Abstrakti:Vitis amurensis -juurilla on raportoitu olevan potentiaalia ihon valkaisuun arvioimalla melanogeneesiä ja tyrosinaasia estäviä vaikutuksia. Tässä tutkimuksessa V. amurensis -juuria käytettiin valkaisevien ainesosien nopeaan valintaan käyttämällä LC-Q-TOF-MS:ää yhdistettynä tyrosinaasia inhiboivaan määritykseen ja uuttoprosessin optimointiin käytettäväksi ihoa valkaisevana toiminnallisena materiaalina vastepinnan metodologialla. Tulokset osoittivat, että V. amurensis -juurilla oli tyrosinaasia inhiboivia vaikutuksia kahdella stilbeenioligomeerillä, e-viniferalla (1) ja B-vitamiinilla (2), kuten LC-Q-TOF-MS ennusti biomäärityksen kanssa. Optimaaliset uutto-olosuhteet (metanolipitoisuus 66 prosenttia, liuottimen tilavuus 140 ml ja uuttoaika 100 minuuttia) ihoa valkaiseville ainesosille määritettiin 6,20 prosentin saannoksi ja tyrosinaasia estävä aktiivisuus oli 87,27 prosenttia. Kunkin tekijän ja sitä vastaavan vasteen välinen suhde vahvistettiin Pearsonin korrelaatioanalyysillä. Liuottimen tilavuus osoitti selkeää lineaarista suhdetta saantoihin, ja metanolipitoisuudella oli vahva lineaarinen suhde tyrosinaasia inhiboivaan aktiivisuuteen yhdisteille 1 ja 2 sekä niiden yhdistelmälle. Kaiken kaikkiaan LC-Q-TOF-MS:llä yhdistettynä bioanalyysiin osoitettiin olevan potentiaalia löytää tehokkaasti uusia aktiivisia aineosia sekä tunnettuja aktiivisia aineosia; vitamiineja voidaan ehdottaa uudeksi luonnolliseksi potentiaaliseksi valkaisuaineeksi.

Asiaankuuluvien tutkimusten mukaancistancheon yleinen yrtti, joka tunnetaan nimellä "ihmeyrtti, joka pidentää elämää". Sen pääkomponentti oncistanosidi, jolla on erilaisia ​​vaikutuksia, kutenantioksidantti, tulehdusta ehkäisevä, jaimmuunijärjestelmän toiminnan edistäminen. Mekanismi cistanchen jaihon valkaisuunpiilee cistanchen antioksidanttisessa vaikutuksessaglykosidit. Ihmisen ihossa oleva melaniini muodostuu tyrosiinin hapettumisesta, jota katalysoityrosinaasi, ja hapetusreaktio vaatii hapen osallistumista, joten kehon happivapaista radikaaleista tulee tärkeä melaniinin tuotantoon vaikuttava tekijä. Cistanche sisältääcistanosidi, joka on antioksidantti ja voi vähentää vapaiden radikaalien muodostumista kehossa, mikä estää melaniinin tuotantoa.

Napsauta Cistanche Myydään lähellä minua

Lisätietoja:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Avainsanat:Vitis amurensis; LC-Q-TOF-MS yhdistettynä tyrosinaasia estävään määritykseen; vastauspinnan metodologia; Pearsonin korrelaatio

1. Esittely

Melaniini on vastuussa nisäkkäiden ihon ja hiusten väristä ja suojaa ihoa ultraviolettisäteiltä, ​​mutta liiallinen melaniinin tuotanto ja melaniinin kerääntyminen ihoon aiheuttavat hyperpigmentoituneita ihosairauksia, kuten pisamia, melasmaa, ikääntymistä, ephelidejä ja seniilejä lentigiiniä. Tyrosinaasilla, joka tunnetaan kuparia sisältävänä oksidaasientsyyminä, on ratkaiseva rooli melaniinin biosynteesissä. Entsyymi katalysoi kahta peräkkäistä hapetusreaktiota: ensimmäinen vaihe, L-tyrosiinin hydroksylaatio 3,4-dihydroksi-L-fenyylialaniiniksi (L-DOPA) ja toinen vaihe, L-DOPA:n hapetus. dopakinoni. Dopakinoni on erittäin reaktiivinen aine, joka voi polymeroitua spontaanisti muodostaen melaniinia [1–3]. Siten tyrosinaasi-inhibiittoreita voidaan käyttää hyperpigmentaatioon liittyvien ihosairauksien hoidossa ja ihon valkaisuaineina.

Vitis amurensis, luonnonvaraisesti kasvava rypälelaji, leviää pääasiassa Aasiassa (Koreassa, Kiinassa ja Japanissa). Täysin kypsiä hedelmiä syödään raakana ja ne sisältävät runsaasti ravintoaineita, kuten sakkaroosia, glukoosia, proteiineja ja vitamiineja, joten niitä käytetään viinin, mehun, hyytelöiden ja hillon materiaalina. Lisäksi sen lehtiä käytetään salaatissa [4]. Sen juuria ja varsia on käytetty perinteisenä lääkeaineena syövän, hermokipujen ja vatsakipujen hoitoon [5,6]. Sen juuret koostuvat stilbeeneistä (pääainesosa), prosyanidiineista, flflavonoideista, triterpenoideista ja muista fenoliyhdisteistä. Tähän asti juuren kemiallisia koostumuksia on tutkittu riittävän yksityiskohtaisesti. Erityisesti on raportoitu erilaisia ​​stilbeenioligomeerejä, mukaan lukien resveratroli, amurensiini A, A-vitamiini, (plus)-ε-vinifera, amurensiinit C-M, ampelopsiini A, D ja ampelopsiini E [6]. Juuren metanoliuutteella on anti-melanogeeninen vaikutus melanosyyttejä stimuloivan hormonin aiheuttamaa melanogeneesiä vastaan ​​B16F10-soluissa ja 3,4-dihydroksifenyylialaniinin (L-DOPA) hapettumista vastaan ​​sienen tyrosinaasin kautta [7]. Lisäksi V. amurensis -uutteilla ja niiden aktiivisilla yhdisteillä on antioksidanttisia, anti-inflammatorisia, hermostoa suojaavia ja kasvaimia estäviä vaikutuksia [7–10].

LC-MS yhdistettynä bioanalyysiin voi samanaikaisesti vahvistaa luonnontuotteiden komponenttien kemiallisen profiilin ja biologisen aktiivisuuden ilman uuttamista ja eristämistä. Siksi sitä on viime aikoina käytetty bioaktiivisten yhdisteiden tehokkaaseen ja nopeaan tunnistamiseen luonnontuotteista [11–13].

Optimointi on prosessi, joka mahdollistaa kokeellisten järjestelmien tai tuotteiden maksimaalisen tehokkuuden. Vastepinnan metodologia (RSM), monimuuttuja-analyysi, kokeiden suunnittelu empiirisiin malleihin perustuvilla matemaattisilla ja tilastollisilla tekniikoilla sekä kokeellisen suunnittelun ja tulosten välisen korrelaation ilmaiseminen polynomifunktiona ovat joitakin tekniikoita, jotka tarjoavat ihanteelliset optimointiolosuhteet maksimaalisella tehokkuudella. RSM on tarkka ja tehokas optimointimenetelmä, jota käytetään laajasti eri aloilla, kuten elintarvikejalostuksessa, kemiassa, biologiassa ja maataloudessa [14–16]. Viime vuosikymmeninä kiinnostus lääkkeitä, kosmetiikkaa ja luonnontuotteita sisältäviä terveysvaikutteisia elintarvikkeita kohtaan on lisääntynyt; Tämän seurauksena sekä tiedemaailmassa että teollisuudessa tehdään jatkuvaa tutkimusta tällaisten tuotteiden kehittämiseksi [17,18]. Ensimmäinen vaihe näissä tutkimuksissa on bioaktiivisen ainesosan uuttaminen luonnontuotteista. Tällä hetkellä, koska useat tekijät, kuten uuttoaika, lämpötila, neste-kiintoaine-suhde ja liuottimen tilavuus vaikuttivat uutettuihin ainesosiin, tarvitaan optimointi bioaktiivisten aineosien uuttamiseksi maksimiin.

Tietojemme mukaan tyrosinaasia inhiboivia aineosia ja V. amurensiksen juuriuutteiden optimointia on raportoitu harvoin [5,19]. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli siksi saada nopeasti tyrosinaasi-inhibiittori V. amurensis -juurista käyttämällä LC-Q-TOF-MS:ää yhdistettynä tyrosinaasia inhiboivaan määritykseen ja optimoida uutto-olosuhteet V. amurensis -juurten käytön laajentamiseksi ihon valkaisuaineena. RSM:n toimesta.

2. Tulokset ja keskustelu

2.1. LC-QTOF MS yhdistettynä tyrosinaasia inhiboivaan määritykseen käyttäen V. amurensis -juuriuutetta

V. amurensis -juuren 8 0-prosenttisella MeOH-uutteella oli merkittävää tyrosinaasia estävää aktiivisuutta (80,7 ± 0,8 prosenttia pitoisuudella 50 µg/ml, taulukko S1). Tyrosinaasia inhiboivien yhdisteiden tunnistamiseksi V. amurensis -juuressa ilman eristystä suoritettiin LC-QTOF-MS yhdistettynä tyrosinaasia inhiboivaan määritykseen. V. amurensis -juuriuutteen kemiallinen profiili saatiin ensimmäisessä ajossa (kuvio S1), ja bioaktiiviset yhdisteet tunnistettiin käyttämällä tyrosinaasia estävää määritystä fraktioista, jotka kerättiin 30 sekunnin välein toisesta ajosta (kuva 1). Massakromatogrammissa oli kaksi huippua välillä 19 ja 22 minuuttia, joilla ennustettiin olevan merkittävää tyrosinaasia estävää aktiivisuutta, ja niiden rakenteet tunnistettiin stilbeenidimeeriksi (1) ja stilbeenitetrameeriksi (2) käyttämällä kemiallista profilointia (taulukko 1).

2.2. V. amurensis -juuren tyrosinaasia inhiboivien aineosien tunnistaminen

Ensin kaksi ainesosaa, joilla odotettiin olevan tyrosinaasia estävää aktiivisuutta, eristettiin EtOAc-fraktiosta, ja niiden bioaktiivisuus arvioitiin. Eristettyjen yhdisteiden 1 ja 2 rakenteet tunnistettiin vastaavasti ε-vinifera (1) [20,21] ja B-vitamiini (-vinifera, 2) [21–23] käyttämällä 1H-NMR:ää, 13C-NMR:ää ja vastaavasti. ESI-MS (kuva 2, kuvat S2 ja S3 ja taulukko S2). Tyrosinaasia estävässä määrityksessä yhdisteiden 1, 2 ja kojiinihapon IC50-arvot olivat vastaavasti 3,51, 10,74 ja 27,09 uM. Molemmat yhdisteet osoittivat korkeampia tyrosinaasia estäviä vaikutuksia kuin positiivinen kontrolli, kojiinihappo, joka on tunnettu ihoa valkaiseva ainesosa (taulukko 1 ja kuva S4). Aiemmissa tutkimuksissa ε-viniferalla (1) on raportoitu olevan tyrosinaasia estävää aktiivisuutta [23]; B-vitamiini (2) tunnistettiin kuitenkin ensin tutkimuksessamme.

Kaiken kaikkiaan tulokset, jotka korreloivat ennustettujen LC-MS-tietojen kanssa yhdistettynä tyrosinaasia estävään määritykseen ja B-vitamiiniin (2), osoittavat potentiaalia uutena tyrosinaasin estäjänä. Lisäksi suoritettiin molekyylitelakointitutkimuksia tulosten tukemiseksi kahden stilbeenioligomeerin merkittävästä tyrosinaasia estävästä aktiivisuudesta. Kuten taulukosta 1 käy ilmi, yhdisteillä 1 ja 2 oli korkeampi telakointipistemäärä kuin positiivisella kontrollilla, kojiinihapolla, mikä on yhdenmukainen koetietojemme kanssa. Yhdisteiden telakointitulokset olivat kuitenkin ristiriidassa kokeellisten tulostemme kanssa. Yhdisteiden 1 ja 2 vuorovaikutustavat on kuvattu kuvassa 3. Yhdiste 1 muodosti 4 vetysidosta, 2 hydrofobista vuorovaikutusta ja 1 piloniparin vuorovaikutusta ja yhdiste 2 muodosti 11 vetysidosta, 7 hydrofobista vuorovaikutusta, 1 van der Waalsin vuorovaikutusta ja 3 pi-lone-parin vuorovaikutusta. Tuloksena vahvistettiin, että yhdisteet voidaan liittää kohdeproteiinin aktiiviseen kohtaan ja sitoutua katalyyttisiin aminohappotähteisiin, jotka voivat estää tyrosinaasiaktiivisuutta. Lisäksi ε-vinifera (1) on raportoitu kilpailevana estäjänä, joka sitoutuu samaan kohtaan, johon L-DOPA sitoutuu tyrosinaasiin [23]. Havaittiin, että B-vitamiini (2) sitoutuu samaan kohtaan kuin ε-vinifera (1), mikä vahvisti, että B-vitamiini (2) on uusi kilpaileva estäjä.

2.3. V. amurensis -juurenpoiston optimointi käyttämällä RSM:ää

V. amurensis -juurten hyödyntämiseksi ihoa valkaisevana toiminnallisena materiaalina Box-Behnken-suunnittelulla (BBD) suunniteltiin optimaaliset uutto-olosuhteet maksimoimaan uuttosaanto ja tyrosinaasia estävä aktiivisuus. Riippumattomien vasteiden, kuten uuttosaanto, tyrosinaasia estävä aktiivisuus, yhdisteen 1 määrä, yhdisteen 2 määrä ja yhdisteiden 1 ja 2 summan määrä, vaikutukset kolmeen riippumattomaan muuttujaan (uuttoaika, MeOH/vesipitoisuus ja liuottimen tilavuus), mitattiin (taulukko 2). Muuttujien alueeksi asetettiin uuttoaika (40, 70 ja 100 min), MeOH-pitoisuus (40, 70 ja 100 %) ja liuottimen tilavuus ( 35, 87,5 ja 140 ml) perustuen alustavaan yksitekijäkokeeseen (tietoja ei ole esitetty). Suunnitelluista kokeista saadut arvot ilmaistiin muuttujien välisten korrelaatioiden polynomeina regressioanalyysillä (taulukot S4–S13 ja kuva S5). Jokaiselle reaktiolle suoritetun yksilöllisen optimoinnin tuloksena (taulukko 3) saannon odotettiin edustavan 6,21 prosenttia, kun se uutettiin 100.00 min, MeOH 64,78 prosenttia, 140.{{42} } ml. Tyrosinaasia estävä aktiivisuus (prosenttia) uutettiin 65,22 min, MeOH 100.00 prosenttia, 140.00 ml olosuhteissa, ja sen ennustettiin osoittavan arvon 90,37 prosenttia. Yhdisteen 1 määrä 65,74 minuutissa, MeOH 100.00 prosenttia, 35,00 ml ennustettiin 37,45 µg/mg ja yhdisteen 2 määrä 70,00 minuutissa, MeOH 70,00 prosenttia ja 92,24 ml:n ennustettiin olevan 86,77 µg/mg. Lisäksi yhdisteiden 1 ja 2 kokonaispitoisuuksien odotettiin osoittavan maksimiarvoa 108,10 ug/mg, kun ne uutettiin olosuhteissa 75,20 min, MeOH 100,00 % ja 35,00 ml. Optimoituihin olosuhteisiin perustuvat kokeet tuottivat 6,19 ± 0,36 prosenttia, tyrosinaasia estävä aktiivisuus 91,72 ± 3,48 prosenttia, yhdisteen 1 pitoisuus 36,54 ± 1,78 µg/mg, yhdisteen 2 pitoisuus 85,74 ± 16,57 µg/m ja {8 µg/m. },10 ± 19,11 µg/mg saatiin, ja yksittäiset vasteet kullekin muuttujalle osoittivat 5 prosentin tai vähemmän eroa teoreettisesti ennustetuista arvoista. Usein vasteen optimointi suoritettiin uuttamissaannon ja tyrosinaasia estävän aktiivisuuden maksimoimiseksi (taulukko 3). Optimoidut olosuhteet olivat seuraavat: uuttoaika, 100 min; MeOH-pitoisuus, 66,38 prosenttia; ja liuottimen tilavuus 140 ml. Näitä olosuhteita käyttämällä määritettiin saannon olevan 5,95 ± 1,13 prosenttia ja tyrosinaasia estäväksi aktiivisuudeksi oli 85,93 ± 1,57 prosenttia; nämä arvot olivat samanlaiset kuin ennustetut arvot, 6,20 ja 87,25 prosenttia. Lisäksi kunkin muuttujan ja vastaavan vasteen välinen korrelaatio analysoitiin Pearsonin korrelaatiolla (taulukko 4). Uuttosaanto osoitti selkeän lineaarisen suhteen uuttoajan ja MeOH-pitoisuuden välillä ja negatiivisen lineaarisen suhteen yhdisteen 1 määrään. Lisäksi tyrosinaasia estävä aktiivisuus osoitti vahvan lineaarisen suhteen yhdisteen 2 määrän ja summan välillä. Siksi V. amurensis -juuren tyrosinaasia estävä aktiivisuus oli verrannollinen sekä yhdisteisiin 1 että 2, mutta sillä oli vahvempi lineaarinen suhde yhdisteen 2 määrään kuin yhdisteellä 1.

3. Materiaalit ja menetelmät

3.1. Yleiset kokeelliset menettelyt

Keskipainenestekromatografia (MPLC) suoritettiin käyttämällä Biotage Isoleraa (Biotage AB, Uppsala, Ruotsi). Yksi järjestelmä on varustettu korkean suorituskyvyn flash-kromatografiapumpulla (HPFC), säädettävällä kaksiaallonpituisella detektorilla ja keräimellä. NMR-spektrit hankittiin käyttämällä Bruker SPECTROSPIN 300 MHz -spektrometriä (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA). Metanoli-d4, NMR-liuotin, ostettiin yhtiöltä Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Asetonitriili (ACN), vesi ja metanoli (MeOH) kromatografista laatua ostettiin yhtiöltä ThermoFisher Scientific Korea Ltd. (Soul, Korean tasavalta). L-tyrosiini, sienityrosinaasi, kojiinihappo ja muurahaishappo ostettiin Sigma-Aldrich Co:lta (St. Louis, MO, USA).

3.2. Kasvimateriaali

V. amurensis -juuri hankittiin Gyeongbukista, Koreasta, ja ostettiin myös Omniherbiltä (Daegu, Korean tasavalta). Ne tunnisti tri Prof. Ki Yong Lee Korean yliopiston Pharmacy Collegesta. Tositenäyte (KUP-HD071) talletettiin Laboratory of Pharmacognosy, College of Pharmacy, Korea University.

3.3. LC-Q-TOF-massaspektrometria

LC suoritettiin käyttämällä Agilent 1260 -sarjaa (Agilent, Santa Clara, CA, USA), joka sisälsi binaaripumpun, online-kaasunpoistolaitteen, automaattisen näytteenottolaitteen, termostaattisesti ohjatun kolonniosaston ja valodiodirividetektorin. Kromatografinen erotus suoritettiin käyttämällä Shiseido CapCell PAK C18 -kolonnia (5 um, 4,6 mm, ID × 15 0 nm). Liikkuva faasi koostui vedestä (liuotin A) ja ACN:stä (liuotin B), jotka molemmat sisälsivät 0,1 % muurahaishappoa. Gradienttiolosuhteet olivat seuraavat: 0–5 min, 10 prosenttia B, 5–30 min ja lineaarinen nousu B 10 prosentista 90 prosenttiin . Vastaava nopeus asetettiin arvoon 0,6 ml/min; 5 ui ja 20 ui näytteitä injektoitiin vastaavasti LC-Q-TOF-MS-analyysiä ja LC-Q-TOF-MS-analyysiä varten yhdistettynä tyrosinaasia estävään määritykseen, vastaavasti. Massaspektrometria suoritettiin käyttämällä Agilent 6530 Q-TOF -massaspektrometriä (Agilent, Santa Clara, CA, USA) sähkösumutusionisaatiorajapinnalla (ESI) negatiivisessa tilassa. Tiedot massa-alueelta m/z 50–1000 kerättiin sentroiditilassa. Massaparametrit olivat seuraavat: kapillaarijännite, 4000 V; sumuttimen paine, 40 psi; fragmenttijännite, 175 V; skimmerin jännite, 65 V; kuivauskaasun lämpötila, 325 ◦C; kuivauskaasun lisänopeus, 12,0 l/min; törmäysenergia 10, 20, 30 ja 40 eV. Hankintaparametrien säätö ja tietojen käsittely suoritettiin käyttämällä LC-MS/MS Data Acquisition -ohjelmistoa käyttämällä 6530-sarjan Q-TOF:ää (versio B.05.00) (MassHunter Workstation -ohjelmisto, Agilent, Santa Clara, CA, USA).

3.4. LC-Q-TOF-MS kytkettynä tyrosinaasia inhiboivaan määritykseen

LC-Q-TOF-MS yhdistettynä tyrosinaasia estävään määritykseen suoritettiin käyttämällä edellisessä tutkimuksessa vahvistettua menetelmää [24]. Lyhyesti sanottuna määritys eteni kahdessa ajossa. Ensimmäisessä ajossa näytteen kemiallinen profiili saatiin käyttämällä LC-Q-TOF-MS:ää. Seuraavassa ajossa eluaatti, joka oli kulkenut LC-järjestelmän läpi ilmoitetuissa LC-Q-TOF-olosuhteissa, kerättiin 96-kuoppalevyille 30 sekunnin välein. Kerättyjen fraktioiden tyrosinaasia estävä aktiivisuus arvioitiin käyttämällä tyrosinaasia inhiboivaa määritystä.

3.5. Tyrosinaasia inhiboivien yhdisteiden eristäminen V. amurensis -juuresta

Tyrosinaasia inhiboivien yhdisteiden eristämiseksi, jotka tunnistettiin käyttämällä LC-Q-TOF-MS:ää yhdistettynä tyrosinaasia estävään määritykseen, V. amurensis -juurta (301 kg) uutettiin kolme kertaa 80 prosentilla. MeOH 60 min huoneenlämmössä ultraäänellä. Uutettu liuotin suodatettiin ja väkevöitiin, jolloin saatiin raakauute (215,7 g), joka suspendoitiin veteen ja jaettiin peräkkäin käyttäen n-heksaania, etyyliasetaattia (EtOAc) ja n-BuOH:ta. EtOAc-fraktiolle (25,85 g) suoritettiin silikageelipylväskromatografia käyttäen n-heksaani:EtOAc-seosta gradienttiolosuhteissa (20:1 -> 0:1), jolloin saatiin seitsemän fraktiota (E1-E7). Fraktio E4 erotettiin käyttämällä MPLC:tä ja 100 g SNAP KP-Siliä, silikageelipatruunaa ja dikloorimetaani:MeOH-seosta gradienttiolosuhteissa (97:3 → 0:100), jolloin saatiin seitsemän alafraktiota (E4-1 - E4-7). . Yhdiste 2 (417,0 mg) saatiin E4-5:stä. Alafraktio E4-4 kromatografoitiin uudelleen MPLC:llä käyttäen SNAP 25 g Ultraa, silikageelipatruunaa ja kloroformi:MeOH:H2O-seosta gradienttiolosuhteissa (50:4:1 → 15:4:1), jolloin saatiin seitsemän fraktiota ( E4–4–1 – E4–4–7). Yhdiste 1 (396,0 mg) saatiin E4-4-5:stä, joka havaittiin yhtenä täplänä ohutkerroskromatografialevyllä (TLC).

3.6. Tyrosinaasia estävä määritys

Tyrosinaasia inhiboiva aktiivisuus arvioitiin käyttämällä aiemmin kuvattua menetelmää vähäisellä modifikaatiolla [25]. Kaksi mikrolitraa näytettä ja 50 µl 0,1 U/µL sienityrosinaasia käsiteltiin 96-kuoppalevyillä ja inkuboitiin 37 ◦C:ssa. 15 minuutin kuluttua lisättiin 50 µl 1 mM L-tyrosiinia ja annettiin sitten reagoida 37 ◦C:ssa 15 minuuttia. Muodostuneen dopakromin määrä mitattiin 495 nm:ssä käyttämällä Spectra Max 19{{20}} -mikrolevylukijaa (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). Tyrosinaasia estävä aktiivisuus laskettiin käyttämällä seuraavaa yhtälöä: tyrosinaasin esto (prosenttia )=[1 − (S − S0)/(C − C0)] × 100, missä S on näytteen, tyrosinaasin ja L:n absorbanssi -tyrosiini; S0 on näytteen ja L-tyrosiinin absorbanssi; C on tyrosinaasin ja L-tyrosiinin absorbanssi ja C0 on L-tyrosiinin absorbanssi. Positiivisena kontrollina käytettiin Kojic-happoa, tunnettua tyrosinaasin estäjää. IC50-arvot laskettiin käyttämällä GraphPad Prism 6:ta (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).

3.7. Molecular Docking Studies

Molekyylitelakointi suoritettiin käyttämällä SYBYL-X 2.1.1 -ohjelmistoa (Tripos Ltd., St. Louis, MO, USA) PPO3:n kiderakenteilla, tyrosinaasilla Agaricus bisporuksesta (Protein Data Bank (PDB) ID: 2Y9W). Kaikki kohdeproteiinin vesimolekyylit poistettiin, ja ligandin valmistus suoritettiin "sanitize"-valmistusprotokollalla SYBYL-X 2.1.1:ssä. Proteiini-ligandi-affiniteetti laskettiin Tripos-voimakentällä ja ilmaistiin kokonaispisteinä. Proteiini-ligandi-kompleksin ligandin telakoitu asento visualisoitiin Discovery Studio 2017 R2 Client -ohjelmassa (Biovia Co., San Diego, CA, USA).

3.8. Kokeellinen suunnittelu ja tilastollinen analyysi

Optimoidut olosuhteet ainesosien uuttamiseksi, joilla on suurin tyrosinaasia estävä vaikutus V. amurensis -juuresta, luotiin käyttämällä BBD:tä kolmella muuttujalla ja kolmella tasolla (MINITAB Release 14.12.{2}} Statistical Software). Alustavien yksitekijäkoetulosten perusteella valittiin riippumattomat muuttujat, mukaan lukien uuttoaika (X1), MeOH- ja vesipitoisuus (X2) ja nestetilavuus (X3) sekä niiden muuttujien alue (taulukko S3). RSM:n muuttujat koodattiin käyttämällä kolmea tasoa, −1, 0 ja 1. Kaiken kaikkiaan suunniteltiin 15 koetta, mukaan lukien 3 toistoa suunnittelun keskellä (taulukko 2). Riippumattomina vasteina mitattiin saanto (%), tyrosinaasia estävä aktiivisuus (%), yhdisteen (1) määrä (ug/mg) ja yhdisteen (2) määrä (ug/mg). Uutteen tyrosinaasia estävä aktiivisuus arvioitiin pitoisuudella 50 ug/ml. Jokainen vastaus ilmaistaan ​​käyttämällä seuraavaa toisen asteen polynomiyhtälöä:

jossa R on vastaus; 1, 2 ja 3 ovat lineaarisia kertoimia; 12, 23 ja 13 ovat kolmen muuttujan välisiä vuorovaikutuskertoimia; ja 11, 22 ja 33 ovat toisen asteen kertoimet.
Lisäksi Pearsonin korrelaatioanalyysi suoritettiin lineaarisen suhteen olemassaolon määrittämiseksi kunkin muuttujan ja vasteen välillä. Pearsonin korrelaatiokertoimella on vahva lineaarinen suhde {{0}}.7 ja 1.0 välillä, selkeä lineaarinen suhde 0.3 ja 0.7 välillä, heikko lineaarinen suhde välillä {{10}.1 ja 0.3, ja ei lainkaan tai merkityksetön lineaarinen suhde välillä 0.0 ja 0.1. Positiivinen ja negatiivinen korrelaatio ilmaistaan ​​sen mukaan, onko Pearsonin korrelaatiokerroin positiivinen vai negatiivinen.

3.9. Tyrosinaasia inhiboivien yhdisteiden 1 ja 2 kvantitatiivinen analyysi

Kunkin yhdisteen 1 ja 2 määrä uutteissa, jotka saatiin käyttämällä suunniteltuja 15 koeolosuhteita, mitattiin käyttämällä kalibrointikäyriä (taulukko 2). Kalibrointikäyrät yhdisteille 1 ja 2 määritettiin käyttämällä UV-kromatogrammikäyrän alla olevaa pinta-alaa (33{7}} nm saatu pitoisuuksilla 0,1–1000 µg/ml ja 7,81–1000 µg/ml). LC suoritettiin käyttämällä Waters 2695 LC -järjestelmää (Waters, Santa Clara, CA, USA) samoissa olosuhteissa kuin LC-järjestelmässä, jotka on kuvattu yksityiskohtaisesti kohdassa Materials and Methods, LC-Q-TOF massaspektrometria.

4. Johtopäätökset

V. amurensis -juurten e-viniferiini (1) ja B-vitamiini (2) karakterisoitiin ihoa valkaisevina ainesosina käyttämällä LC-Q-TOF-MS:ää yhdistettynä tyrosinaasia estävään määritykseen. Erityisesti B-vitamiini (2) tunnistettiin ensin tyrosinaasia estäväksi yhdisteeksi tässä tutkimuksessa, ja e-vinifera (1) ja B-vitamiini (2) osoittivat korkeampia tyrosinaasia estäviä vaikutuksia kuin positiivinen kontrolli, kojiinihappo. Optimointiolosuhteet maksimaalisella tyrosinaasia estävällä vaikutuksella ja V. amurensiksen juurien saannolla määritettiin käyttämällä uuttoaikaa (100 min), MeOH-pitoisuutta (66,38 prosenttia) ja nestetilavuutta (140 ml). Tulos osoitti hyvää vastaavuutta kokeellisten ja ennustettujen arvojen välillä. Näin ollen LC-Q-TOF-MS yhdistettynä bioanalyysiin on osoittanut potentiaalin löytää tehokkaasti uusia aktiivisia aineosia sekä tunnettuja aktiivisia aineosia, B-vitamiinia (2), jota voidaan ehdottaa uudeksi luonnolliseksi potentiaaliseksi valkaisuaineeksi.

Täydentävät materiaalit: Seuraavat ovat saatavilla verkossa, kuva S1: MS-kromatogrammi negatiivisessa ionisaatiotilassa (A); V. amurensiksen juuriuutteiden UV-kromatogrammi 280 nm:ssä (B), kuva S2: yhdisteen 1 1H- ja 13C-NMR-spektrit (300 ja 75 MHz, CD3OD), kuva S3: yhdisteen 1H- ja 13C-NMR-spektrit 2 (300 ja 75 MHz, CD3OD), kuva S4: Sigmoidinen käyrä ja positiivisen kontrollin IC50, yhdisteet 1 ja 2, kuva S5: Vastepinta- ja ääriviivakäyrät, jotka osoittavat uuttoparametrien vaikutuksen (X1: uuttoaika, min; X2: MeOH-pitoisuus, prosenttia; X3: liuottimen tilavuus, ml). (A) saanto; (B) tyrosinaasia estävä aktiivisuus; (C) yhdiste 1; (D) yhdiste 2; (E) yhdisteiden 1 ja 2 summa, taulukko S1. V. amurensiksen juuriuutteiden tyrosinaasia estävä aktiivisuus, Taulukko S2: Yhdisteiden 1 ja 2 1H- ja 13C NMR-tiedot CD3OD:ssa (δ ppm), Taulukko S3: Riippumattomat muuttujat ja tasot vasteen pintametodologialle, Taulukko S4: Arvioitu regressio Saantokerroin, Taulukko S5: Sadon varianssianalyysi, Taulukko S6: Arvioitu regressiokerroin tyrosinaasia estävälle aktiivisuudelle, Taulukko S7: Tyrosinaasia estävän aktiivisuuden varianssianalyysi, Taulukko S8: Arvioitu regressiokerroin yhdisteelle 1, Taulukko S9: Analyysi varianssi yhdisteelle 1, Taulukko S10: Arvioitu regressiokerroin yhdisteelle 2, Taulukko S11. Varianssianalyysi yhdisteelle 2, Taulukko S12: Arvioitu regressiokerroin yhdisteiden 1 ja 2 summalle, Taulukko S13: Varianssianalyysi yhdisteiden 1 ja 2 summalle.
Tekijän panokset: käsitteellistäminen, KYL; metodologia, K.-EO, HS ja KYL; ohjelmistot, K.-EO ja HS; validointi, HS; muodollinen analyysi, K.-EO ja HS; tutkimus, K.-EO, HS, MKL ja KYL; tietojen kuratointi, K.-EO, HS, BP ja KYL; kirjoitus – alkuperäinen luonnosvalmistelu, K.-EO ja HS; kirjoittaminen – arvostelu ja editointi, HS, MKL, BP ja KYL; valvonta, MKL, BP ja KYL Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet käsikirjoituksen julkaistun version ja hyväksyneet sen.
Rahoitus: Tätä tutkimusta tuki Korean kansallisen tutkimussäätiön apuraha, jota rahoitti Korean hallitus (NRF-2017R1A2B4003403 ja NRF-2019R1A6A1A03031807) sekä Korean terveysteknologian tutkimus- ja kehitysprojektin apuraha Korean terveysalan kehityksen kautta. Institute (KHIDI), rahoittaja Korean tasavallan terveys- ja hyvinvointiministeriö (HF20C0038).
Tietojen saatavuusilmoitus: Tässä tutkimuksessa esitetyt tiedot ovat saatavilla lisäaineistossa.
Eturistiriidat:Kirjoittajat ilmoittavat, että ne eivät ole eturistiriitoja.
Näytteen saatavuus: Ei saatavilla

Viitteet

1. Ranjbar, S.; Shahvaran, PS; Edraki, N.; Khoshneviszadeh, M.; Darroudi, M.; Sarrafifi, Y.; Hamzehloueian, M.; Khoshneviszadeh, M. 1, 2, 3-triatsoliin kytketyt 5-bentsylideeni(tio)barbituraatit uusina tyrosinaasin estäjinä ja vapaiden radikaalien sieppaajina. Kaari. Pharm. 2020, 353, 2000058. [CrossRef] [PubMed]

2. Chang, T.-S.; Ding, H.-Y.; Lin, H.-C. 6, 7, 40 -trihydroksi-isoflavonin tunnistaminen tehokkaaksi tyrosinaasin estäjäksi. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005, 69, 1999–2001. [CrossRef] [PubMed]

3. Miyazawa, M.; Oshima, T.; Koshio, K.; Itsuzaki, Y.; Anzai, J. Tyrosinaasin estäjä mustasta riisileseestä. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 6953–6956. [CrossRef]

4. Chen, Q.; Diao, L.; Song, H.; Zhu, X. Vitis amurensis Rupr: Katsaus kemiaan ja farmakologiaan. Phytomedicine 2018, 49, 111–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Jin, K.-S.; Voi YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Vitis amurensis -juuresta eristetty betuliinihappo estää 3-isobutyyli-1--metyyliksantiinin aiheuttamaa melanogeneesiä säätelemällä MEK/ERK- ja PI3K/Akt-reittejä B16F10-soluissa. Food Chem. Toxicol. 2014, 68, 38–43. [CrossRef]

6. Kim, H.; Thuong, PT; Ngoc, TM; Lee, I.; Hung, ND; Bae, K. Vitis amurensiksen lehdistä ja varresta peräisin olevien oligostilbeenien antioksidantti- ja lipoksigenaasia estävä aktiivisuus. J. Ethnopharmacol. 2009, 125, 304–309. [CrossRef]

7. Jin, K.-S.; Voi YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Vitis amurensis Ruprecht-juuri esti melanosyyttejä stimuloivan hormonin aiheuttamaa melanogeneesiä B16F10-soluissa. Nutr. Res. Harjoittele. 2014, 8, 509–515. [CrossRef]

8. Jang, MH; Piao, XL; Kim, HY; Cho, EJ; Baek, SH; Kwon, SW; Park, JH Vitis amurensis -bakteerin resveratrolioligomeerit heikentävät amyloidin aiheuttamaa oksidatiivista stressiä PC12-soluissa. Biol. Pharm. Sonni. 2007, 30, 1130–1134. [CrossRef]

9. Lee, E.-O.; Lee, H.-J.; Hwang, H.-S.; Ahn, K.-S.; Chae, C.; Kang, K.-S.; Lu, J.; Kim, S.-H. Voimakas Lewisin keuhkosyövän kasvun esto Vitis amurensiksen juurista peräisin olevalla heksanoli A:lla apoptoottisten ja antiangiogeenisten toimintojen kautta. Karsinogeeni 2006, 27, 2059–2069. [CrossRef]

10. Bak, M.-J.; Truong, VL; Kang, H.-S.; Jun, M.; Jeong, W.-S. Villirypäleen (Vitis amurensis) siemenistä peräisin olevien prosyanidiinien tulehdusta ehkäisevä vaikutus LPS-indusoiduissa RAW 264.7 -soluissa. Oksid. Med. Cell. Longev. 2013, 2013. [CrossRef]

11. Shin, H.; Chung, H.; Park, B.; Lee, KY Antioksidatiivisten aineosien tunnistaminen Polygonum avicularesta käyttämällä LC-MS:ää yhdistettynä DPPH-määritykseen. Nat. Tuot. Sci. 2016, 22, 64–69. [CrossRef]

12. Park, S.; Shin, H.; Park, Y.; Choi, I.; Park, B.; Lee, KY Catalpa ovatan NO-tuotantoa inhiboivien aineosien karakterisointi käyttämällä LC-MS:ää yhdistettynä solupohjaiseen määritykseen. Bioorg. Chem. 2018, 80, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

13. Ingkaninan, K.; De Best, C.; Van Der Heijden, R.; Hofte, A.; Karabatak, B.; Irth, H.; Tjaden, U.; Van der Greef, J.; Verpoorte, R. Korkean suorituskyvyn nestekromatografia on-line-kytketyllä UV-, massaspektrometrisellä ja biokemiallisella detektiolla asetyylikoliiniesteraasi-inhibiittoreiden tunnistamiseen luonnontuotteista. J. Chromatogr. 2000, 872, 61–73. [CrossRef]

14. Bezerra, MA; Santelli, RE; Oliveira, EP; Villar, LS; Escaleira, LA Response pintametodologia (RSM) analyyttisen kemian optimoinnin työkaluna. Talanta 2008, 76, 965–977. [CrossRef] [PubMed]

15. Witek-Krowiak, A.; Chojnacka, K.; Podstawczyk, D.; Dawiec, A.; Pokomeda, K. Vastepinnan metodologian ja keinotekoisten hermoverkkomenetelmien soveltaminen biosorptioprosessin mallintamiseen ja optimointiin. Bioresour. Technol. 2014, 160, 150–160. [CrossRef] [PubMed]

16. Araujo, PW; Brereton, RG Kokeellinen suunnittelu I. Seulonta. Trends-analyytikko. Chem. 1996, 15, 26–31. [CrossRef]

17. Wang, Y.; Zhao, L.; Zhang, R.; Yang, X.; Sun, Y.; Shi, L.; Xue, P. Ultraääniavusteisen uuton optimointi vasteen pintametodologialla, antioksidanttikapasiteetilla ja antosyaanien tyrosinaasia estävällä aktiivisuudella punaisesta riisileseestä. Food Sci. Nutr. 2020, 8, 921–932. [CrossRef]

18. Weremfo, A.; Adulley, F.; Adarkwah-Yiadom, M. Fenoliyhdisteiden mikroaaltoavusteisen uuttamisen ja avokadon (Persea americana Mill.) siementen antioksidanttiaktiivisuuden samanaikainen optimointi käyttäen vasteen pintamenetelmää. J. Anal. Methods Chem. 2020, 2020, 7541927. [CrossRef]

19. Ko, J.; Choi, J.; Bae, SK; Kim, J.; Yoon, KD Viiden oligostilbeenin erottaminen V itis amurensiksesta korkean suorituskyvyn vastavirtakromatografialla. J. Sep. Sei. 2013, 36, 3860–3865. [CrossRef]

20. Wang, K.-T.; Chen, L.-G.; Tseng, S.-H.; Huang, J.-S.; Hsieh, M.-S.; Wang, C.-C. Resveratrolin ja Vitis thunbergii var. taiwaniana lipopolysakkaridien aiheuttamaa niveltulehdusta vastaan. J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 3649–3656. [CrossRef]

21. Hu, J.; Lin, T.; Xu, J.; Ding, R.; Wang, G.; Shen, R.; Zhang, Y.-W.; Chen, H. Polyfenolit, jotka on eristetty Vitis thunbergii var. taiwaniana säätelee APP-tapaa. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2016, 26, 505–511. [CrossRef] [PubMed]

22. Oshima, Y.; Kamijou, A.; Ohizumi, Y.; Niwa, M.; Ito, J.; Hisamichi, K.; Takeshita, M. Novel oligostilbenes from Vitis coignetiae. Tetrahedron 1995, 51, 11979-11986. [CrossRef]

23. Anna Malinowska, M.; Billet, K.; Drouet, S.; Munsch, T.; Unlubayir, M.; Tungmunnithum, D.; Giglioli-Guivarc'h, N.; Hano, C.; Lanoue, A. Rypäleruokouutteet monikäyttöisenä nuorentavana kosmeettisena ainesosana: Sirtuiinin aktiivisuuden, tyrosinaasin eston ja biosaatavuuspotentiaalin arviointi. Molecules 2020, 25, 2203. [CrossRef] [PubMed]

24. Yang, HH; Voi, K.-E.; Jo, YH; Ahn, JH; Liu, Q.; Turk, A.; Jang, JY; Hwang, BY; Lee, KY; Lee, MK Tyrosinaasia inhiboivien aineosien karakterisointi Humulus japonicuksen ilmaosista käyttäen LC-MS/MS-kytkettyä online-määritystä. Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 509–515. [CrossRef] [PubMed]

25. Liu, Q.; Kim, C.; Jo, YH; Kim, SB; Hwang, BY; Lee, MK Resveratrolijohdannaisten synteesi ja biologinen arviointi melanogeneesin estäjinä. Molecules 2015, 20, 16933–16945. [CrossRef] [PubMed]

Lisätietoja: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501