonien lukumäärä ja pi on kloonin i taajuus. H vaihtelee välillä 0 (näyte, jossa on vain yksi klooni) ja Hmax ¼ log2N (näyte, jolla on tasainen kloonijakauma).

Sitten käytimme yleistä lineaarista mallia löytääksemme rikkauden ja entropian välisen yhteyden kliinisen tuloksen kanssa eri ajankohtina. Muokkasimme tätä mallia kaikilla taulukossa 1 olevilla kliinisillä muuttujilla varmistaaksemme, että jokin potilaan ominaisuuksista oli hämmentävä tekijä

Datan pitkittäiskomponentin mallintamiseksi käytimme lineaarista sekavaikutelmamallia, jossa otettiin huomioon ehdollinen kasvumalli, kuten on esitetty lisäkuvassa 10. Tämän mallin soveltamiseksi käytimme lme4-pakettia R:ssä ottaen huomioon kliinisen lopputuloksen ja ajan vuorovaikutuksen. löytää yhteys rikkauteen ja monimuotoisuuteen ajan ollessa satunnainen vaikutus.

Käsitelläksemme sitä tosiasiaa, että puuttuva lajiongelma (vain murto-osa miljardeista soluista repertuaarissa on edustettuna) sekä sekvensointi- ja kokeelliset virheet voivat vaikuttaa monimuotoisuusmittauksiin, suoritimme kaksi strategiaa täyden data-analyysin lisäksi. Ensin käytimme Recon-työkalua (arvioitujen kloonien rekonstruointi havainnoista)29 puuttuvien lajien ongelman ratkaisemiseksi. Recon on modifioitu suurimman todennäköisyyden menetelmä, joka tulostaa ohjelmiston yleisen monimuotoisuuden näytteen mittauksista. Recon tuottaa tarkkoja ja vankkoja arvioita monimuotoisuuden mittareista, mukaan lukien rikkaus ja entropia, mikä mahdollistaa yksilöiden välisen monimuotoisuuden luotettavan vertailun. Toiseksi, suoritimme alasnäytteenottostrategian ottamalla kullekin näytteelle satunnaisen lukujen osajoukon, joka vastaa pienintä sekvensointikokoa, mitä seurasi B-solukloonien uudelleenlaskeminen sekvensointisyvyyden mukauttamiseksi ja mahdollisten kokeellisten virheiden käsittelemiseksi. gDNA:ssa on näytteitä, joiden lukuarvot ovat erittäin alhaiset (< 1000),="" ja="" välttääksemme="" monien="" sekvenssien="" menettämisen="" ja="" tietojen="" todellisuuden="" poistimme="" yhteensä="" yhdeksän="" näytettä,="" jotka=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">

Verkkoanalyysi. Verkon generointialgoritmi on hyvin samanlainen kuin aiemmin määritelty31. Lyhyesti sanottuna jokainen kärki edustaa B-solusekvenssiä, jonka koon määrittävät kaikki identtiset sekvenssit. Reunat lasketaan käyttämällä kloonimääritelmää (samat V- ja J-segmentit, sama CDR3-pituus ja 90-prosenttinen nukleotidi-identtisyys CDR3:iden välillä) ja klusterit edustavat jokaista valikoiman kloonia. Analyysi tehtiin R:n kaaviopaketilla käyttämällä layout_with_graphopt-vaihtoehtoa kaavion luomiseen.

Verkon kvantifioimiseksi laskemme Gini-indeksin kärkipisteiden ja klusterin koon osalta. Gini-indeksi on epätasaisuuden mitta, jota käytetään laajasti varallisuuden jakautumisen mittaamiseen. Se mittaa taajuusjakauman arvojen välistä epätasa-arvoa. Käytimme Gini-funktiota yhdestä paketista R:ssä laskeaksemme Gini-kertoimen kärkikoon ja klusterin kokojakauman osalta. Gini-kerroin nolla ilmaisee täydellistä tasa-arvoa ja Gini-kerroin 1 ilmaisee maksimaalisen epätasa-arvon.

Klonaalinen analyysi. Kliinisiin tuloksiin liittyvien spesifisten kloonien tutkimiseksi rakensimme matriisin, jossa on kaikki kloonit, jotka ovat läsnä useammassa kuin yhdessä näytteessä (kokonaismäärä=118,223) kaikkien näytteiden mukaan kullakin aikapisteellä. Sitten tutkimme yhteyttä kunkin tietyn kloonin kliinisen tuloksen kanssa määrittämällä yhden muuttujan kloonia kohti läsnä/ei läsnä. Lopuksi käytimme Fisherin tarkkaa testiä ottaaksemme huomioon merkityksen 2 × 3 -taulukoissa jokaiselle kloonille kussakin aikapisteessä. Tutkimme myös niiden kloonien määrittämiä pysyvyysklooneja, jotka ovat useammassa kuin yhdessä aikapisteessä kussakin yksilössä. Tämän jälkeen kliinisen tuloksen erojen huomioon ottamiseksi käytimme lineaarista mallia, joka määrittelee riippuvaiseksi muuttujaksi kloonien lukumäärän (mittatakseen erojen pysyvyyttä) ja kunkin kloonin lukumäärän (mittatakseen kloonin laajenemista) ja kliinisen lopputuloksen. itsenäinen ennustaja.

IGHV-geenin käyttöanalyysi. IGHV-geenien tutkimiseksi arvioimme IGHV-geenin käytön näytettä kohti kunkin geenin käyttökertojen lukumääränä normalisoituna kloonien lukumäärällä tiettyjen IGHV-geenien yliedustelun välttämiseksi. Tilastollista analyysiä varten suodatimme pois ne geenit, joilla oli erittäin alhainen ilmentyminen (IGHV:n käyttö/kloonit < {{0}},05)="" vähintään="" 10="" prosentissa="" näytteistä.="" yhteensä="" analysoimme="" 27="" ighv-geeniä,="" jotka="" vastasivat="" 63="" näytettä.="" sitten="" käytimme="" lineaarista="" mallia="" löytääksemme="" ne="" geenit,="" jotka="" liittyivät="" kliiniseen="" lopputulokseen="" kussakin="" ajankohdassa,="" ja="" korjasimme="" nämä="" tulokset="" useilla="" testeillä="" käyttämällä="" benjaminin="" ja="" hochbergin="" fdr="">< 0,05.="" muokkasimme="" tätä="" mallia="" kaikilla="" taulukossa="" 1="" olevilla="" kliinisillä="" muuttujilla="" varmistaaksemme,="" että="" jokin="" potilaan="" ominaisuuksista="" oli="" hämmentävä="">

Raportoinnin yhteenveto. Lisätietoa tutkimussuunnittelusta löytyy tähän artikkeliin linkitetystä Nature Research Reporting Summarysta.

Viitteet

1.Cai,J.& Terasaki,PI Transplantaation jälkeinen vasta-aineseuranta ja HLA 1.(vasta-aineepitoopin tunnistus. Curr.Opin.Immunol. 20, 602-606(2008).

2. Sigdel, TKet ai. Ei-HLA-vasta-aineet immunogeenisille epitoopeille ennustavat kroonisen munuaissiirteen vaurion kehittymistä. J. Olen. Soc. Nephrol.23, 750-763 (2012).

3. Li, L. et ai. MICA-vasta-aineiden lokalisointi ja kliininen merkitys munuaisensiirron jälkeen. Transplantation 89,312-319(2010).

4. Lamb, KE, Lodhi, S. & Meier-Kriesche, H.-U. Pitkäaikainen munuaissiirteen selviytyminen Yhdysvalloissa: kriittinen uudelleenarviointi. Am.J. Elinsiirto. 11, 450-462(2011).

5. The Scientific Registry of Transplant Recipients.Saatavilla osoitteessa: https://rtr. transplant.hrsa.gov/annual_reports/2012/Default.aspx.(Käytetty: 24. toukokuuta 2018)Pineda, S. et al. Uudet ei-histoyhteensopivuuden antigeenin yhteensopimattomat variantit

6. Paranna kykyä ennustaa vasta-ainevälitteistä hyljintäriskiä munuaissiirroissa. Edessä. Immunol. 8 1687 (2017).

7. Valuiskikh, A.Baldwin, WM& Fairchild, RLViimeaikainen edistys ja uusia näkökulmia T-soluvasteiden tutkimisessa allografteihin. Am.J. Transplant.10, 117-1125 (2010).

8. Zarkhin, V, Chalasani, G. & Sarwal, MM. B-solujen yin ja yang siirteen hyljinnässä ja toleranssissa. Transplant. Rev.24, 67-78(2010).

9. Georgiou, G. et ai. Plus-vasta-ainevalikoiman korkean suorituskyvyn sekvensoinnin lupaus ja haaste. Nat. Biotechnol.32, 158-168(2014).

10. Schroeder, HW Samankaltaisuus ja eroavaisuudet hiiren ja ihmisen vasta-ainevalikoiman kehityksessä ja ilmentymisessä. Dev. Comp. Immunol. 30,119-135(2006).

11. Yaari, G. & Kleinstein, SH Käytännön ohjeita B-solureseptorirepertuaarin sekvensointianalyysiin. Genome Med.7,121(2015).

12. Shugay, M. et ai. VDJ-työkalut: T-solureseptorivalikoiman yhdistävä jälkianalyysi. PLOS Comput. Biol.11, e1004503 (2015).

13. Alachkar, H. et ai. Kvantitatiivinen karakterisointi T-soluvalikoimasta ja biomarkkereista munuaissiirteen hylkimisreaktiossa. BMC Nephrol.17,181(2016). 14. Morris, H. et ai. Luovuttajien reaktiivisten T-solujen seuranta: Todisteet klonaalisesta deleetiosta sietokykyisillä munuaisensiirtopotilailla. Sci. Käännös Med.7,272ral0 (2015).

15. Dziubianau, M. et ai. TCR-repertuaarianalyysi seuraavan sukupolven sekvensoinnilla mahdollistaa T-soluihin liittyvän patologian monimutkaisen erotusdiagnoosin. Olen. J.Transplant.13, 2842-2854 (2013).

16. Palanichamy, A. et ai. Immunoglobuliiniluokan B-solut muodostavat aktiivisen immuuniakselin keskushermoston ja periferian välillä multippeliskleroosissa. Sci. Käännös Med.6, 248ra106-248ra106(2014).

17. Strauli, NB& Hernandez, RDSTilastollinen johtopäätös konvergentin vasta-ainevalikoiman vasteesta influenssarokotteelle. Genome Med. 8,60(2016).

18. Roskin, KM et ai. IgH-sekvenssit yleisessä muuttuvassa immuunivajauksessa paljastavat muuttuneen B-solujen kehityksen ja valinnan. Sci. Käännös Med.7,302ra135 (2015).

19.Massart, A.,Ghisdal,L.,Abramowicz, M.&Abramowicz,D.Operational toleranssi munuaisensiirrossa ja siihen liittyvät biomarkkerit. Clin. Exp. Immunol.189, 138-157(2017).

20. Beausang, JFet al.B soluvalikoimat HLA-herkistetyissä munuaisensiirtoehdokkaissa, jotka käyvät läpi herkkyyshoitoa. J. Käännös Med. 15, 9 (2017).

21. Ferdman, J. et ai. B-solukloonien laajeneminen ja somaattinen hypermutaatio hylätyissä ihmisen munuaissiirreissä. Transplantation 98, 766-772(2014).

22. Vollmers, C. et ai. Farmakologisesti aiheutetun immunosuppression seuranta immuunijärjestelmän sekvensoinnilla akuutin allograftin hylkimisen havaitsemiseksi sydämensiirtopotilailla: A Proof-of-Concept Diagnostic Accuracy Study.PLOS Med. 12, e1001890 (2015).

23. Solez, K. et ai. Banff'05-kokousraportti: Kroonisen allograftivaurion erotusdiagnoosi ja kroonisen allograftin nefropatian (CAN) eliminointi. Olen. J. Transplant.7,518-526(2007). immunosuppressio munuaisensiirrossa: onko aika harkita sitä vakiohoitona? Kidney Int.76, 825-830(2009).

28. Legendre, C. et ai. Kolmen vuoden tulokset munuaisensiirtopotilailla, jotka on satunnaistettu saamaan steroidivapaata immunosuppressiota tai steroidien vieroitushoitoa enteropäällysteisellä mykofenolaattinatriumilla ja syklosporiinilla: ääretön tutkimus. J. Transplant.2014, 1-8(2014).

29. Kaplinsky, J. & Arnaout, R. Vahvat arviot yleisestä immuunijärjestelmän monimuotoisuudesta näytteiden korkean suorituskyvyn mittauksista. Nat. Commun.7, 11881 (2016).

30. Stern, JNHet ai. Multippeliskleroosin aivojen B-solut kypsyvät tyhjentävissä kohdunkaulan imusolmukkeissa. Sci. Käännös Med.6,248ra107 (2014).

31. Bashford-Rogers, RJMet ai. Verkoston ominaisuudet, jotka on johdettu ihmisen B-solureseptorivalikoiman syväsekvensoinnista, rajaavat B-solupopulaatioita. Genome Res.23,1874-1884 (2013).

32. Sarwal, Met ai. Molekyylien heterogeenisyys akuutissa munuaissiirteen hylkimisreaktiossa

tunnistettu DNA-mikrosiruprofiloinnilla. N.Engl.J. Med.349, 125-138(2003). 33.Zarkhin, V., Lovelace, PA, Li, L., Hsieh, S.-C. & Sarwal, MMPhenotypic Evaluation of b-cell subsets after rituksimabi akuutin munuaissiirteen hylkimisen hoitoon lapsilla. Transplantation 91,1010-1018 (201).

34. Clatworthy, MR& Targeting, B. Solut ja vasta-aineet transplantaatiossa. Amm. J. Transplant.11, 1359-1367 (2011).

35. Dijke, EIet ai. Bsolut transplantaatiossa. J. Heart Lung Transplant.35,704-710(2016).

36. Nankivell, BJ & Kuypers, DR. Kroonisen munuaissiirteen menetyksen diagnoosi ja ehkäisy. Lancet 378,1428-1437(2011).

37. Patin, E. et ai. Luonnollinen vaihtelu synnynnäisten immuunisolujen parametreissa on ensisijaisesti geneettisten tekijöiden ohjaama. Nat. Immunol.19, 302-314(2018). 38. Liston, A. & Goris, A. Ihmisen immuniteetin monimuotoisuuden alkuperä. Nat. Immunol. 19,209-210(2018).

39. Meier-Kriesche, H.-U, Schold, JD, Srinivas, TR& Kaplan, B. Munuaissiirteen eloonjäämisen puute parantumisesta huolimatta akuutin hylkimisasteen huomattavasta laskusta viimeisimmän aikakauden aikana. Am.J. Transplant.4, 378-383 (2004).

40. Keith, DS, Vranic, G. & Nishio-Lucar, A. Siirteen toiminta ja munuaistensiirtojen keskipitkän aikavälin tulokset paranivat viimeisen vuosikymmenen aikana: Yhdysvaltain munuaissiirtotietokannan analyysi. Elinsiirto. suora 3, el66 (2017).

41. Bomben, R. et ai. Mutatoituneiden IGHV3-23-geenien ilmentyminen kroonisessa lymfaattisessa leukemiassa tunnistaa sairauden alajoukon, jolla on erityisiä kliinisiä ja biologisia piirteitä. Clin. Cancer Res. 16,620-628(2010).

42. Levinson, AI, Kozlowski, L, Zheng, Y. & Wheatley, L. B-solujen superantigeenit: määritelmä ja mahdollinen vaikutus immuunivasteeseen. J. Clin. Immunol. 15, 26S-36S(1995.

43. Silverman, GJ & Goodyear, CSA-mallin B-solujen superantigeeni ja B-lymfosyyttien immunobiologia. Clin. Immunol.102, 117-134(2002).

44. Silverman, GJ & Goodyear, CS Hämmentävä B-solupuolustus: oppitunteja stafylokokin superantigeenista. Nat. Rev. Immunol.6, 465-475(2006). 45. Cheng, J. et ai. Ektooppiset B-soluklusterit, jotka tunkeutuvat siirrettyihin ihmisen munuaisiin, ovat klonaalisia. Proc. Natl Acad. Sci. 108, 5560-5565 (2011).

46. ​​Grover, RKet ai. Kostimulatorinen immunogeeni LPS indusoi B-solukloonit, jotka tunkeutuvat siirrettyihin ihmisen munuaisiin. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 6036-6041(2012).

47,Modena,BDet al. Muutokset virtsan mikrobiomipopulaatioissa korreloivat munuaissiirroissa interstitiaalisen fibroosin ja tubulaarisen atrofian kanssa, jotka on dokumentoitu varhaisessa seurantabiopsiassa. Olen. J. Transpl.17, 712-723 (2017).

48. Chen, K. & Cerutti, A. Uusia oivalluksia immunoglobuliini D:n arvoitukseen. Immunol. Rev. 237, 160-179 (2010).

49. Chen, K. et ai. Immunoglobuliini D tehostaa immuunivalvontaa aktivoimalla antimikrobisia, proinflammatorisia ja B-soluja stimuloivia ohjelmia basofiileissä. Nat. Immunol. 10, 889-898(2009).

50. Mack, M. & Rosenkranz, AR Basofiilit ja syöttösolut munuaisvauriossa. KidneyInt.76, 1142-1147 (2009).

51. Nixon, DFet ai. Ihmisen immuunikatoviruksen molekyyliseuranta

nef-spesifiset sytotoksiset T-solukloonit osoittavat kloonispesifisen T-solureseptori-DNA:n pysyvyyttä, mutta ei mRNA:ta varhaisen antiretroviraalisen yhdistelmähoidon jälkeen. Immunol. Lett.66, 219-228(1999).

52. Dharnidharka, VR, Fiorina, P. & Harmon, WEKindney transplantation in children.N.Engl. J. Med. 371, 549-558(2014).

53. Sarwal, MMet ai. Täydellinen steroidien välttäminen on tehokasta ja turvallista lapsilla, joilla on munuaisensiirto: Monikeskustutkimus, jossa on kolmen vuoden seuranta. Am.J.Transplant.12,2719-2729(2012).

24. Solez, K. et al.Banff 07 munuaissiirteen patologian luokittelu: päivitykset ja tulevaisuuden ohjeet. Am.J.Transplant.8, 753-760 (2008).

54. Li, L et ai. steroidivapaa immunosuppressio vuodesta 1999 lähtien: 129 lasten munuaisensiirtoa, joilla on jatkuvaa siirrännäistä ja potilasetua. Am.J. Transpl. 9, 1362-1372(2009).

25. Chaudhuri, A. et ai. Humoraalisen immuniteetin kliininen vaikutus lasten munuaisensiirrossa. J. Olen. Soc.Nephrol.24, 655-664 (2013).