Luku 1: Munuaisten tubulaariset peroksisomit ovat välttämättömiä normaalissa munuaistoiminnassa

Lisätietoja, ota yhteyttätina.xiang@wecistanche.com

Peroksisomit ovat erikoistuneita soluorganelleja, jotka osallistuvat erilaisiin aineenvaihduntaprosesseihin. Ihmisillä mutaatiot, jotka johtavat täydelliseen peroksisomien häviämiseen, aiheuttavat monielinten vajaatoimintaa (Zellwegerin spektrihäiriöt, ZSD), mukaan lukienmunuaisten vajaatoiminta. Kuitenkin peroksisomien (pato)fysiologinen roolimunuainenjää tuntemattomaksi. Käsittelimme peroksisomien rooliamunuaisten toimintahiirillä, joilla on ehdollinen peroksisomaalisen biogeneesin ablaatio munuaistiehyessä (cKO-hiiret). Toiminnalliset analyysit eivät paljastaneet mitään selvää munuaisfenotyyppiä cKO-hiirissä. Kuitenkin urospuolisilla cKO-hiirillä oli pienempi kehon ja munuaisten paino, ja aikuisilla urospuolisilla cKO-hiirillä oli huomattavaa pienenemistä munuaisten painossa ja munuaisten paino/kehon painosuhteessa. Stereologinen analyysi osoitti mitokondrioiden tiheyden lisääntymisen cKO-hiirten proksimaalisissa tubulussoluissa. Integroidut transkripti- ja metabolomianalyysit paljastivat useiden aineenvaihduntareittien syvällisen uudelleenohjelmoinnin, mukaan lukien glutationin aineenvaihdunta ja useiden tärkeimpien lipidiluokkien biosynteesi/biotransformaatio. Vaikka tämä analyysi ehdotti kompensoituaoksidatiivista stressiä, haaste korkearasvaisella ruokinnalla ei aiheuttanut merkittäviä munuaisten vajaatoimintaa cKO-hiirissä. Osoitamme, että munuaisten tubulaariset peroksisomit ovat välttämättömiä normaalille munuaistoiminnalle. Tietomme viittaavat myös siihen, että munuaisten vajaatoiminta ZSD-potilailla on peräisin munuaisten ulkopuolelta.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja cistanche tubulosa -uutteen eduista

Johdanto

Peroksisomit ovat yhteen kalvoon sitoutuneita organelleja, jotka Rhodin löysi ensimmäisen kerran hiiren munuaisista vuonna 1954 (1). Nykyiset arviot viittaavat siihen, että peroksisomit sisältävät yli 50 entsyymiä, jotka osallistuvat erilaisiin solutoimintoihin, mukaan lukien - erittäin pitkäketjuisten rasvahappojen (VLCFA:t), pitkäketjuisten rasvahappojen (LCFA:t) ja pitkäketjuisten dikarboksyylihappojen hapetukseen; haaraketjuisten rasvahappojen a- ja -hapetus; prostaglandiinien ja leukotrieenien hapetus; aminohappojen aineenvaihdunta; eetterifosfolipidien (mukaan lukien plasmalogeenit) ja sappihappojen biosynteesi; redox-homeostaasi; glyoksylaatin vieroitus; ja ferroptoosi. Peroksisomeja on kaikkialla lähes kaikissa nisäkässoluissa, ja eniten munuaisten proksimaalisissa tubulussoluissa ja hepatosyyteissä. Näissä soluissa peroksisomit vievät noin 3 prosenttia solutilavuudesta, mutta niiden lukumäärä, koko ja muoto vaihtelevat merkittävästi alkion ja sikiön jälkeisen kehityksen aikana (2); niiden määrä voi kasvaa suuresti erilaisissa stressiolosuhteissa (3). Vaikka monet peroksisomaaliset entsyymit on karakterisoitu hyvin, niiden ilmentymistä ja toiminnallista roolia munuaisissa käsitteleviä tutkimuksia on vähän. Lisäksi peroksisomien yleinen toiminnallinen merkitys munuaisissa on edelleen suurelta osin tuntematon.

Näyttöä peroksisomien roolista munuaisten (pato)fysiologiassa on saatu pääasiassa ihmisen geneettisistä tutkimuksista. Kahden tyyppisiä mutaatioita, jotka johtavat ihmisen peroksisomaalisiin sairauksiin, on tunnistettu: (i) peroksisomien biogeneesiin osallistuvien ns. peroksiinigeenien (PEX) mutaatiot ja (ii) spesifisten peroksisomaalisten entsyymien mutaatiot. Ensimmäisen tyyppinen mutaatio johtaa yleistyneeseen peroksisomaaliseen toimintahäiriöön, joka aiheuttaa aivohepatorenaalisia Zellwegerin spektrihäiriöitä (ZSD) (4). Vakavaa ZSD:tä sairastavat vauvat kuolevat yleensä ensimmäisen elinvuoden aikana monielinten vajaatoimintaan. Vaikka aivokuoren munuaiskystojen ja/tai munuaisten oksalaattikivien esiintyminen ZSD-potilailla on dokumentoitu hyvin vuosien ajan (5, 6), näihin häiriöihin johtavat molekyylimekanismit ovat toistaiseksi tuntemattomia. Muita mahdollisia ZSD:n munuaispoikkeavuuksia ei ole tutkittu, koska sairautta hallitsevat neurologiset komplikaatiot. Keskitasoisten tai lievempien ZSD-muotojen vaikutusta munuaisten toimintaan ei ole arvioitu systeemisesti. Todisteet, jotka yhdistävät yksittäisen peroksisomaalisen entsyymin puutteen munuaisten patofysiologiaan, ovat myös rajallisia.

Maksan peroksisomaalisen alaniinin mutaatiot: AGXT-geenin koodaama glyoksylaattiaminotransferaasi johtavat primääriseen hyperoksaluriaan tyyppi I, sairauteen, jolle on tunnusomaista kalsiumoksalaattikiteiden kerääntyminen munuaisiin (katso viite 7). Äskettäin peroksisomaalisessa enoyyli-CoA-hydrataasi- ja 3-hydroksiasyyli-CoA-dehydrogenaasi- (EHHADH) -entsyymissä on tunnistettu autosomaalinen hallitseva mutaatio, joka johtaa munuais-Fanconi-syndroomaan tai proksimaalisen tubuluksen yleistyneeseen toimintahäiriöön (8). . Tämä mutaatio aiheuttaa EHHADH:n väärin kohdistamisen mitokondrioihin ja mitokondrioiden toiminnan heikkenemistä. Geneettisillä rotkakannoilla tehdyt geenitutkimukset ovat osoittaneet, että peroksisomaalisella entsyymillä hydroksihappooksidaasi 2(HAO2) voi olla rooli verenpaineen säätelyssä (9,10). Kuitenkin, johtuuko tämä fenotyyppi muuttuneesta HAO2-toiminnasta munuaisissa tai muissa kudoksissa, ei tiedetä. Yleisesti ottaen tiedot eläinmalleista, joissa on peroksisomin biogeneesin munuaisspesifisiä vikoja tai yksittäisen peroksisomaalisen entsyymin munuaisspesifistä inaktivaatiota, puuttuvat edelleen. Tässä käsittelimme peroksisomien roolia munuaisten toiminnassa uros- ja naarashiirillä, joilla peroksisomaalisen biogeneesin ehdollinen ablaatio munuaistiehyissä.

Tulokset

Infant uros- ja naarashiirten, joilla on ehdollinen peroksisomaalisen biogeneesin ablaatio munuaistiehyessä, luominen ja peruskarakterisointi. Peroksisomien biogeneesi munuaistiehyessä katkesi Pex5:tä koodaavan sytosolisen peroksisomikohdistussignaalin 1 (PTS1) -reseptorin ehdollisen inaktivoinnin vuoksi, mikä on välttämätöntä PTS1-motiivia sisältävien proteiinien tuomiseksi peroksisomeihin (11, 12). Pex5:n ehdollinen deleetio munuaistiehyessä saavutettiin käyttämällä doksisykliinillä indusoituvaa (DOX-indusoituvaa) järjestelmää (PexSanlo/Pax8-rtTA/LC1-hiiret, viite 13). Koska peroksisomien toiminnallinen merkitys voi olla iästä riippuvainen (14), munuaisten Pex5-puutoksen peruskarakterisointi suoritettiin sekä pikkulapsilla että aikuisilla hiirillä. Kokeissa pikkulapsisilla hiirillä floxed Pex5-alleelin leikkaaminen saavutettiin antamalla DOX:a (2 mg/ml juomavedessä) raskaana oleville naaraille kohdassa E14 ja ylläpidettiin P7:ään asti. Pienet hiiret tapettiin P28:ssa. Kontrollina käytettiin hiiriä, joilla oli Pex5oilo-genotyyppi. Kuten lisäkuvassa 1A näkyy (tämän artikkelin yhteydessä saatavilla olevaa lisämateriaalia; https://doi.org/10.1172/jci.insight.155836DS1), DOX-käsittely johti floxed Pex5-alleelin lähes täydelliseen poistoon Pexswn/Pax{{ 29}}GTA/LC1 uros- ja naaraspuoliset hiiret. Munuaisleikkeiden analyysi ei paljastanut mitään selviä histologisia poikkeavuuksia tai munuaiskiviä pienissä hiirissä, joilta puuttui Pex.5 munuaistiehyissä (ei esitetty). Albuminuriaa ei esiintynyt Pex{32}}täplävirtsanäytteissä, joissa ei ollut molempiasukupuolet(Lisäkuva 1B). Ruumiinpaino (BW) ja munuaisten paino (KW), mutta ei KW/BW-suhde, olivat pienemmät urospuolisilla Pex{1}}-pienikäisillä hiirillä verrattuna poikuekontrolleihin (lisäkuva 1C).

Aikuisten uros- ja naarashiirten, joilla on ehdollinen peroksisomaalisen biogeneesin ablaatio munuaistiehyessä, luominen ja peruskarakterisointi. Pex5-deleetio aikuisten hiirten munuaistiehyessä indusoitiin 2-viikon DOX-hoidolla 8-viikon ikäisille Pex5xio/Pax8-ntTA/LC1-uros- ja naarashiirille, jäljempänä cKOm- ja cKOf-hiirinä, vastaavasti (katso menetelmät). Samanaikaisesti sama DOX-käsittely annettiin heidän poikuekontrolleilleen (Pex5a/lx-hiiret, joita kutsutaan tämän jälkeen vastaavasti Ctrlm- ja Ctrlf-hiiriksi). Kaikki kokeet aikuisilla hiirillä suoritettiin 4 viikkoa DOX-hoidon päättymisen jälkeen. Kuten kuviossa 1A esitetään, Pex5-mRNA:n ilmentyminen väheni merkittävästi sekä cKOm- että cKOf-hiirten munuaisissa. Kuitenkin cKOf-hiirissä oli myös havaittavissa jonkin verran jäljellä olevaa täyspitkää Pex5-mRNA:ta, mikä viittaa floxed-alleelin epätäydelliseen poistoon. Samoin PEX5-proteiini puuttui käytännössä cKOm-hiirten munuaisista, mutta oli silti havaittavissa cKOf-hiirissä, vaikkakin olennaisesti alhaisemmalla tasolla. Tämä ero oli nähtävissä, kun munuaisuutteet cKOm- ja cKOf-hiiristä ladattiin samalle SDS-PAGE-geelille ja immunoblotattiin yhdessä (kuvio 1B). Sekä Kim- että cKOf-hiiret olivat elinkelpoisia, heillä ei ollut ilmeisiä poikkeavuuksia, ja niillä oli normaali BW verrattuna kontrollihiiriin (lisätaulukko 1). KW- ja KW/BW-suhteet olivat huomattavasti alhaisemmat cKOm-hiirillä verrattuna Ctrl-hiiriin, mutta eivät cKOf-hiirillä verrattuna Ctrlf-hiiriin (kuviot 1, C ja D, vastaavasti). 24-Tunnin virtsa- ja plasmanäytteiden analyysi ei paljastanut genotyypin vaikutusta molempia sukupuolia edustavilla hiirillä, lukuun ottamatta pienempiä plasman kaliumtasoja cKOm-hiirillä verrattuna Ctrl-hiiriin (lisätaulukko 1). Albuminuria puuttui sekä cKOm- että cKOf-hiirten virtsasta (täydentävä kuva 2A). CKOm-hiirten munuaisissa ei havaittu suuria morfologisia muutoksia, kalsiumoksalaattikertymiä tai lipidien kertymistä (vastaavasti täydentävä kuva 2, BD).

Proksimaalisten tubulussolujen elektronimikroskopiaarvio aikuisilla cKO-hiirillä. Munuaisen aivokuoren elektronimikroskopia-arviointi paljasti suuren määrän peroksisomeja Ctrlm- ja Ctrlf-hiirten proksimaalisissa tubulussoluissa (kuva 2, A ja B, vastaavasti). Peroksisomit puuttuivat käytännössä cKOm- ja cKOf-hiirten proksimaalisista tubuluksista (kuva 2, Cand D, vastaavasti). Stereologisia työkaluja käytettiin solujen kvantitatiiviseen analyysiin

organellit ja solumitat Ctrlm- ja cKOm-hiirten proksimaalisissa tubuluksissa. Sekä peroksisomien tilavuustiheys (luku/μm² sytoplasma) että peroksisomien miehittämän sytoplasman prosenttiosuus proksimaalisissa tubulussoluissa väheni dramaattisesti cKOm-hiirillä (kuva 3, A ja B, vastaavasti), päinvastoin mitokondrioiden tilavuustiheys sekä Proksimaalisten tubulussolujen mitokondrioiden miehittämän sytoplasman prosenttiosuus lisääntyi cKOm-hiirissä verrattuna Ctrl-hiiriin (kuvio 3, C ja D, vastaavasti). Myös tilavuustiheys ja proksimaalisten tubulussolujen lysosomien miehittämän sytoplasman prosenttiosuus eivät eronneet Kim- ja Ctrlm-hiirten välillä (kuva 3, E ja F, vastaavasti). Kuten kuviossa 3G esitetään, cKOm-hiirten proksimaaliset tubulussolut vähensivät solun leveyttä (P= 0.083).

Integroidut transkriptomiset ja metabolomiset analyysit viittaavat syvälliseen uudelleenohjelmointiin aineenvaihdunnan, antioksidanttien ja lipidisynteesireiteissä cKO-hiirten munuaisissa. Integroitu syvä transkripti-sekvensointi ja metabolomianalyysi suoritettiin molekyylimuutosten tunnistamiseksi cKO-hiirten munuaisissa (GSE179202). Transkriptomien vertailut paljastivat 1350 transkriptia, jotka ekspressoituivat eri tavalla Ctrlm- ja cKOm-hiirten munuaisissa (kuva 4A ja täydentävä taulukko 2, FDR< 5%)and="" 121="" transcripts="" differentially="" expressed="" in="" kidneys="" of="" ctrlf="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 4b="" and="" supplemental="" table="" 3,="">< 5%).="" 61="" differentially="" expressed="" transcripts="" were="" present="" in="" both="" sexes(figure="" 4c="" and="" supplemental="" figure="" 3).="" enrichment="" analysis="" of="" 100="" genes="" encoding="" proteins="" related="" to="" peroxisomal="" function(kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes="" [kegg]="" pathway="" hsa04146)performed="" on="" transcriptomes="" of="" ctrlm="" and="" ckom="" mice="" revealed="" 52="" transcripts="" either="" up-or="" downregulated="" in="" kidneys="" of="" ckom="" mice="" (figure="" 4d="" and="" supplemental="" figure="" 4).="" gene="" set="" enrichment="" analysis(gsea)="" performed="" on="" the="" kegg="" pathway="" database="" (release="" on="" december="" 11,="" 2020)showed="" downregulation="" of="" pathways="" related="" to="" the="" metabolism="" of="" pyruvate,="" glyoxylate="" and="" dicarboxylate,="" amino="" acids="" (arginine,="" proline,="" cysteine,="" methionine,="" tryptophan,="" alanine,="" and="" histidine),="" or="" glutathione(figure="" 4e="" and="" supplemental="" figure="" 5)="" and="" upregulation="" of="" pathways="" related="" to="" fatty="" acid="" synthesis="" and="" degradation,="" ppar="" signaling,="" and="" abc="" transporters="" (figure="" 4f="" and="" supplemental="" figure="" 6).="" no="" enrichment="" was="" found="" in="" pathways="" linked="" to="" inflammation="" or="" fibrosis.="" targeted="" analysis="" of="" several="" groups="" of="" functionally="" related="" genes="" that="" are="" not="" represented="" in="" kegg="" pathways="" revealed="" substantial="" changes="" in="" the="" expression="" of="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" the="" peroxisomal="" metabolism="" of="" fatty="" acids="" (acsl1/3/4/6,="" acsvl1,="" acot3/4,="" acnat1,="" acox3,="" abcd3,="" ehhadh,="" and="" acaa1b),="" plasmalogen="" biosynthesis="" (far1="" and="" agps),="" bile="" acid="" synthesis(amacr="" and="" hsd17b4),="" and="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)="" detoxification(cat="" and="" sod1)="" (supplemental="" figure="" 3).="" alterations="" were="" also="" noted="" in="" the="" expression="" of="" a="" large="" number="" of="" genes="" critical="" for="" membrane="" transport="" processes="" in="" the="" proximal="" tubule,="" thick="" ascending="" limb="" (tal),="" and="" distal="" nephron(supplemental="" figure="" 7="" and="" supplemental="" table="" 4).="" for="" instance,="" in="" the="" proximal="" tubule,="" we="" found="" a="" reduction="" in="" the="" expression="" of="" an="" aquaporin-1="" water="" channel(agp1);="" megalin="" (lrp2);="" phosphate="" transporter="" napi-2a="" (slc34al);="" urate="" transporters="" uratl="" (slc22a12),="" npt1/4="" (sic17al/3),="" and="" oat1="" (slc22a6);="" and="" numerous="" other="" organic="" anion="" and="" amino="" acid="" transporters.="" in="" the="" tal="" and="" distal="" nephron,="" there="" was="" a="" substantial="" increase="" in="" the="" expression="" of="" genes="" encoding="" proteins="" involved="" in="" sodium="" reabsorption:="" nkcc2="" (slc12a1),="" clc-kb="" (clcnkb),="" βenac="" (scnn1b)=""><0.05), and="" ncc="" (slc12a3)(fdr="">

<0.05. (d)="" enrichment="" analysis="" of="" a="" homemade="" gene="" set="" (based="" on="" the="" kegg="" pathway="" mmu04146)="" targeting="" 100="" transcripts="" related="" to="" peroxisomal="" functions,="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" scatter="" plot="" of="" the="" top="" 25="" most="" downregulated="" (e)="" or="" upregulated="" (f)="" metabolic="" pathways="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice,="" based="" on="" an="" untargeted="" gsea="" using="" a="" database="" of="" 543="" kegg="" metabolic="" pathways.="" pathways="" are="" sorted="" by="" their="" absolute="" normalized="" enrichment="" score.="" a="" significant="" pathway="" regulation="" can="" be="" considered="" when="" adjusted="" p="" value="" referred="" to="" as="" "q="" value"="" is=""><0.2" alt="Figure 4. Transcriptional reprogramming in the kidneys of cKO mice. (A and B) Volcano plot representing the relative transcriptional expression of all renal transcripts in cKOm versus Ctrlm (A) or cKOf versus Ctrlf (B). Transcripts depicted in blue are significantly downregulated while transcripts depicted in red are significantly upregulated. (C) Venn diagrams showing the number of transcripts significantly downregulated or upregulated in cKOm (in blue) or cKOf (in pink) mice versus Ctrl mice of the same sex. A significant transcript regulation is considered when the adjusted P value referred to as " fdr"="" is=""><0.05. (d)="" enrichment="" analysis="" of="" a="" homemade="" gene="" set="" (based="" on="" the="" kegg="" pathway="" mmu04146)="" targeting="" 100="" transcripts="" related="" to="" peroxisomal="" functions,="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" scatter="" plot="" of="" the="" top="" 25="" most="" downregulated="" (e)="" or="" upregulated="" (f)="" metabolic="" pathways="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice,="" based="" on="" an="" untargeted="" gsea="" using="" a="" database="" of="" 543="" kegg="" metabolic="" pathways.="" pathways="" are="" sorted="" by="" their="" absolute="" normalized="" enrichment="" score.="" a="" significant="" pathway="" regulation="" can="" be="" considered="" when="" adjusted="" p="" value="" referred="" to="" as="" "q="" value"="" is=""><0.2" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Kaikista 852 havaitusta metaboliitista 207 osoitti erilaista runsautta Ctrlm- ja cKOm-hiirten munuaisissa, ja 118 osoitti erilaista runsautta Ctrlf- ja cKOf-hiirten munuaisissa (lisätaulukko 5, FDR<5%). seventy-nine="" metabolites="" demonstrating="" differential="" abundance="" were="" common="" in="" both="" comparisons(figure="" 5a="" and="" supplemental="" table="" 6).among="" metabolites="" showing="" the="" most="" significant="" differences="" were="" plasmalogens="" and="" sphingomyelins(decreased="" abundance)and="" glutathione-related="" metabolites="" and="" dicarboxylic="" acids="" (increased="" abundance)="" in="" kidneys="" of="" both="" ckom="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 5b="" and="" supplemental="" figure="" 8,="" respectively).="" global="" analysis="" of="" metabolome="" confirmed="" that="" plasmalogens="" and="" sphingomyelins="" constituted="" a="" majority="" of="" metabolites="" showing="" a="" decreased="" abundance="" in="" kidneys="" of="" both="" ckom="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 5c).lcfa="" dicarboxylates,="" very="" long-chain="" fatty="" acyl-carnitines,="" phosphatidylcholines,="" and="" phosphatidylethanolamines="" were="" present="" among="" metabolites="" with="" increased="" abundance,="" in="" addition="" to="" glutathione-related="" metabolites="" and="" dicarboxylic="" acids(figure="">

<0.05. metabolites="" are="" identified="" by="" their="" biochemical="" name="" and="" sorted="" by="" related="" metabolisms="" and="" subclasses="" of="" metabolites.="" for="" each="" metabolite,="" the="" individual="" expression="" of="" 6="" ctrl="" and="" 6="" cko="" mice="" normalized="" between="" 0="" and="" 1="" and="" the="" log2="" -transformed="" mean="" fold="" change="" of="" expression="" (log2fc)="" in="" cko="" versus="" ctrl="" mice="" are="" given,="" for="" both="" sexes.="" for="" calculation="" of="" the="" mean="" fc="" of="" expression,="" missing="" values="" (depicted="" in="" gray)="" have="" been="" replaced="" by="" the="" minimum="" value="" of="" both="" genotypes="" from="" the="" same="" sex."="" alt="Figure 5. Remodeling of the renal metabolome in cKO mice. (A) Venn diagrams representing the number of detected renal metabolites showing a significantly decreased or increased abundance in cKOm (in blue) or cKOf (in pink) mice versus Ctrl mice of the same sex. (B) Volcano plot representing the relative abundance of all detected metabolites in kidneys of cKOm versus Ctrlm. Metabolites depicted with blue dots are significantly less abundant, and transcripts depicted with red dots are significantly more abundant in kidneys of cKOm mice as compared with Ctrlm mice. The names of some representative metabolites are depicted using colors shared for related metabolites. (C and D) Heatmaps of metabolites showing a significantly decreased (C) or increased (D) abundance in cKO mice of both sexes as compared with Ctrl mice. A significant difference of abundance is considered when adjusted P value from a 2-way ANOVA referred to as " fdr"="" is=""><0.05. metabolites="" are="" identified="" by="" their="" biochemical="" name="" and="" sorted="" by="" related="" metabolisms="" and="" subclasses="" of="" metabolites.="" for="" each="" metabolite,="" the="" individual="" expression="" of="" 6="" ctrl="" and="" 6="" cko="" mice="" normalized="" between="" 0="" and="" 1="" and="" the="" log2="" -transformed="" mean="" fold="" change="" of="" expression="" (log2fc)="" in="" cko="" versus="" ctrl="" mice="" are="" given,="" for="" both="" sexes.="" for="" calculation="" of="" the="" mean="" fc="" of="" expression,="" missing="" values="" (depicted="" in="" gray)="" have="" been="" replaced="" by="" the="" minimum="" value="" of="" both="" genotypes="" from="" the="" same="" sex."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Nivelreittianalyysi (MetaboAnalyst 5.0) transkripteistä ja metaboliitteista, joiden esiintyminen lisääntyi tai vähentyi cKOm-hiirten munuaisissa verrattuna Ctrl-hiiriin, tunnisti 22 alennettua ja 7 ylössäädeltyä reittiä (kuva 6, A ja B, vastaavasti; FDR).<0.1; supplemental="" table="" 7).="" nitrogen="" metabolism,="" pyruvate="" metabolism,="" glycolysis,="" and="" gluconeogenesis="" were="" identified="" among="" the="" downregulated="" pathways="" while="" fatty="" acid="" degradation="" was="" identified="" among="" the="" upregulated="" pathways="" (figure="" 6,="" a="" and="" b,="" respectively).="" glutathione="" metabolism="" and="" retinol="" metabolism="" were="" present="" among="" both="" up-and="" downregulated="" pathways="" (figure="" 6,="" a="" and="" b).="" detailed="" analysis="" of="" transcripts="" and="" metabolites="" related="" to="" glutathione="" metabolism="" identified="" 16="" transcripts="" and="" 3="" metabolites="" with="" decreased="" abundance="" in="" kidneys="" of="" ckom="" mice="" (figure="" 6,="" c="" and="" d,="" respectively),="" along="" with="" 6="" transcripts="" and="" 8="" metabolites="" exhibiting="" increased="" abundance(figure="" 6,="" e="" and="" f,="" respectively).="" the="" oxidized="" form="" of="" glutathione(gssg)was="" present="" in="" ckom="" but="" not="" in="" ctrlm="" mice,="" thereby="" suggesting="" oxidative="" stress="" in="" ckom="" mice(figure="">

<0.1. the="" size="" of="" each="" dot="" depends="" on="" the="" percentage="" of="" all="" transcripts="" and="" metabolites="" ("compounds")="" of="" the="" pathway="" that="" are="" significantly="" affected="" in="" ckom="" mice.="" (c="" and="" d)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (c)="" and="" metabolites="" (d)="" significantly="" less="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (e)="" and="" metabolites="" (f)="" significantly="" more="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" individual="" values="" from="" 6="" ckom="" and="" 6="" ctrlm="" mice="" are="" depicted="" after="" transformation="" from="" raw="" individual="" data:="" values="" of="" metabolite="" abundance="" have="" been="" divided="" by="" the="" median="" value="" of="" both="" genotypes,="" while="" values="" of="" transcript="" expression="" from="" both="" genotypes="" have="" been="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" box="" and="" whiskers="" represent="" the="" mean="" and="" the="" sem,="" respectively.="" nd,="" not="" detected."="" alt="Figure 6. Joint analysis of transcriptional and metabolic changes in cKOm mice. (A and B) Scatter plot of significantly downregulated (A) or upregulated (B) metabolic pathways, based on a joint pathway analysis of both regulated transcripts and modulated metabolites in kidneys of cKOm versus Ctrlm mice. Pathways are sorted by their absolute impact, and a significant pathway regulation is considered when adjusted P value referred to as " fdr"="" is=""><0.1. the="" size="" of="" each="" dot="" depends="" on="" the="" percentage="" of="" all="" transcripts="" and="" metabolites="" ("compounds")="" of="" the="" pathway="" that="" are="" significantly="" affected="" in="" ckom="" mice.="" (c="" and="" d)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (c)="" and="" metabolites="" (d)="" significantly="" less="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (e)="" and="" metabolites="" (f)="" significantly="" more="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" individual="" values="" from="" 6="" ckom="" and="" 6="" ctrlm="" mice="" are="" depicted="" after="" transformation="" from="" raw="" individual="" data:="" values="" of="" metabolite="" abundance="" have="" been="" divided="" by="" the="" median="" value="" of="" both="" genotypes,="" while="" values="" of="" transcript="" expression="" from="" both="" genotypes="" have="" been="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" box="" and="" whiskers="" represent="" the="" mean="" and="" the="" sem,="" respectively.="" nd,="" not="" detected."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Runsasrasvainen ruokintahaaste ei johda ylimääräiseen oksidatiiviseen stressiin ckKO-hiirillä. Muutokset glutationiin liittyvissä reiteissä, plasmalogeenien väheneminen ja vähentynyt katalaasin ilmentyminen viittasivat oksidatiiviseen stressiin ja/tai erilaisten antioksidanttipuolustusjärjestelmien uudelleenjärjestelyyn cKOm-hiirten munuaisissa. Näiden hypoteesien testaamiseksi haastoimme cKOm-hiiriä korkearasvaisella ruokavaliolla (HFD) 4 viikon ajan. Tämä haaste ei johtanut albuminuriaan, vaan lisääntyneeseen virtsamäärään ja kalsiumin ja uraatin erittymiseen virtsaan. Mitään eroa ei havaittu testatuissa plasmaparametreissa, mukaan lukien kalsemia ja urikemia (lisätaulukko 8). HFD-altistettujen Ctrlm- ja cKOm-hiirten munuaisissa ei havaittu suuria morfologisia muutoksia tai lipidien kertymistä (kuvio 7A). Kokonais- ja ei-entsymaattinen antioksidanttikapasiteetti Trolox-määrityksellä (kuvio 7B) arvioituna sekä malondialdehydin, joka on monityydyttymättömien rasvahappojen peroksidaatiomerkki (kuva 7C), kudostasot eivät eronneet hoitojen ja genotyyppien välillä. Lipidiperoksidaatiotuotteen 4-hydroksinonenaalin (4-HNE) runsaus lisääntyi HFD:llä hoidetuissa Ctrlm-hiirissä verrattuna kontrolliruokavaliolla oleviin Ctrl-hiiriin, mutta eroa ei havaittu cKOm-hiirissä, joita hoidettiin 2:lla. ruokavaliot (kuva 7D).