Sevofluraanin lyhyt hengittäminen voi vähentää gliaarpien muodostumista vastasyntyneiden rottien hypoksis-iskeemisen aivovaurion jälkeen, osa 1

Abstrakti

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että sevofluraanin jälkihoito voi tarjota hermosuojan hypoksis-iskeemisen vamman jälkeen ja parantaa oppimista ja muistitoimintoja kehittyvien jyrsijöiden aivoissa.

Hypoksi-iskeeminen vaurio viittaa patologiseen tilaan, joka johtuu aivoiskemiasta, hypoksiasta, aineenvaihduntahäiriöstä ja hermosoluvauriosta, joka johtuu sydän- ja aivoverisuonijärjestelmän häiriöistä. Sosiaalisen edistyksen ja elämäntapamuutosten myötä hypoksis-iskeemiset vammat ovat yhä yleisempiä. Tämä tila voi aiheuttaa monia haittoja ihmisten terveydelle, mukaan lukien älykkyys ja muisti.

Vaikka hypoksia ja iskemia voivat aiheuttaa aivojen toiminnan heikkenemistä, se ei tarkoita, että muisti heikkenee. Päinvastoin, voimme parantaa muistia ja lisätä aivojen tehokkuutta oikeilla menetelmillä. Tässä on joitain tapoja parantaa muistiasi:

1. Terveellinen ruokavalio: Ruokavalion vaikutus muistiin on erittäin tärkeä. Ruoat, jotka sisältävät runsaasti proteiineja, vitamiineja ja kivennäisaineita, voivat auttaa ylläpitämään tervettä hermostoa ja ajattelua.

2. Harjoittele enemmän: Fyysinen harjoittelu voi edistää verenkiertoa, lisätä hapen virtausta, parantaa kehon vastustuskykyä ja vähentää sairastumisriskiä. Harjoittelemalla voit parantaa muistikykyäsi.

3. Vahvista itseluottamusta: Itseluottamus on tärkeä tekijä henkilön muistissa. Jos uskot pystyväsi suorittamaan tietyn tehtävän, saavutat helposti haluamasi tulokset ja voit myös parantaa tehokkaasti muistiasi.

Voidaan nähdä, että hypoksis-iskeeminen vamma ei ole tila, joka väistämättä vahingoittaa ihmisen muistia. Niin kauan kuin hallitsemme oikeat menetelmät ja pidämme hyvää huolta aivoistamme, voimme omaksua terveen tulevaisuuden positiivisella asenteella. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistia, ja Cistanche deserticola voi parantaa muistia merkittävästi, koska Cistanche deserticola on perinteinen kiinalainen lääkeaine, jolla on monia ainutlaatuisia vaikutuksia, joista yksi on parantaa muistia. Cistanche deserticolan teho johtuu sen sisältämistä useista aktiivisista ainesosista, mukaan lukien tanniinihappo, polysakkaridit, flavonoidiglykosidit jne. Nämä ainesosat voivat edistää aivojen terveyttä monin eri tavoin.

Napsauta Tiedä 10 tapaa parantaa muistia

Klassista Rice-Vannucci-mallia käytettiin indusoimaan hypoksi-iskeeminen vamma ja vastasyntyneitä (postnataalipäivä 7) rottia käsiteltiin 2,4-prosenttisella sevofluraanilla 30 minuutin ajan hypoksis-iskeemisen vaurion jälkeen.

Tuloksemme osoittivat, että sevofluraanin jälkihoito paransi merkittävästi rottien oppimis- ja muistitoimintoja, vähensi astroglioosia ja glialscar-muodostusta, lisäsi dendriittikärkien määrää ja suojasi aivoturson histomorfologiaa. Mekaanisesti sevofluraanin jälkikäsittely vähensi von Hippel-Lindaun hypoksian aiheuttaman tekijän -1 ilmentymistä ja lisäsi DJ-1 ilmentymistä.

1,52 ug hypoksialla indusoituvan tekijän -1 estäjän YC-1 (Lificiguat) injektio vasempaan lateraalikammioon 30 minuuttia ennen hypoksis-iskeemistä vauriota kumosi sevofluraanin aiheuttaman hermosuojan. Tämä havainto viittaa siihen, että sevofluraani voi tehokkaasti lievittää astroglioosia hippokampuksessa ja vähentää oppimis- ja muistihäiriöitä, jotka johtuvat gliaarpien muodostumisesta hypoksis-iskeemisen vaurion jälkeen.

Taustalla oleva mekanismi saattaa liittyä lisääntyneeseen DJ-1-ilmentymiseen, hypoksian aiheuttaman tekijän-1 vähentyneeseen ubikvitinaatioon ja vakiintuneeseen hypoksian aiheuttavan tekijän-1 ilmentymiseen. Tämän tutkimuksen hyväksyi Kiinan lääketieteellisen yliopiston Laboratory Animal Care Committee (hyväksyntänumero 2016PS337K) 9. marraskuuta 2016.

Avainsanat: aivovamma; aivot; keskushermosto; in vivo; vamma; malli; plastisuus; rotta; elpyminen; uudistaminen; korjausKiinan kirjaston luokitusnumero R453; R741; R614.2+1.

Johdanto

Vastasyntyneen hypoksis-iskeeminen enkefalopatia (HIE) on monien tekijöiden, kuten vastasyntyneen asfyksian, kohdunsisäisen ahdistuksen ja hyaliinikalvosairauden, aiheuttama yleinen komplikaatio vastasyntyneellä (Douglas-Escobar ja Weiss, 2015; Barkhuizen et al., 2017).

HIE on lapsikuolemien johtava syy ja neurologisten jälkitautojen ensisijainen lähde (Edwards et al., 2010; Descloux et al., 2015). 90 prosentilla HIE:stä selviytyneistä on pitkäaikaisia ​​neurologisia toimintahäiriöitä, kuten oppimis-, kognitiivisia ja motorisia toimintahäiriöitä ja epilepsiaa (Doi et al., 2012; Davies et al., 2019). Nykyinen HIE:n hoito keskittyy pääasiassa oireenmukaiseen hoitoon, mukaan lukien koneellinen ventilaatio, hypotension korjaaminen, glukoosin täydentäminen ja nesteen saannin rajoittaminen tarvittaessa.

Tarvitaan kuitenkin tehokas hoito, joka pystyy korjaamaan tai vähentämään pitkäaikaisia ​​aivovaurioita (Stankowski ja Gupta, 2011; Davidson et al., 2015). Keskeisenä osana oppimista ja tunnistamista aivoturso, mukaan lukien hammashammas (DG) , CA1- ja CA3-alueet, osallistuu perifeerisen tiedon muuntamiseen ja integroimiseen hermokeskuksiin (Morris et al., 2012; Jung et al., 2020).

Hippokampus on yliherkkä hypoksis-iskeemiselle (HI) vauriolle, joka voi aiheuttaa hippokampaalisen neuronien apoptoosia, stimuloida liiallista reaktiivista glioosia ja johtaa gliaarpien muodostumiseen (Hopkins ja Haaland, 2004; Wang et al., 2012). Astrosyyttien lisääntyminen on ratkaisevan tärkeää infarktikohdan sulkemisessa, hippokampuksen rakenteen uudistamisessa ja paikallisten immuunivasteiden ajallisen hallinnassa akuutin vaiheen aikana (Rolls et al., 2009).

Kuitenkin hypertrofia ja gliaarven muodostuminen myötävaikuttavat poikkeavaan neurogeneesiin, estävät dendriittisen selkärangan kasvua ja vaikeuttavat synapsin muotoa, mikä heikentää entisestään oppimis- ja tunnistustoimintoja (Yiuand He, 2006; Wanner et al., 2008; Burda ja Sofroniew, 2014; Pekny et al. , 2014; Shi et ai., 2017).

Gliafibrillaarinen hapan proteiini (GFAP) ja kondroitiinisulfaattiproteoglykaanit, kuten neurokaani, ovat patologisia astroglioosin ja gliaarpeutumisen markkereita, joiden ilmentymistä voivat säädellä korkeasti aktivoidut astrosyytit (Pekny ja Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 2016). Siten astroglioosin ja gliaarpeutumisen estäminen voi olla terapeuttinen kohde HIE:lle ja sen pitkäaikaisille neurologisille seurauksille.

Sevofluraanin käytön on osoitettu vähentävän HI-vaurioita jyrsijöillä. Tutkimukset, joissa selvitetään sevofluraanin jälkihoitohoidon (SPC) merkitystä HI-vaurion lievittämisessä säätelemällä hypoksian aiheuttamaa tekijää -1 (HIF-1) aikuisilla jyrsijöillä ja vastasyntyneillä rotilla, on tunnistettu useita mahdollisia mekanismeja (Wang et al., 2019b; Yanget). ai., 2019; Du et ai., 2020; Liu ja Gong, 2020).

Hypoksian avainfysiologisena sensorina HIF-1 on transkriptiotekijä, jossa sadat alavirran molekyylit osallistuvat iskeemisiin toleranssimekanismeihin, kuten verisuonten endoteelin kasvutekijä ja erytropoietiini (Na et al., 2015). Hypoksisen jälkikäsittelyn on todistettu vähentävän astrosyyttien ja mikroglioiden aktivaatiota HI:n jälkeen vastasyntyneiden rotan aivoissa (Teo et al., 2015).

Siksi oletimme, että HIF-1 voi osaltaan heikentää gliaarvien ja astroglioosin muodostumista. HIF-1 voi konstitutiivisesti esiintyä hermosoluissa, jolloin se lisää nopeasti ilmentymistä ja kerääntyy hypoksitiloissa. Kuitenkin, kun happi palaa normaaliksi, HIF1-ilmentymistä ei voida ylläpitää riittävän korkealla tasolla, jotta sillä olisi jatkuvasti hermostoa suojaava vaikutus johtuen hapesta riippuvaisesta prolyylihydroksylaasiproteiinien aiheuttamasta hajoamisesta ja sitä seuraavasta von Hippel-Lindau (VHL) -proteiinien aiheuttamasta ubikvitylaatiosta (Berra et al., 2003; Zhang et ai., 2018).

DJ-1 (koodaa Park7) on kuulemma hermoja suojaava proteiini, erityisesti oksidatiivisissa olosuhteissa (Aleyasin et al., 2007, 2010). VHL-proteiini on fyysisesti vuorovaikutuksessa DJ-1:n kanssa, mikä määritetään puolueettomalla massaspektrometrialla ja vahvistettu Parkinsonin taudin (PD) mallissa. Lisäksi Parsanejad ym. (2014) osoittivat, että DJ-1 inhiboi VHL-riippuvaista ubikvilaatiota ja stabiloi HIF-1-ilmentymistä.

Näin ollen oletimme, että sevofluraani stabiloi HIF-1-proteiinia hippokampuksessa säätelemällä DJ-1-tasoa ja inhiboi HIF-1-ubiquitylaation, mikä parantaa pitkän aikavälin oppimista ja muistin toimintaa.

Tutkiaksemme HIF-1:n roolia sevofluraanin ja astroglioosin välisessä suhteessa käytimme YC-1 (Lificiguat), HIF-1:n selektiivistä antagonistia, estämään täysin HIF-1-ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla. Tässä tutkimuksessa tutkimme HIF{5}a:n roolia SPC-käsiteltyjen vastasyntyneiden HIE-rottien hermosuojassa.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet
Eläintutkimukset tehtiin rotan kehityksen synaptisessa vaiheessa, joka alkaa syntymän jälkeisenä päivänä 7 (P7), mikä vastaa ihmislapsen kasvujaksoa myöhäisestä raskaudesta 3 vuoteen syntymän jälkeen (Jevtovic-Todorovic et al., 2003). Seitsemän päivän ikäiset Sprague-Dawley-rotat, jotka painoivat 12–16 g, valittiin 20:stä raskaana olevasta rotista (ostettu Shengjing Hospitalin laboratoriosta, Kiinan lääketieteellisestä yliopistosta, Kiinasta; uros/naaras-suhde, 1:1).

Kaikki rotat pääsivät vapaasti käsiksi veteen ja ruokaan, ja niitä pidettiin normaalissa kosteudessa ja lämpötilassa laboratoriossa 12-tunnin valo/pimeä (8.00/20.00) jaksoilla. Kaikki eläinkokeet suoritettiin National Institutes of Healthin (Bethesda, MD, USA) Laboratory Animals Care and Use of Laboratory Animals -ohjeiden mukaisesti.

Kiinan lääketieteellisen yliopiston laboratorioeläinten hoitokomitea hyväksyi virallisesti kuvatut kokeet (Shenyang, Kiina; hyväksyntänumero 2016PS337K) 9. marraskuuta 2016.

25 raskaana olevasta rotasta valittiin 249 P7-rottaa ja jaettiin satunnaisesti ryhmiin satunnaislukutaulukon perusteella (Wang etal., 2019a). Loppuanalyysimme sisälsi yhteensä 201 vastasyntynyttä; kuolleisuus HI-hoidon jälkeen oli 19 %.

Nämä 201 vastasyntynyttä rotta jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään: vale(n=54), HI (n=54), HI + sevofluraani (HIS) (n=54) ja HIS+ YC{{ 6}} (n=39) ryhmää. Kussakin ryhmässä 24 rottaa käytettiin Western blot -määritykseen, 5 immunohistokemiaan ja Golgi-värjäykseen ja 10 käyttäytymistestiin. Loput 45 vale-, HI- ja HIS-ryhmissä olevaa rottaa käytettiin käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktioon (RT- PCR).

Kokeellinen suunnittelu ja altistuminen anestesialle

Käytetty HIE-malli on kuvattu aiemmin (Zhao etal., 2007; Grandvuillemin et al., 2017). Peräaukon ja sukuelinten välisen etäisyyden perusteella postnataalisten rottien sukupuolen tunnistaminen saatiin päätökseen. HIE-mallin luomiseksi kunkin P7-rotan pää laitettiin läpinäkyvään muoviputkeen, joka suljettiin puuvillalla ennen kuin sevofluranewas vapautui (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019).

Jokaisen rotan vasen yhteinen kaulavaltimo sidottiin pysyvästi, ja kahden ligaation välissä valtimo leikattiin; jokainen leikkaus päättyi 5 minuutissa. Myöhemmin rotat heräsivät ilman anestesiaa ja laitettiin takaisin äitiensä häkkeihin 2 tunniksi. SPC:n antamista varten rotat laitettiin läpinäkyvään kammioon (Lingzhi Company, Hangzhou, Kiina), joka oli yhdistetty asevofluraanihöyrystimeen; yksi kanava auttoi ilmanvaihtoa, kun taas toinen kuljetti kaasunäytteen ulos kammiosta monitoriin.

Kammiota tuuletettiin 30 % 02:lla ja 70 % N2:lla 2 tunnin ajan valeryhmälle, kun taas 8 % 02:ta ja 92 % N2:ta annettiin 2 tunnin ajan HI-ryhmälle. SPC määritettiin välittömästi HI:n jälkeen: rotat hengittivät 2,4 % sevofluraania (1 alveolaarinen vähimmäispitoisuus) kammiossa, jonka ilmakehä oli 30 % 02 ja 70 % N2 ja ilmavirtaus 2 l/min 30 minuutin ajan. Lämmitysallas stabiloi lämpötilan kammion sisällä 37 asteeseen.

Lääkkeiden hallinto

Tasan 30 minuuttia ennen HI:tä 1,52 ug HIF-1-estäjää (YC1; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) injektoitiin vasempaan lateraalikammioon (Paxinos ja Franklin, 2013) käyttämällä 5-μLHamilton-ruisku (Yingweida Technology, Peking, Kiina). Kuten aiemmin on kuvattu, YC-1 liuotettiin keinotekoiseen aivo-selkäydinnesteeseen pitoisuudessa 0,304 ug/μL (Shen et al., 2012; Na et al., 2015).

Western blot -analyysi

P7-rotat nukutettiin 2-prosenttisella sevofluraanilla, ja aivotursokudokset uutettiin pennuista 12, 24 ja 48 tuntia ja 28 päivää leikkauksen jälkeen. Uuton jälkeen kudokset asetettiin välittömästi jäihin.

Supernatantin kokonaisproteiinit eristettiin lisäämällä radioimmunosaostusmääritysainetta (Beyotime, Haimen, Kiina). Proteiinipitoisuudet määritettiin One BCA Kit -sarjalla (Beyotime).

Seuraavaksi näytteet erotettiin 12,5 % natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvoille. Sen jälkeen, kun kalvoa oli estetty 5 % naudan seerumialbumiinilla (Sigma-Aldrich) 4 asteessa, kalvoa inkuboitiin sopivien primaaristen vasta-aineiden kanssa, mukaan lukien anti-glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH; 1:2000; Cat# 5174S; CellSignaling Technology , Danvers, MA, USA), anti-DJ-1 (1:1000;Cat# ab18257; Abcam, Cambridge, UK), anti-VHL (1:5000;polyklonaalinen; Cat# ab77262; Abcam), anti -HIF-1 (1:900;polyklonaalinen; Cat# ab2185; Abcam), antineurokaaninen (1:200;monoklonaalinen; Cat# sc-33663; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) , anti-postsynaptisen tiheyden proteiini 95 (PSD95; 1:1000;monoklonaalinen; luettelonro 3409S; Cell Signaling Technology), kasvua estävä proteiini 43 (GAP43; 1:2000; polyklonaalinen; Cat# 16971-1-AP; Proteintech Biotechnology , Chicago, IL, USA) ja anti-GFAP (1:5000, polyklonaalinen, luettelonumero ab53554; Abcam).

Myöhemmin blotteja inkuboitiin anti-kanin IgG:llä (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao, Peking, Kiina) oranti-hiiri-IgG:llä (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao) 2 tuntia huoneenlämmössä.

Proteiiniblotit visualisoitiin tehostetuilla kemiluminesenssin havaitsemisreagensseilla (SuperSignal West Pico; Pierce, Rockford, IL, USA). Proteiininauhat kvantifioitiin ImageJ-ohjelmistolla (National Institutes ofHealth). Western blot -analyysiä varten tiedot normalisoitiin GAPDH:hen.

Immunohistokemia

28 päivää leikkauksen jälkeen rotille annettiin nukutusainetta käyttäen edellä kuvattua menetelmää, perfusoitiin 4 % formaliinilla, ja niiden aivot poistettiin immunofluoresenssivärjäystä varten.

Aivot upotettiin 4-prosenttiseen paraformaldehydiin 4 asteessa 48 tunnin ajaksi, dehydratoitiin tämän jälkeen asteittaisessa etanolisarjassa ja lopuksi upotettiin parafiiniin. Seuraavaksi parafiiniin upotetut kudokset leikattiin 25- μm:n paksuisiksi leikkeiksi vibratomilla, ja tuloksena saadut osat säilytettiin huoneenlämmössä.

Jokainen aivoleikkeet leikattiin jatkuvasti, ja kolme epäjatkuvaa aivoleikkaa valittiin NeuN (neuronimerkki), GFAP (astrosyyttimarkkeri) ja neurocan (gliaarpimarkkeri) värjäystä varten. Kaksoisleimausta varten kudosleikkeitä inkuboitiin kahden sekalaisen primaarisen vasta-aineen kanssa, mukaan lukien vuohen anti-vasta-aineet. GFAP(1:250; polyklonaalinen; Cat# ab53554; Abcam), kanin antigeenit (1:100; Cat# 12943; Cell Signaling Technology) ja/tai hiiren antineurokaani (1:200; monoklonaalinen; Cat# sc{{ 10}};Santa Cruz Biotechnology) 4 asteessa yön yli kostutetussa kammiossa.

Tämän jälkeen leikkeet pestiin 0,1 M fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa asianmukaisten sekundaaristen vasta-aineiden kanssa, mukaan lukien anti-kanin IgG, joka oli konjugoitu Alexa Fluoriin-594 (1:200;Life). Technologies, Grand Island, NY, USA), anti-hiiri-IgG, joka on konjugoitu Alexa Fluoriin-594 (1:200; Life Technologies) ja anti-vuohen IgG, joka on konjugoitu fluoreseiini-isotiosyanaattiin (1:200; Life Technologies).

Soluytimien vastavärjäys toteutettiin 4',6-diamidino-2-fenyyli-indolilla (Beyotime) 5 minuutin ajan.

Olympus BX51 -mikroskooppia (OlympusCorporation, Tokio, Japani) käytettiin värjäytyneiden leikkeiden tarkkailuun. Vasemman hippokampuksen kolme näkökenttää valittiin satunnaisesti kustakin viipaleesta valokuvausta varten.ImageJ-ohjelmistoa käytettiin arvioimaan kvantitatiivista kolokalisaatiota ja siten laskemaan Mandersin päällekkäisyyskerroin.

For more information:1950477648nn@gmail.com