Luku 2: Munuaisten tubulusperoksisomit ovat välttämättömiä normaalin munuaisten toiminnan kannalta

Lisätietoja: ottaa yhteyttätina.xiang@wecistanche.com

Keskustelu

Peroksisomien suuri määrä proksimaalisessa tubuluksessa sekä munuaispoikkeavuuksien esiintyminen ZSD-potilailla ovat vahvasti osoittaneet peroksisomien tärkeän roolinmunuainen. Lisäksi useiden peroksisomaalisten entsyymien munuaisspesifinen ilmentyminen on tukenut ajatusta, että munuaisten peroksisomeilla voi olla biologisia toimintoja, jotka ovat osittain erilaisia ​​kuin muissa kudoksissa (15). Näiden hypoteesien testaamiseksi tutkimmemunuaisten toimintahiirillä, joista puuttuu peroksisomeja erityisestimunuaistiehyessä. Peroksisomien roolin tutkimiseen käytetyistä eri hiirimalleista valitsimme hiiret, jotka sallivat peroksisomin muodostumiselle välttämättömän Pex5:n koodaavan peroksisomin biogeneesitekijän PEX5:n ehdollisen geneettisen inaktivoinnin. Tämä malli valittiin, koska (i)Pex5-nollahiirillä on useita biokemiallisia ja toiminnallisia poikkeavuuksia, jotka muistuttavat ZSD-potilailla havaittuja(11) ja (i) suuri määrä hiirimalleja, joissa Pex5:n kudosspesifinen ablaatio on analysoitu(16), mikä antaa meille mahdollisuuden verrata munuaistiehyen peroksisomaalisen puutteen toiminnallisia seurauksia muissa kudoksissa havaittuihin seurauksiin. Kuten Baes et al. ovat osoittaneet, Pex{7}}null-hiirillä oli kohdunsisäistä kasvun hidastumista, aivojen epämuodostumista ja vaikeaa hypotoniaa ja ne kuolivat ensimmäisten 72 tunnin aikana (11). Biokemialliset analyysit paljastivat useita ZSD:n tunnusmerkkejä, mukaan lukien plasmalogeenien väheneminen maksassa ja aivoissa ja plasman VLCFA-tasojen voimakas nousu. Pex{{10}}null-hiirten munuaisista ei löytynyt kortikaalisia munuaiskystoja arvolla P0,5, mutta glomerulusten kohdunsisäisen kypsymisen hidastuminen havaittiin. Kalsiumoksalaattikerrostumien esiintymistä ei tutkittu.

Napsauta tätä saadaksesi tietää cistanche-yrtin eduista

cKOm-hiirillä peroksisomaalisen biogeneesin ablaatio munuaistiehyissä ei aiheuttanut mitään merkittävää fenotyyppiä, lukuun ottamatta pienentynyttä KW- ja BW-painoa pikkulapsilla cKOm-hiirillä ja pienentynyttä KW/BW-suhdetta aikuisilla cKOm-hiirillä. cKOf-hiirillä floxed Pex5-alleelin epätäydellinen poisto yhdessä Pex5-deleetion paljon lievemmän vaikutuksen kanssa munuaisten transkriptiin ja metabolomiin viittasivat siihen, että joitain jäännösperoksisomeja saattaa jäädä munuaistiehyissä. Kuitenkin,seksiäperoksisomaalisten toimintojen spesifisyyttä munuaisissa ei voida myöskään sulkea pois. Emme löytäneet mitään merkittävää morfologista eroa cKOm-hiirten munuaisissa, mikä voisi selittää alhaisemman KW- tai KW/BW-suhteen. Kuitenkin taipumus pienentää proksimaalisen solun leveyttä saattaa olla mahdollinen syy tähän eroon. Tärkeää on, että munuaisten homeostaattinen toiminta säilyi cKOm-hiirillä huolimatta merkittävistä muutoksista transkriptien ilmentymistasoissa, jotka koodaavat proteiineja, jotka osallistuvat ionien, veden, aminohappojen, orgaanisten anionien ja kationien, fosfaatin, uraatin ja megaliinivälitteisen multili-transepteelin transepiteliaaliseen kuljetukseen. gand endosyyttinen reitti. On huomattava, että suurin osa alassäädellyistä transkripteistä koodasi kuljettajia, jotka ilmentyivät proksimaalisessa tubuluksessa, kun taas useimmat ylössäädellyt transkriptit koodasivat kuljettajia, jotka ilmentyivät nefronin kauempana olevissa osissa. Esimerkiksi Nkcc2-, Clc-Kb-, Ncc- ja ENaC-transkriptien lisääntynyt ilmentyminen viittasi kompensoivaan nousuun postproksimaalisessa natriumin reabsorptiossa. Munuaisten transkription ja metabolomin integroitu analyysi paljasti syvällisiä muutoksia useissa solujen aineenvaihduntaan, lipidikalvon koostumukseen ja redox-homeostaasiin liittyvissä solureiteissä. cKOm-hiirten munuaisissa noin 8 prosentilla transkriptomista ja noin 24 prosentilla havaituista metaboliiteista oli erilaisia ​​tasoja verrattuna Ctrl-hiiriin. Kuten odotettiin, monet näistä transkripteistä ja metaboliiteista liittyivät peroksisomaaliseen toimintaan. Peroksisomeissa syntetisoituvien eetterifosfolipidiplasmalogeenien runsaudessa havaittiin dramaattinen väheneminen (~67 prosenttia cKOm-hiirissä ja ~50 prosenttia cKOf-hiirissä, kaikkien havaittujen plasmalogeenien painottamaton summa). Plasmalogeenit ovat tärkeimpiä solukalvon fosfolipidejä, joilla on kasvava määrä funktioita, mukaan lukien kalvon eheys, solujen signalointi ja antioksidanttipuolustus. Munuaisissa plasmalogeenit edustavat noin 20 prosenttia kaikista fosfolipideistä (17), mikä viittaa siihen, että vähintään 10 prosenttia fosfolipidikoostumuksesta erosi cKOm- ja cKOf-hiirten munuaisissa vastaavista kontrolleista. Plasmalogeenien ehtymistä kompensoi mahdollisesti rakenteellisesti samankaltaisten fosfatidyylietanoliamiinien (PE) ja fosfatidyylikoliinien (PC:t) lisääntynyt runsaus, jotka rikastuivat merkittävästi sekä cKOm- että cKOf-hiirten munuaisissa. On huomattava, että samanlainen kompensoiva lisääntyminen PE: n ja PC: n havaittiin ZSD potilaiden munuaisissa (17).

Proksimaalisen tubuluksen aineenvaihdunta perustuu pääasiassa rasvahappojen hapettumiseen, jolle on ominaista korkea ROS-sukupolvi, jota tuotetaan sekä mitokondrioissa että peroksisomeissa. cKO-hiirillä rasvahappojen hajoamiseen/biosynteesiin liittyvät reitit olivat oleellisesti ylössäädeltyjä, mikä mahdollisesti viittaa mitokondrioiden energiantuotannon kompensoivaan lisääntymiseen näistä substraateista. Koska yksi peroksisomien päätehtävistä on ROS:n detoksifikaatio, oletimme, että peroksisomien biogeneesin ablaatio indusoisioksidatiivista stressiäcKO-hiirten munuaisissa. Molekyylianalyysit eivät kuitenkaan paljastaneet muutoksia oksidatiivisen stressin antioksidanttikapasiteetissa ja biomarkkereissa. HFD-altistus ei aiheuttanut muutoksia toiminnallisessa fenotyypissä, lukuun ottamatta virtsan tilavuuden lievää lisääntymistä ja kalsiumin ja uraatin erittymistä virtsaan cKOm-hiirillä. Integroitu transkripti- ja metabolomianalyysi mahdollisti glutationireitin tunnistamisen mahdollisena kompensoivana mekanismina yleisen antioksidanttikapasiteetin ylläpitämiseksi munuaisten proksimaalisissa tubulussoluissa, joista puuttuu peroksisomeja.

Pex5:n ehdollinen deleetio sikiön maksassa (12), haimasoluissa (18) ja keskushermoston eri solutyypeissä (katso viitteessä 16) aiheuttaa vaihtelevia, mutta enimmäkseen vakavia elinspesifisiä toiminnallisia heikkenemiä. Munuaisissa näin ei ollut. Tässä tutkimuksessa tunnistimme useita luontaisia ​​munuaismekanismeja, jotka mahdollisesti mahdollistavat selviytymisen peroksisomien puutteesta. Koska munuainen on elin, jolla on korkea veren perfuusionopeus, toinen mahdollisuus on ainakin osan sellaisten metaboliittien ulkopuolisesta alkuperästä, joita munuainen ei tuota peroksisomien puuttuessa, mutta joita tarvitaan normaaliin munuaisten toimintaan. Yhdessä tietomme viittaavat siihen, että munuaisten tubulusperoksisomit ovat välttämättömiä normaalille munuaistoiminnalle ja että patofysiologiset muutokset ZSD-potilaiden munuaisissa ovat peräisin munuaisten ulkopuolelta.

menetelmät

Eläimet. Pex5a/la/Pax8-ntTA/LC-1 Cre-hiirten luomiseen käytetyt menetelmät kuvattiin aiemmin (13). Tässä tutkimuksessa käytetyt 3 hiirilinjaa ovat sisäsiittoisia kantoja, jotka on kasvatettu C57BL/6J-hiiren geneettisellä taustalla (The Jackson Laboratory). Ennen kaikkia kokeita hiiret sopeutettiin 12-tunnin valo/12-tunti pimeään sykliin. Kaikki kokeet suoritettiin vuorokausiajalla ZT3 (ZT0on aika, jolloin valo on kytketty päälle, ja ZT12 on aika, jolloin valo sammutetaan).

Käytettiin Pex5bxlo/Pax8-rtTA/LC1 kolminkertaisia ​​siirtogeenisiä uros- tai naarashiiriä (kutsutaan nimillä cKOm ja cKOf) ja Pex5l/a-hiiriä (kutsuttiin Ctrl tai Ctrl). Pex5-rekombinaatio vastasyntyneillä suoritettiin lisäämällä 0,2 prosenttia DOX:a ja 2 prosenttia sakkaroosia raskaana olevien naarashiirten juomaveteen 2 viikon ajan niiden 14. raskauspäivästä alkaen. Pex5-rekombinaatiota varten aikuisilla hiirillä DOX:a ja sakkaroosia lisättiin 8-viikon ikäisten hiirten juomaveteen. Munuaisten rakenne ja toiminta arvioitiin 4 viikkoa DOX-hoidon päättymisen jälkeen viikon ikäisillä vauvahiirillä tai 14-viikon ikäisillä aikuisilla hiirillä. 3 viikon vieroituksen jälkeen hiiret ruokittiin tavanomaisella kontrolliruokavaliolla, joka sisälsi 4,2 prosenttia rasvaa (vähärasvainen Sniff-kontrolliruokavalio) tai, kun mainittiin, 4 viikon ajan vastaavalla HFD:llä, joka sisälsi 20,7 prosenttia rasvaa (useimmiten LCFA:ta).

Metaboliset häkit ja veren ja virtsan kemia. Hiiret pidettiin yksittäisissä metabolisissa häkeissä (Tecniplast). Virtsan keräys suoritettiin 3-päivän sopeutumisjakson jälkeen. Virtsan ja veren kemia analysoitiin aiemmin kuvatulla tavalla (19). Plasman ja virtsan koostumus mitattiin Laboratoire Central de Chimie Cliniquessa, Center Hospitalier Universitaire Vaudoise University Hospital (Lausanne, Sveitsi).

Elektronimikroskopia. Munuaisnäytteet leikattiin noin 1 mm3:n paloiksi ja kiinnitettiin 2,5-prosenttiseen glutaraldehydiliuokseen (EMS) fosfaattipuskurissa (PB, 0,1 M pH 7,4) (MilliporeSigma) 2 tunnin ajaksi huoneenlämpötilassa (RT). Sitten ne huuhdeltiin 3 kertaa, kukin 5 minuuttia, PB-puskurissa ja sitten jälkikiinnitettiin tuoreella seoksella, jossa oli 1 % osmiumtetroksidia (EMS) ja 1,5 % kaliumferrosyanidia (MilliporeSigma) PB:ssä 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten näytteet pestiin 3 kertaa tislatussa vedessä ja dehydratoitiin asetoniliuoksessa (MilliporeSigma) asteittain määritellyissä pitoisuuksissa (30 prosenttia 90 minuuttia; 70 prosenttia 90 minuuttia; 100 prosenttia 120 minuuttia; 100 prosenttia 240 minuuttia). Tätä seurasi suodatus Epon-hartsissa (MilliporeSigma) porrastetuilla pitoisuuksilla (Epon/asetoni [1/3; tilavuus/tilavuus] 4 tuntia; Epon/asetoni [3/1; tilavuus/tilavuus] 4 tuntia, Epon/asetoni [1) /1;v/v] 8 tuntia; Epon/asetoni [1/1; v/v] 24 tuntia) ja lopuksi polymerointi 48 tuntia 60 asteessa uunissa. Ultraohuet 50 nm:n leikkeet leikattiin Leica Ultracutilla (Leica Mikrosysteme GmbH) ja poimittiin kupariselle rakoristikolle, 2 x 1 mm (EMS), joka oli päällystetty polystyreenikalvolla (MilliporeSigma). Leikkeet jälkivärjättiin uranyyliasetaatilla (MilliporeSigma) 2 prosentilla H, O:ssa 10 minuutin ajan, huuhdeltiin useita kertoja H, O:lla ja sen jälkeen Reynoldsin lyijysitraatilla 10 minuutin ajan ja huuhdeltiin useita kertoja H, O:lla.

Stereologia. Stereologia-analyysiä varten analysoitiin 3 munuaisen aivokuoren palaa hiirtä kohti, 15 mikrokuvaa näytettä kohti, pikselikoko 4,08 nm, käyttäen systemaattista yhtenäistä satunnaisnäytteenottoa transmissioelektronimikroskoopilla (Philips CM100, Thermo Fisher Scientific) kiihdytysjännitteellä 80 kV TVIPS TemCam-F416 digitaalikameralla (TVIPS GmbH).

Transkriptominen analyysi. Kaikki sekvensointitiedot ovat julkisesti saatavilla NIH Gene Expression Omnibusin kautta (tallennusnumero GSE179202). RNA-Seq-kirjastot valmistettiin käyttämällä 200 ng munuaisten kokonais-RNA:ta, kuten on kuvattu julkaisussa Nikolaeva et ai. (19). Käytettiin Illumina TruSeq SR Cluster Kit v4 -reagensseja. Sekvensointitiedot käsiteltiin käyttämällä Mus musculusta. GRCm38.{6}} geenin annotaatio, Tilastollinen analyysi suoritettiin R:ssä (versio 3.4.0). Transkriptit, joilla oli alhainen määrä, suodatettiin pois säännön 1 count per million (CPM) mukaisesti vähintään yhdestä näytteestä. Kirjastojen koot skaalattiin käyttämällä TMM-normalisointia ja log-muunnettiin CPM:ksi voom-menetelmällä (20). Pääkomponenttianalyysi osoitti pientä vaihtelua rinnakkaisten näytteiden välillä. Differentiaalinen ilmentyminen cKO- ja Ctrl-hiirten välillä laskettiin 1 F-testillä käyttämällä limmaa (21). P-arvot säädettiin kuvatulla tavalla (22) FDR-arvoiksi useiden vertailujen huomioon ottamiseksi käyttäen kaikkien miesten ja naisten transkriptien tuloksia tai valittujen kuljettajien tai peroksisomiin liittyvien transkriptien tuloksia vain miehillä. Transkriptiot FDR:llä<5% were="" considered="" significant.="" comparisons="" of="" expression="" levels="" were="" done="" using="" the="" mean="" fc="" of="" cpm="" in="" cko="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" individual="" values="" were="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" a="" weighted="" gsea="" was="" performed="" using="" the="" unfiltered="" transcript="" list="" ranked="" by="" signed="" p-value="" (product="" of="" p-value="" and="" sign="" of="" the="" fc).="" the="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" gsekegg="" function="" from="" the="" r="" package="" cluster="" profile(version="" 3.16.1)(23).="" kegg="" pathway="" collections="" were="" restricted="" to="" gene="" sets="" with="" minimum="" and="" maximum="" sizes="" of="" 10="" and="" 500,="" respectively.="" the="" enrichment="" scores="" were="" normalized="" by="" gene="" set="" size,="" and="" their="" statistical="" significance="" was="" assessed="" by="" permutation="" tests="" (n="">

Metabolinen analyysi. Metaboliitit pakastetuista munuaisnäytteistä tunnistettiin ultrakorkean suorituskyvyn nestekromatografia-tandem-massaspektroskopialla ja kvantifioitiin käyttämällä AUC:ta (Metabolon Inc). Raaka-arvot muunnettiin logaritmi- sesti ja normalisoitiin raaka-ainemäärän suhteen. Kaksisuuntaisia ​​ANOVA-kontrastitestejä käytettiin tunnistamaan biokemikaalit, jotka erosivat merkittävästi molempien sukupuolten cKO- ja Ctrl-hiirten välillä. P-arvot säädettiin kuvatulla tavalla (22) FDR-arvoiksi useita vertailuja varten ja metaboliitteiksi FDR:n kanssa.<5% were="" considered="" significantly="" modulated.="" for="" log2fc="" calculation,="" missing="" values,="" if="" any,="" were="" replaced="" with="" the="" minimum="" observed="" value="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="" compound.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" normalized="" values="" were="" divided="" by="" the="" median="" value="" obtained="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="">

Yhteinen transkriptomi-aineenvaihdunta-analyysi. Integroitu aineenvaihduntareitin analyysi, jossa yhdistettiin geeniekspression ja metabolomiikan tutkimuksista saadut tulokset, suoritettiin käyttämällä MetaboAnalyst 5:n.{1}} -verkkosivuston Joint Pathway Analysis -moduulia (24). Metaboliittien yhdistenimi ja transkriptien virallinen geenisymboli, joka on huomattavasti enemmän tai vähemmän runsas (FDR<0.05), along="" with="" their="" respective="" fcs="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice,="" were="" inputs.="" the="" integration="" was="" performed="" using="" kegg="" metabolic="" pathways="" with="" default="" settings(hypergeometric="" test="" for="" overrepresentation="" analysis,="" degree="" centrality="" for="" pathway="" topology="" analysis,="" and="" tight="" integration="" by="" combining="" queries).="" pathways="" with=""><0.1 were="" considered="" significantly="" affected="" in="" ckom="">

Värjäykset. Maapallon munuaisen rakenteen, kalsiumoksalaattikertymien tai neutraalin lipidikertymän värjäys suoritettiin poikittaisille munuaisviipaleille, jotka olivat 5 μm paksuja. Neutraaleja lipidivärjäystä lukuun ottamatta hiiret nukutettiin ja niiden vasen munuainen perfusoitiin vatsa-aortan läpi 4-prosenttisella paraformaldehydiliuoksella ennen kudoksen keräämistä. Globaalin munuaisen rakenteen analysointia varten parafiiniin upotetut munuaisviipaleet deparafiinittiin, hydratoitiin uudelleen, värjättiin H&E:llä, dehydratoitiin ja kiinnitettiin ROTI Histokittiin (Carl Roth GmbH). Neutraalit lipidit värjättiin munuaisviipaleisiin, jotka oli upotettu OCT-yhdisteeseen (Tissue-Tek) käyttämällä Oil Red O -liuosta. Kalsiumoksalaattikertymät värjättiin Pizzolaton (25) kuvaaman menetelmän mukaisesti. Lyhyesti sanottuna parafiiniin upotetuista munuaisviipaleista parafiini poistettiin ja hydratoitiin uudelleen, sitten ne upotettiin 1:1 liuokseen, jossa oli hopeanitraattia 5 % w/v ja vetyperoksidia 30 % ja asetettiin 60 W hehkulampun alle 30 minuutiksi. Objektilasit pestiin perusteellisesti tislatulla vedellä ja vastavärjättiin Nuclear Fast Redillä (MilliporeSigma), sitten kuivattiin ennen asennusta.ROTI Histokitt. Pitkittäiset munuaisviipaleet hiirestä, jota oli käsitelty kalsiumoksalaattinefropatiaa aiheuttavalla ruokavaliolla (1,5 prosenttia kalsiumia plus 1,5 prosenttia hydroksiproliinia sekoitettuna standardiruokaan 3 viikon ajan), toimi positiivisena kontrollina kalsiumoksalaatti munuaiskertymille. Tulokset analysoitiin käyttämällä Zeiss AxioScan.Z1 Slide Scanneria 100-kertaisella tai 200-kertaisella alkuperäisellä suurennuksella.

ELISA- ja Trolox-määritys.{0}}HNE mitattiin käyttämällä Abcam (ab238538) Lipid Peroxidation (4-HNE) Assay Kit -sarjaa. Kokonais- ja ei-entsymaattiset antioksidanttikapasiteetit arvioitiin Trolox-määrityssarjalla Abcamilta (ab65329).

Tilastot. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Tilastolliset testit ja merkittävyyden kynnys on kuvattu kuvioiden selitteissä tai vastaavissa Menetelmät-osissa. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä R-paketteja tai GraphPad Prism -ohjelmistoversiota 8.2.1. Kaikki t-testit olivat 2-pyrstöisiä.

Opintojen hyväksyntä. Kaikki eläinkokeet suoritettiin Sveitsin eläinten hoitoa koskevien ohjeiden mukaisesti, jotka ovat National Institutes of Healthin eläintenhoitoohjeiden mukaisia, ja Sveitsin kantonin (Canton de Vaud) ja liittovaltion eläinlääkintäviranomaisten hyväksymät (lupa 31827 DF:lle) (Direction generalale) de P'agriculture, de la viticulture et des affairs vetérinaires, Epalinges, Sveitsi).

Aikaisempi julkaisu: Osa tästä työstä on lähetetty tiivistelmänä American Society of Nephrologyn vuoden 2021 vuosikokoukseen (4.11.2021.https://www.asn-online.org/education/kidney-week/2021) /program-abstract.aspx?controlId=3605774).