Aspergillus Favus -jojoba-endofyyttitaksolin syövänvastaisen toiminnan tehostaminen säteilytyksen välittämien kultananohiukkasten konjugaation avulla
May 30, 2023
Taxol vaihtoehtoiset kiinalaiset yrtit Cistanche
Avainsanat:Aspergillus favus · Jojoba · Endofyyttiset sienet · Kullan nanohiukkaset · Taksoli · - Säteilytys · Ravitsemuksen optimointi
Johdanto
Taxol on yksi kaupallisimmista laajakirjoisistasyöpälääkkeet[1]. Taksolin aktiivisuus kehittyy sen ainutlaatuisesta spesifisyydestä sitoutua solun tubuliini-alayksiköiden heterodimeeriin, mikä edistää tubuliinin polymeroitumista ja siten häiritsee kasvainsolujen mitoottista jakautumista [2]. Taksolilla oli voimakas vaikutus rinta-, keuhko-, pää- ja kaulasyöpään, kohdun syöpiin ja Kaposin sarkooman pitkälle edenneisiin muotoihin [3]. Taksolia valmistettiin ensin marjakuusien kuoresta Taxus brevifolia "family Taxaceae" [4, 5]; Taxolin tuotto on kuitenkin pienempi<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as astma,tulehdus, jasyöpä[32]. Siten tämän työn päätavoitteena oli tutkia uutta sieni-isolaattia jojobakasvista, jolla on ainutlaatuinen metabolinen stabiilisuus taksolin tuotannossa, arvioida erilaisia lähestymistapoja taksolinsaannon maksimoimiseksi sekä parantaa uutettujen taksoliyhdisteiden antiproliferatiivista aktiivisuutta. konjugoimalla kullan nanohiukkasten kanssa gammasäteilyn välittämänä.
Materiaali ja metodit
Endofyyttisten sienten eristäminen ja viljely
Jojoban (Simmondsia chinensis) eri osat lehtinä, kuorina, oksina ja silmuina kerättiin Kairon yliopiston maataloustieteellisestä tiedekunnasta ja käytettiin endofyyttisten sienten lähteenä. Kasvin osat kerättiin ja pestiin juoksevan vesijohtoveden alla, pinta steriloitiin 70-prosenttisella etanolilla 1 minuutin ajan ja huuhdeltiin sitten steriilillä vedellä [28]. Pinnalla steriloidut kasvin osat leikattiin pieniksi paloiksi steriileissä olosuhteissa ja asetettiin perunadekstroosiagar-alustaa (PDA), Czapek's-Doxia ja mallasuuteagar-elatusainetta sisältäville maljoille [33–36], ja levyjä inkuboitiin 30 asteessa. 10 päivää. Kasvinosien pintasteriloinnin tehokkuus arvioitiin sentrifugoimalla huuhteluvettä, sitten sakkaan lisättiin 500 ul steriiliä vettä ja maljattiin PDA-alustaan [37]. Puhdistetut endofyyttiset sieni-isolaatit siirrostettiin PDA-vintoihin 7 päivän ajan ja säilytettiin 4 asteessa.
Taksolin seulonta, uuttaminen ja kvantifiointi endofyyttisienistä
Talteen otetut jojobassa asuvat endofyyttiset sienet seulottiin taksolin tuotannon suhteen kasvattamalla perunadekstroosiliemellä (PDB) [38]. Yksi tulppa kustakin 7 päivää vanhasta sieni-isolaatista inokuloitiin 100 ml PDB/250 ml Erlenmeyer-tehtäviin, inkuboitiin 15 päivää 30 ± 1 asteessa ravisteluolosuhteissa (120 rpm). Inkuboinnin jälkeen viljelmät suodatettiin ja suodosta lisättiin 0,2 % natriumbikarbonaattia rasvahappojen saostamiseksi. Taksoli on uutettu dikloorimetaanilla ja orgaaninen faasi kerättiin ja haihdutettiin kuiviin, ja jäännökset liuotettiin uudelleen metanoliin [17, 39]. Taksoli erotettiin ja tunnistettiin TLC:llä käyttämällä Merck 1 mm:n (20 x 20 cm) esipäällystettyjä silikageelilevyjä (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, Saksa), havaittiin UV-valolla 254 nm:ssä [39]. Taxolin oletetut täplät kaavittiin pois TLC-silikageelilevyiltä ja liuotettiin metanoliin, vorteksoitiin voimakkaasti 10 minuuttia ja sentrifugoitiin nopeudella 1000 rpm 5 minuuttia. Saostuneet piidioksidihiukkaset poistettiin ja supernatantti otettiin Taxolin kvantifiointia ja puhtauden tarkistamista varten HPLC:llä (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quater nary Pump, Korea) C18-käänteisfaasikolonnissa (Eclipse Plus C18 4.6). × 150 mm, 3,5 μm, luettelonro 959 963–902). Käytetty liikkuva faasi oli metanoli/asetonitriili/vesi (25:35:40, v/v/v) virtausnopeudella 1,0 ml/min 20 minuutin ajan [40], ja taksolifraktiot mitattiin aallonpituudella 227 nm ja niiden pitoisuus. kemiallinen identiteetti ja pitoisuudet vahvistettiin retentioajasta ja absorptiohuipun pinta-alasta verrattuna autenttiseen näytteeseen.
Palautuneiden endofyyttisten sienten morfologinen ja molekyylinen tunnistus
Endofyyttiset sieni-isolaatit tunnistettiin lajitasoihinsa niiden makro- ja mikromorfologisten ominaisuuksien perusteella kasvattamalla PDA-, Czapek's-Dox- ja mallasuuteväliaineilla viitteen avainten mukaisesti [33–36]. Tehokkaimpien taksolia tuottavien sieni-isolaattien identiteetti vahvistettiin edelleen molekyylisesti sisäisen transkriptoidun välikappaleen (ITS) sekvenssin perusteella [41, 42]. Sienen genominen DNA (gDNA) uutettiin jauhamalla rihmasto (~0,2 g) nestetypessä ja annostelemalla sitten 1 ml CTAB-uuttopuskuria (2 % CTAB, 2 % PVP40, { {21}},2 % 2-merkaptoetanoli, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl 100 mM Tris-HCl:ssa, pH 8,0). PCR-alukesarjat olivat ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ ja ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. PCR-reaktio sisältää 10 ul 2×PCR-perusseosta (i-Taq™, luettelonro 25027), 2 ul gDNA:ta, 1 ul kutakin aluketta (10 pmol/ul) ja täydennetty 20 ul:aan steriilillä tislauksella. vettä. PCR ohjelmoitiin alkudenaturaatioon 94 asteessa 2 minuutiksi, denaturaatioon 94 asteessa 30 sekunniksi, pariutumiseen 55 asteeseen 10 sekunniksi, pidennykseen 72 asteeseen 30 s:ksi 35 sykliksi ja lopun pidentämiseen 72 asteessa 2 min. PCR-amplikonit analysoitiin 1,5-prosenttisella agaroosigeelillä 1 × TBE-puskurissa (Ambion Cat# AM9864), käyttäen 1 kb:n DNA-tikkaa (Kat. # PG010-55DI) ja visualisoitiin geelidokumentaatiojärjestelmällä. Amplikonit puhdistettiin ja sekvensoitiin Applied Biosystems Sequencerillä, HiSQV Bases, versio 6.0 samoilla alukesarjoilla. Saaduista sekvensseistä tehtiin BLAST-haku ei-redundantti NCBI-tietokannasta, tuotiin MEGA 6.0 -ohjelmistoon ja kohdistettiin Clustal W -lihasalgoritmin kanssa [43] ja fylogeneettinen puu rakennettiin MEGA 6.0:n naapuriliitosmenetelmällä [44].
Uutetun taksolin kemiallinen rakenne
Taxolin oletetut täplät raavittiin pois TLC-silikageelilevyiltä ja puhdistettiin, ja puhtaus ja pitoisuus määritettiin UV-Vis-analyyseillä aallonpituudella λ 227 nm (RIGOL, Ultra-3000 Series) verrattuna autenttiseen Taxoliin. [39]. Tyhjiä väliaineita samoissa olosuhteissa käytettiin negatiivisena lähtöviivana spektrofotometrisiin analyyseihin. Puhdistettujen Taxol-näytteiden FT-IR-spektri analysoitiin JASCO FT-IR 3600 -spektrofotometrillä. Taxol-näyte jauhettiin KBr-pelleteillä, puristettiin kiekoiksi tyhjiössä ja absorptio mitattiin alueella 400-4000 cm−1 [3] verrattuna autenttiseen näytteeseen. Uutetun taksolin kemiallinen rakenne varmistettiin HNMR-spektroskopialla (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) verrattuna autenttiseen taksoliin. Näytteet liuotettiin CDCl3:een, kemialliset siirtymät on annettu ppm:nä (8-asteikko) ja kytkentävakiot ilmaistaan hertseinä (Hz).
Erilaisten väliaineiden vaikutus taksolin tuotantoon
Kaksi agartulppaa (9 mm) kunkin sieni-isolaatin 7 päivän ikäisistä viljelmistä siirrostettiin kolmena rinnakkaisena 100 ml elatusainetta/250 ml Erlenmeyer-pulloon, jossa oli perunadekstroosia (PDB), Czapekʼs-Doxia (CZD), M1D:tä ja mallasuutetta (ME) ) liemimedia. Kaikista sieni-itiöistä vapaita siirrostamattomia kontrolleja käytettiin negatiivisena kontrollina, inkuboitiin 30 asteessa 15 päivää samoissa olosuhteissa. Inkuboinnin jälkeen sieniviljelmät suodatettiin ja taksoli uutettiin ja määritettiin edellä mainitulla tavalla.
Ravitsemusolosuhteiden bioprosessin optimointi taksolinsaannon maksimoimiseksi
Elatusaineen koostumuksen optimointi tehokkaan sieni-isolaatin taksolinsaannon maksimoimiseksi suoritettiin vastepinnan metodologialla käyttäen Placket-Burman-mallia, jota seurasi keskuskomposiittisuunnittelu [17–20, 45]. RSM-suunnitelmista positiiviset ja merkittävät muuttujat, jotka vaikuttavat tehokkaan sieni-isolaatin taksolin tuotantoon, arvioitiin käyttämällä Design-Expert 7.0:n (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA) tilastollista ohjelmistopakettia. Jokainen koe suoritettiin kolmessa biologisessa rinnakkaisnäytteessä ja keskiarvot otettiin huomioon. Halutuissa olosuhteissa inkuboinnin jälkeen sienibiomassa suodatettiin ja taksoli uutettiin ja kvantifioitiin TLC:llä ja HPLC:llä, kuten edellä on kuvattu.
Placket-Burman Design
Plaketti-Burman-mallia on usein käytetty elatusainekomponentin optimointiin sienten kasvua ja bioaktiivisten sekundaaristen metaboliittien tuotantoa varten, arvioitaessa taksolin tuotantoon vaikuttavia merkittäviä muuttujia [18, 2{6}}, 46]. Tekijän valinta perustui kvalitatiivisessa ja kvantitatiivisessa seulonnassa käytettyyn mediaan. Mukana on yksitoista tekijää; mallasuutetta, peptonia, sakkaroosia, soytonia, glutamiinia, naudanlihauutetta ja lämpötilaa, pH:ta, inkubaatioaikaa ja ravistelunopeusarvoja ja tekijöitä vaihdeltiin kahdella tasolla, ja valittiin minimi- ja enimmäistasoalueet. Tilastollista Design-Expert 7.0:aa käytettiin 12 kokeen sarjan luomiseen. Jokaisessa kokeessa taksolin tuotanto määritettiin kolmessa biologisessa rinnakkaisnäytteessä, ja taksolin saannon keskiarvo otettiin huomioon.
Tietojen regressioanalyysi suoritettiin tilastoohjelmistolla. Kunkin muuttujan vaikutus laskettiin (Biometrika, 2020) käyttämällä seuraavaa yhtälöä:
missä E on testausmuuttujan vaikutus, M plus ja M− ovat niiden kokeiden taksolipitoisuus, joissa parametri oli vastaavasti korkeammalla ja alemmalla tasolla, ja N on suoritettujen kokeiden lukumäärä. Kunkin muuttujan vaikutus tuotantoon määritettiin laskemalla niiden vastaavat E-arvot.
Missä Tot high on korkean tason vastausten kokonaismäärä, Tot low on matalan tason vastausten kokonaismäärä ja Ei on kokeiden lukumäärä.
Keskitetty yhdistelmäsuunnittelu ja taksolin tuotantoon vaikuttavien tekijöiden väliset vuorovaikutukset
Merkittävimmät positiiviset tekijät, jotka vaikuttavat valitun sieni-isolaatin taksolin tuotantoon, optimoitiin käyttämällä vastepintatyypin CCD-mallin kokeellista suunnittelua [47]. CCD:tä käyttämällä väliainekomponenttien pitoisuudet optimoitiin ja niiden tutkittuja vuorovaikutuksia käytettiin luomaan yhteensä 20 koetta kolmelle muuttujalle. Tehokkaan sieni-isolaatin taksolintuotannon muuttujien optimaalisten tasojen määrittämiseksi piirrettiin kolmiulotteiset (3D) vastepintakäyrät eri tekijöiden välisen vuorovaikutuksen tutkimiseksi ja kunkin taksolin tuotantoon vaikuttavan tekijän muuttuvan tilan määrittämiseksi. 3D-kaaviot suoritettiin pitämällä kolmen tekijän vakiot ihanteellisella tasolla ja piirtämällä saatu vaste Taxol-saannosta kahden muun tekijän vaihteleville tasoille.
Gammasäteilyn vaikutus taksolin saantoon
Taxolia tuottavat voimakkaat endofyyttiset isolaatit altistettiin -säteilytykselle 60koboltin lähteellä (gammasolu 4000-A-India) eri gammasäteilyannoksilla (0,25–3,0 kGy) verrattuna. säteilyttämättömän viljelmän hallintaan; annosnopeus 1,2 kGy/h kokeiden aikana. Optimoidut väliaineet ympättiin säteilytetyllä viljelmällä normaaleissa viljelyolosuhteissa verrattuna säteilyttämättömän itiön ymppiin kontrollina. Viljelmiä inkuboitiin 30 ± 2 asteessa 15 päivää pyörivässä ravistelijassa (120 rpm). Inkuboinnin jälkeen viljelmät suodatettiin ja taksoli uutettiin, puhdistettiin ja kvantifioitiin TLC:llä ja HPLC:llä edellä kuvatulla tavalla.
kultananohiukkasten (AuNP) synteesi ja karakterisointi; Konjugaatio Taxolin kanssa
Taxolin syövänvastainen aktiivisuus
Puhdistettujen Taxol- ja Taxol-PVP-AuNP-konjugaattien aktiivisuus maksakarsinoomaa (HPG2) ja rintasyöpää (MCF7) vastaan määritettiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol- 2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) -määritys [48]. 96-kuoppalevyyn ympättiin 103 solua per kuoppa, ja sitä inkuboitiin yön yli 37 asteessa, sitten lisättiin erilaisia pitoisuuksia lääkettä ja levyjä inkuboitiin uudelleen 48 tuntia. MTT-reagenssia (25 ul) lisättiin ja inkuboitiin 2 tuntia, ja kehittyneen formatsaanikompleksin violetti väri mitattiin aallonpituudella λ570 nm. IC50-arvo ilmaistiin lääkkeen määränä, joka vähensi kasvua 50 prosenttia alkuperäisestä positiiviseksi kontrolliksi normalisoituneiden kasvainsolujen lukumäärästä.
Taksolin ja Taxol-AuNP-konjugaattien antimikrobinen vaikutus
Taxol- ja Taxol-AuNPs-konjugaattien antimikrobinen aktiivisuus arvioitiin eri bakteeri-isolaatteja vastaan; Bacillus subtilis ATCC 6633 ja Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli ja Enterobacter agglomerans Candida albicansin lisäksi. Testatut bakteerisolut suspendoitiin steriiliin peptoniveteen, jolloin saatiin standardiympätys ~0,5 McFarland (1–1,5) × 1{{10}}8 CFU/ml λ6{{18 }}0 nm. Mikrobipatogeenien kasvun kasvun esto (mm) arvioitiin agar-kiekkodifuusiomenetelmällä. Positiivisina kontrolleina käytettiin steriilejä standardiantibioottikiekoja, joiden halkaisija oli 6,0 mm. Steriilit antibioottikiekot (6,0 mm) ladattiin 20 ul:lla metanolia ja amoksisilliini-klavulaanihappoa (AMC) negatiivisena ja positiivisena kontrollina. Levyille ladattiin sama pitoisuus Taxolia, Taxol-PVP-AuNP:itä ja AuNP:itä (1,0 ug/ml). Valmistettiin kolme biologista kopiota. Levyjä inkuboitiin 37 asteessa 24 tuntia, ja estoalueet mitattiin. Amoksisilliiniklavulaanihappoa (AMC) ja nystatiinia käytettiin normalisoimaan Taxolin antimikrobista aktiivisuutta. Kasvua estävä vyöhyke määritettiin vernier-satulalla (mm).
Tilastolliset analyysit
Fisherin vähiten merkitsevä ero post hoc -testissä.
Sienilaskeuma
Tulokset
Endofyyttisten sienten eristäminen jojobasta; Taxol-tuotannon seulonta
PDA-, CZD- ja ME-alustalle ladatun jojoban kuorista, oksista, lehdistä ja silmuista otettiin talteen 24 endofyyttistä sieni-isolaattia. Nämä sieni-isolaatit johdettiin kuorista (6 isolaattia), oksista (7 isolaattia), lehdistä (4 isolaattia) ja silmuista (7 isolaattia) taulukon 1 mukaisesti. Nämä sieni-isolaatit tunnistettiin alun perin lajitasonsa mukaan niiden morfologisen perusteella. ominaisuudet universaalien avainten mukaan, jotka kuuluvat kolmeen sukuun, nimittäin Aspergillus, Penicillium ja Fusarium. Näistä isolaateista Aspergillus-suvun ilmoitettiin esiintyvän (83,4 prosenttia), kun taas Fusarium- ja Penicillium-suvun esiintyvyys oli 8,3 prosenttia. Aspergillus-sukua edusti viisi lajia, nimittäin A. favus (3 isolaattia), Aspergillus oryzae (5 isolaattia), A. niger (5 isolaattia), A. fumigatus (4 isolaattia) ja A. terreus (3 isolaattia). Taksolin tuottavuus talteen otettujen sieni-isolaattien avulla arvioitiin kasvattamalla PDB:ssä, inkuboimalla standardiolosuhteissa, uuttamalla ja määrittämällä taksolin määrä TLC:llä ja HPLC:llä (kuvio 1). Tuloksista maksimitaksolin tuottavuuden raportoivat A. favus Bd1 (88,65 µg/l), jota seurasivat P. polonicum Br1 (54,42 µg/l), A. niger Lv1 (43,95 µg/l), A. oryzae Bd1. (38,87 µg/l), F. oxysporum Tw1 (26,80 µg/l), A. niger Lv2 (23.01 µg/l) ja A. fumigatus Bd2 (17,62 µg/l) l). Suurimpien sienituottajien taksolin rakenteellinen kemiallinen identiteetti paljastui niiden UV-Vis-spektreistä verrattuna autenttisen taksolin kemialliseen spektriin. Lisäksi neljästä tehokkaimmasta sieni-isolaatista uutetun taksolin kemiallinen rakenne on validoitu FT-IR-analyyseillä (kuvio 1). On huomattava, että voimakkaista sieni-isolaateista uutetulla taksolilla oli sama spektraalinen paradigma kuin autenttisella taksolilla. Piikki kohdassa 3393,3 cm-1 määritettiin hydroksyylille (OH). Huiput kohdassa 2923,5 määritettiin alifaattiselle CH-venytykselle, kun taas huiput kohdassa 1661.0 cm−1 vastaavat C=O-venytystaajuutta. Havaittu huippu 1452,0–1404,0 cm−1 johtui NH:n venytystaajuudesta. Karbonyyliryhmän ja hapen venytystaajuus havaittiin 1109 cm−1:ssä. Havaitut huiput välillä 1020–979,7 cm−1 johtuivat aromaattisten C- ja H-taivuuksien läsnäolosta. Kromatografisista ja spektraalisista analyyseistä voitiin päätellä, että uutettu taksoli on identtinen autenttisen taksolin kanssa. Ilmeisesti saman sienilajien metabolinen aktiivisuus vaihteli suuresti eri kasveilla, mikä varmisti ainutlaatuisen biologisen vuorovaikutuksen ja spesifisten signaalien vapautumisen kasvin osasta, mikä laukaisi taksolin biosynteesin koneistojärjestelmän ilmentymisen. Mielenkiintoista on, että aineenvaihduntajärjestelmän vaihtelu ei ole riippuvainen pelkästään kasvin osista vaan myös isolaatti-isolaatin vuorovaikutuksesta, esimerkiksi jojoban lehdissä asuvien A. niger -isolaattien taksolisaanto oli 43,9 µg/l, kun taas Taksoli oli nolla kasvin kuoresta talteen otetulle A. niger -isolaatille.
Voimakkaiden taksolintuottajien morfologinen ja molekyylinen tunnistus
Taxolia tuottavan voimakkaan sieni-isolaatin morfologiset piirteet tutkittiin makroskooppisten ja mikroskooppisten kuvaavien avainten mukaisesti, kuten on kuvattu kohdassa Materiaalit ja menetelmät, ja paljasti sen morfologisen läheisyyden A. favuksen kanssa (kuvio 2). Sieni-isolaattia kasvatettiin PDA:ssa 30 asteessa 10 päivää, ja makroskooppiset ja mikroskooppiset piirteet paljastivat sen identiteetin, kuten konidiaalisten päiden, haarautumistavan, leimautumisen ja konidiaalisen ontologian sekä hedelmäkappaleiden muodostumisen universaalin mukaan. morfologisia avaimia [33], ja niiden havaittiin olevan identtisiä Aspergillus favusin kanssa. Tehokas taksolia tuottava A. favus -isolaatti tunnistettiin edelleen niiden ITS-sekvenssien perusteella käyttämällä gDNA:ta templaattina. A. favuksen PCR-amplikonit (~ 550 bp) erotettiin, puhdistettiin ja sekvensoitiin (kuvio 2). A. favusin ITS-sekvenssistä tehtiin ei-redundantti räjähdyshaku NCBI-tietokannasta, ja se näytti 99 prosentin samankaltaisuutta A. favusin kanssa, nolla E.-arvoa ja 95 prosentin kyselykattavuus. Siten mikroskooppisten ja molekyylianalyysien perusteella kohde-isolaatti vahvistettiin A. favusiksi ja talletettiin GenBankiin talletusnumerolla MW485934.1, samoin kuin isolaatti on talletettu Assiut University Mycological Centeriin (AUMC), Egyptiin. talletusnumero AUMC13892. Nykyisellä isolaatilla oli 99 prosentin samankaltaisuus A. favus -isolaattien MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551 kanssa,
Kuva 1 Morfologinen näkymä jojobakasvista. B Voimakkaiden taksolia tuottavien endofyyttisten sienien maljaviljelmät; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) ja A. oryzae Bd (25) PDA:lla 8 päivän inkubaation jälkeen 30 asteessa. Sieni-isolaatteja kasvatettiin PDB:ssä ja inkuboitiin standardiolosuhteissa, ja taksoli uutettiin ja tarkistettiin TLC:llä (C). D Taxolin HPLC-kromatogrammi tehokkaista sieni-isolaateista. E Taksolin saanto määrättynä HPLC:llä. F, sieni-isolaateista uutetun taksolin UV-Vis-spektrianalyysi. Uutetun taksolin G FT-IR-analyysi verrattuna autenttiseen
Kuva 2 A. favusin makromorfologiset piirteet, jojoban endofyytti 3, 5 ja 8 päivän PDA:lla kasvamisen jälkeen. Mikromorfologiset piirteet, A. favusin konidiaalinen pää 400-kertaisella suurennuksella. A. favusin 500 bp:n ITS-alueen C PCR-amplikoni, normalisoituu 1 kb:n tikapuuksi (Cat.#. SM0312). D ITS A. favusin filogeneettinen analyysi suurimman todennäköisyyden menetelmällä [44]
