Cistanche Deserticola Formula Granules -rakeiden tyypillinen HPLC-MS-profiili
Oct 13, 2025
Tekijät: Mao Dan; Yu Hong; Mao Xiuhong; Hu Qing; Ji Shen*
Jäsenyys: Shanghai Institute for Food and Drug Control; NMPA Key Laboratory for Quality Control of Traditional Chinese Medicines, Shanghai 201203, Kiina
Abstrakti
HPLC-MS:n perusteella luotiin Cistanche deserticola -rakeiden kromatografinen profilointimenetelmä. Käyttämällä autentikoituja Cistanche deserticola -keittiöpaloja ja ekinakosidivertailuainetta vertailuaineina, kymmenen näyteerää uutettiin suoraan 50-prosenttisella metanolilla ja analysoitiin HPLC:llä. Erotus suoritettiin Phenomenex Luna C18 -kolonnilla (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) asetonitriilin ja 0,1 % muurahaishapon gradientilla nopeudella 1,0 ml/min, 30 astetta ja UV-detektiolla 330 nm:ssä. Rakennettiin referenssikromatogrammi, jossa oli yhdeksän yhteistä piikkiä, joista viisi piikkiä tunnistettiin LC/Q-TOF-MS:llä. Kymmenen erä osoitti samankaltaisuutta, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 0,981. Ominaisprofiilin tarkkuus, stabiilisuus ja toistettavuusmittarit olivat tyydyttäviä. Menetelmä on yksinkertainen, tunnistaa tehokkaasti Cistanche deserticola -rakeet ja sitä voidaan käyttää laadun arvioinnissa.
Avainsanat: Cistanche deserticola; kaava rakeet; ominaiskromatogrammi; ekinakosidi; verbaskosidi (akteosidi); HPLC; LC-Q-TOF-MS; cistanche-etuudet; paras myytävänä oleva vesisäiliö
Cistanchen esittely
Cistanche (Rou Cong Rong)on tunnettu tonic perinteinen kiinalainen lääketiede (TCM), jolla on munuaisia vahvistavia, esanssia ravitsevia ja laksatiivisia vaikutuksia. Se nauhoitettiin ensimmäisen kerran Shennong's Classic of Materia Medicassa ja listattiin korkealuokkaiseksi lääkkeeksi. Kiinan kansantasavallan farmakopean vuoden 2020 painos (osa I) määrittelee aidot lähteet Cistanche deserticola YC Ma:n tai Cistanche tubulosa (Schenk) Wightin kuivatuiksi, hilseileviksi, meheviksi varreksi, joiden käsittelymenetelmät sisältävät raakatuotteen ja viinikäsitellyn tuotteen. Tärkeimpiä kemiallisia komponentteja ovat fenyylietanoidiglykosidit (PhG:t), iridoidit, lignaanit ja sokerit, jotka tukevat farmakologisia toimintoja, kuten hermosolujen suojaamista, ikääntymisen estämistä, maksan suojausta ja laksaatiota; kliiniset sovellusmahdollisuudet ovat laajat. Näistä PhG:t ovat aktiivisimpia aineosia.
Cistanche deserticola -rakeet ovat yksittäisiä yrttejä, jotka on valmistettu käsitellystä C. deserticolasta nykyaikaisilla valmistustekniikoilla käytettäväksi kliinisissä resepteissä. Niiden laadunvalvontaa varten ei tällä hetkellä ole kansallista standardia. Aiemmat tutkimukset raportoivat sisällön määritysmenetelmistä tai sormenjälkien ottamisesta C. tubulosa -rakeille, mutta ei kirjallisuutta tyypillisistä kromatogrammeista erityisesti C. deserticola -rakeille. Tässä tutkimuksessa kerättiin kymmenen erää HPLC:lle ominaisen profiilin määrittämiseksi ensimmäistä kertaa C. deserticolan kaavan rakeille, ja LC-MS:llä tunnistettiin viisi huippua. Tämä profiili tarjoaa tehokkaan ja tieteellisen perustan C. deserticola -rakeiden tiukkaan laadunvalvontaan.
Kokeellinen cistanche
1.1 Instrumentit ja reagenssit
Agilent 1100 HPLC UV-Vis-detektorilla ja ChemStationilla (Agilent, USA)
Agilent 1290 Infinity HPLC ja Agilent 6530 Q-TOF MS ESI-lähteellä (Agilent, USA)
Sartorius elektroninen vaaka (Sartorius Scientific Instruments, Peking, Kiina)
Elmasonic P ultraäänipuhdistin (Elma, Saksa)
Cistanche deserticolan vertailukeittopalat sekä ekinakosidin ja verbaskosidin (akteosidin) vertailuaineet ostettiin National Institutes for Food and Drug Controlilta (eränumerot . 121101-201603, 111670-201907, 111514-2019). Cistanosidi A, tubulosidi A ja isoverbaskosidi saatiin Shanghai Tauto Biotechilta (eränumerot . 21040621, 20061231, 21040824). Asetonitriili (HPLC-laatu) oli Merckiltä; muut reagenssit olivat analyyttistä laatua (Shanghai Lingfeng Chemical Reagents). Kymmenen erää C. deserticolan formulaatiorakeita (PFKL1–PFKL10), kolme erää C. deserticola -keittiöpaloja (YP1–YP3) ja kolme erää C. deserticolan standardikeittimiä (BZTJ1–BZTJ3) toimitti Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.
1.2 Liuosten valmistus
1.2.1 Vertailuratkaisut
Vertailuyrttiliuos: Punnitse 1 g autenttisia C. deserticolan keittopaloja tulpalliseen erlenmeyerpulloon, lisää 25 ml 50 % metanolia, sonikoita (250 W, 35 kHz) 30 minuuttia, jäähdytä, sekoita ja sentrifugoi. Käytä supernatanttia vertailuyrttiliuoksena.
Vertailuaineliuos: Valmista ekinakosidi 0,2 mg/ml 50 % metanolissa.
1.2.2 Testiliuos
Jauha näyte; punnitaan tarkasti noin 1 g 100 ml:n kullanruskeaan mittapulloon. Lisää 50 ml 50-prosenttista metanolia, sulje, ravista, punnita, liota 30 minuuttia ja sonikoita 40 minuuttia (250 W, 35 kHz). Annetaan jäähtyä, punnitaan uudelleen ja täytetään menetetyt painot 50 % metanolilla. Sekoita, seiso, suodata ja kerää seuraava suodos analysointia varten.
1.3 Instrumentaaliset olosuhteet
Kromatografiset olosuhteet: Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); liikkuva faasi A: asetonitriili; liikkuva faasi B: 0,1 % muurahaishappoa vedessä; gradienttieluointi: 0-5 min, 12 % A; 5–15 min, 12 % → 20 % A; 15–30 min, 20 % → 30 % A. Virtausnopeus 1,0 ml/min; ilmaisuaallonpituus 330 nm; kolonnin lämpötila 30 astetta; injektiotilavuus 10 μl. Ekinakosidipiikin perusteella laskettujen teoreettisten levyjen tulee olla suurempi tai yhtä suuri kuin 5000.
Huomautus: Alkuperäisessä tekstissä luetellaan "15–30 min, 20%→30% A" kahdesti; tämä tulkitaan yhdeksi askeleeksi.
Massaspektrometriset olosuhteet: ESI positiivi-ionitilassa; skannausalue m/z 50–1200. Lähdeasetukset: sumutin (N2) 35 psi; kuivauskaasu (N2) 15 l/min 200 asteessa; vaippakaasu (N2) 12 l/min 350 asteessa; kapillaari 3,5 kV; fragmentori 125 V; MS/MS törmäysenergiat (CID) jännitteillä 10, 20 ja 40 eV.
Tuloksia ja keskustelua
2.1 Näytteen esikäsittely ja tunnistusaallonpituus
Uuttoliuottimia (metanoli, 75 % metanolia, 50 % metanolia, 25 % metanolia), uuttomuotoja (ultraäänikäsittely, palautusjäähdytys) ja aikoja (10, 20, 40, 60 min) verrattiin. Optimaalinen esikäsittely oli 50 % metanolia 40 minuutin ultraäänikäsittelyllä. Koska C. deserticolan PhG:t osoittavat maksimaalisen UV-absorption 330 nm:ssä, havaitsemiseen valittiin 330 nm.
2.2 Kromatografisten olosuhteiden valinta
2.2.1 Sarakkeet
Zorbax SB-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), Kromasil 100-5-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) ja Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) tarjosivat riittävän sopivuuden ja järjestelmän; tunnusomaisten piikkien suhteelliset retentioajat (RRT) olivat ±10 %:n sisällä määritellyistä arvoista. Laboratoriot voivat valita näistä.
2.2.2 Liikkuva vaihe
Metanoli – 0,1 % muurahaishappo tuotti heikon erotuksen useimmille huipeille paitsi ekinakosidille; siksi asetonitriili-0,1 % muurahaishappo otettiin käyttöön ja optimoitiin osan 1.3 gradienttiin, mikä tuotti optimaalisen resoluution, levynumerot ja vakaan perusviivan. Koska muita huippuja ei eluoitunut 30 minuutin kuluttua, uudelleen tasapainottaminen aloitettiin alkuperäisestä koostumuksesta.
2.3 Tarkkuus, toistettavuus ja vakaus
Käyttämällä erää PFKL1 kohdan 1.2.2 mukaisesti valmistettu testiliuos injektoitiin kuusi kertaa kohdan 1.3 olosuhteissa. RRT-arvot ja suhteelliset piikkien pinta-alat yhdeksälle ominaiselle piikin olivat kaikki<1%, indicating good instrumental precision. Six independently prepared test solutions of PFKL1 yielded RSDs <1% for both RRTs and relative peak areas, demonstrating repeatability. Stability testing at 0, 3, 9, 14, 21, and 28 h showed RSDs <1% for RRTs and relative peak areas, indicating the test solution was stable within 0–28 h.
2.4 Ominaisen kromatogrammin ja teknisten parametrien määrittäminen
2.4.1 Ominainen vertailukromatogrammi
Kymmenen erää C. deserticolan kaavarakeita osoitti jatkuvasti yhdeksän ominaista piikkiä, jotka vastasivat retentioajaltaan yhdeksää piikkiä vertailuyrttiliuoksessa (kuvat 1–2). Viisi piikkiä määritettiin standardien mukaan: ekinakosidi, cistanosidi A, tubulosidi A, verbaskosidi (akteosidi) ja isoverbaskosidi. Ekinakosidipiikki muodosti suuren ja vakaan osuuden piikin kokonaispinta-alasta, ja se valittiin vertailuaineeksi. Kymmenen erän kromatografinen käyttäytyminen oli olennaisesti yhdenmukainen.
A.Tyhjäliuos;B.Ekinakosidi;C.Testiliuos;D.Cistanchedeserticola;E.Referencekarakterikromatogrammi.
Cistanche Tubulosan tekniset tiedot
2.4.2 Huippujen tunnistaminen
Testiliuokset (osio 1.2.2) analysoitiin LC-MS:llä sekä positiivisissa että negatiivisissa ESI-moodissa; positiivinen tila tarjosi rikkaamman huippuinformaation ja sitä käytettiin (kuva 3). Yhdisteitä tunnistettiin yhteensä yhdeksän; viisi vahvistettiin tarkalla massalla, retentioajalla ja MS/MS-fragmenteilla käyttämällä standardeja (taulukko 1). Koska PhG:t ovat C. deserticolan tärkeimmät vaikuttavat aineet ja että kaavan rakeet valmistetaan vesiuutolla, LC/Q-TOF-MS vahvisti PhG:t pääaineosiksi. Tämän mukaisesti luetteloitiin yhdeksän ominaista piikkiä ja viisi piikkiä, joilla oli suhteellisen voimakas vaste, merkittiin viitekromatogrammiin.
Kuva 2 HPLC-viiteominaisuuskromatogrammi 3(S):ekinakosidi;4:sistanosidiA;5:tubulosidiA; 6:Akteosidi;7:Isoakteosidi.
Kuva 3 Testiliuoksen 3(S):Ekinakosidi;4:SistanosidiA;5:TubulosidiA;6:Akteosidi;7:Isoakteosidi uuttovirtakromatogrammi.
2.4.3 Määritetyt suhteelliset retentioajat
Kymmenen erän perusteella keskimääräiset RRT:t (suhteessa S-huippuun, ts. ekinakosidiin) olivat: 0,77 (Piikki 1), 0,86 (Piikki 2), 1,00 (Piikki 3, S), 1,17 (Piikki 4), 1,27 (Piikki 5), 1Pe46 (Pe.43). 7), 1,67 (huippu 8) ja 1,81 (huippu 9). Jokaisen piikin RRT:n tulee olla ±10 % sen määritetystä arvosta.
Taulukko 1. Kromatografisen huippumassaspektrometrian parametrit, jotka liittyvätCistanche deserticolaFormula rakeet
| Huippu | Nimi | Molekyylikaava | m/z | Säilytysaika (min) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Tuntematon | C₅₁H₃₆O₁₁ | 824.2258 | 6.123 |
| 2 | Tuntematon | C₃₆H₃₀O₈ | 590.1941 | 6.876 |
| 3 | Ekinakosidi | C₃₅H₄₆O₂₀ | 809.2467 | 13.646 |
| 4 | Cistanoside A | C₃₆H₄₈O₂₀ | 823.2642 | 16.285 |
| 5 | Tubulosidi A | C₃₇H₄₈O₂₁ | 851.2570 | 17.947 |
| 6 | Acteoside | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1931 | 18.464 |
| 7 | Isoakteosidi | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1956 | 20.083 |
| 8 | Tuntematon | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2044 | 23.446 |
| 9 | Tuntematon | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2041 | 25.883 |
2.5 Samankaltaisuuden arviointi
Kymmenen erän kromatogrammit tuotiin "TCM:n kromatografisten sormenjälkien samankaltaisuuden arviointijärjestelmään (2012A)." Käytettäessä näytettä S1 referenssinä mediaanimenetelmä, 0,5 minuutin aikaikkuna, monipistekalibrointi ja tietojen täsmäys loi referenssisormenjäljen (kuva 4), jossa oli yhdeksän yhteistä huippua. Kaikkien kymmenen erän samankaltaisuusarvot olivat suurempia tai yhtä suuria kuin 0,981 (0,981–0,999), mikä osoittaa suurta erien välistä samankaltaisuutta.
2.6 Määrän ja laadun siirto keittopaloista tavanomaisiin keitto- ja kaavarakeiden käyttöön
Piikkien yhteensopivuus osoitti, että C. deserticolan keittopaloilla, vakiokeittimellä ja kaavarakeilla oli yhdeksän ominaista piikkiä, mukaan lukien viisi osoitettua piikkiä (ekinakosidi, cistanosidi A, tubulosidi A, verbaskosidi ja isoverbaskosidi) (kuva 5). Tunnusomaiset profiilit korreloivat voimakkaasti, ja siirtosäännöt keittopaloista → vakiokeite → kaavarakeista olivat selkeät. Keittopaloista tavalliseen keittoon huipun 6 (verbaskosidi) pinta-ala pieneni huomattavasti verbaskosidin lämpölabibiliteettien mukaisesti.
Kuva 4 Cistanche deserticola Formulagranules -rakeiden HPLC-ominaiskromatogrammin päällekkäisyys
2.7 C. deserticolan ja C. tubulosan kaavan rakeiden luonteenomaisten kromatogrammien vertailu
Sekä C. deserticola että C. tubulosa sisältävät ekinakosidia, cistanosidia A, verbaskosidia, isoverbaskosidia ja tubulosidi A:ta. Nämä kaksi lajia eroavat kuitenkin merkittävästi ekinakosidipitoisuudesta, ja cistanosidi A:ta on läsnä vain pieniä määriä C. tubulosassa. Siksi ekinakosidi ja cistanosidi A voivat toimia erottavina markkereina kasvitieteellisen alkuperän erottamisessa (C. deserticola vs. C. tubulosa).
Kuva 5 Cistanchedesertico-keittokappaleiden (A), standardikeittiön (B) ja kaavarakeiden (C) ominaiskromatogrammien vertailu 3(S):ekinakosidi;4:sistanosidiA;5:tubulosidiA;6:akteosidi;7:isoakteosidi.
Johtopäätös (muokattu pyynnöstä: millä lajilla on "parempi" sisältö)
Vahvistetun HPLC-MS-ominaisuusprofiilin puitteissaCistanche deserticolakaavarakeita, ja kun otetaan huomioon lajien välinen vertailu,C. deserticolasillä on rikkaampi ja tasapainoisempi fenyylietanoidiglykosidiprofiili: cistanosidi A havaitaan helposti C. deserticolassa, mutta sitä on vain vähänC. tubulosa, kunekinakosidiosoittaa selkeitä lajien välisiä eroja. Siksi Cistanche deserticolaa suositellaan sisällöltään paremmaksi lajiksi formulaatioille, joilla pyritään korkeampiin tärkeimpien PhG-yhdisteiden kokonaispitoisuuksiin ja vahvempiin yleishyötyihin. Jos tuote on erityisesti kohdistettumaksimaalinen ekinakosidi, valitut C. tubulosa -erätotettava huomioon tarjonnan ja erän testauksen mukaan. Käytännössä "paras myytävänä oleva vesisäiliö" tulisi määrittää ekinakosidin, verbaskosidin (akteosidin) ja cistanosidi A:n eräkohtaisella kvantitatiivisella testauksella tässä kuvatulla validoidulla menetelmällä.
Viitteet
[1] Tang SW. Luokiteltu Materia Medica. Peking: Huaxia Publishing House, 1993:192.
[2] Kiinan farmakopeakomissio. Kiinan kansantasavallan farmakopea (nide . 1). Peking: China Medicine Science and Technology Press, 2020:140.
[3] Zhi YJ, Zhen YQ, Tian W, et ai. Perinteiset kiinalaiset ja yrttilääkkeet, 2021, 52(9):2758.
[4] Zhen YQ, Tian W, Wang XG, et ai. Moderni perinteinen kiinalainen lääketiede, 2019, 39(1):83.
[5] Jing H, Zuo JF, Li JS. Lishizhen Medicine ja Materia Medica, 2006, 17(3):440.
[6] Han GQ, Li CF, Wang XQ, et ai. China Journal of Chinese Materia Medica, 2015, 40(21):4218.
[7] Lei L, Jiang Y, Liu X, et ai. Helv Chim Acta, 2010, 90(1):79.
[8] Liu XM, Li J, Jiang Y, et ai. Biochem Syst Ecol, 2013, 47(8):21.
[9] Gong HM, Hu H, Liu YC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2018, 33(6):623.
[10] Gao Y, Guo LN, Ma SC, et ai. China Journal of Chinese Materia Medica, 2019, 44(17):3749.
[11] Lu YH, Pi WM, Zhang Y, et ai. Moderni kiinalainen lääketiede, 2019, 21(8):999.
[12] Wang LW, Cao R, Fang YY, et ai. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2):295.
Huomautuksia
Yhdisteiden nimet: ekinakosidi; cistanosidi A; tubulosidi A; verbaskosidi (akteosidi); isoverbaskosidi.
Ilmeiset typografiset liput, jotka viittaavat "muskottipähkinään" lähteessä, käännettiin kontekstin perusteella "Cistanche".
