Beetaglukaani tehosti immuunivastetta Newcastlen tautirokotteelle ja muutti kanojen pernan MRNA-ilmentymistä

ABSTRAKTI

Tämä tutkimus suoritettiin hiivan soluseinästä saadun tuotteen b-glukaanin (G70) suun kautta antamisen vaikutuksen selvittämiseksi Newcastlen tautiviruksen (NDV) spesifiseen hemagglutinaation eston (HI) tiittereihin, lymfosyyttien proliferaatioon ja T-lymfosyyttialapopulaatioiden rooli elävällä NDV-rokotteella hoidetuissa kanoissa. Lisäksi b-glukaanin vaikutusta pernan geeniekspressioon tutkittiin transkriptomisekvensoinnilla. Tulokset paljastivat, että b-glukaanin lisäys nosti seerumin NDV HI -tiitteriä lisäsi lymfosyyttien NDV-stimulaatioindeksiä perifeerisessä veressä ja suolistossa ja edisti T-lymfosyyttien erilaistumista CD4+ T-soluiksi. RNA-sekvensointi (RNA-seq) -analyysi osoitti, että G70 säätelee ylöspäin G-proteiiniin kytkettyyn reseptoriin ja MHC-luokan I polypeptidiin liittyviä mRNA-ilmentymiä ja vähensi katelisidiiniin ja betadefensiiniin liittyviä mRNA-ilmentymiä. G70:n immunomodulatorinen vaikutus saattaa toimia mitogeenin aktivoiman proteiinikinaasin signalointireitin kautta. Yhteenvetona voidaan todeta, että G70 voisi tehostaa elävän NDV-rokotteen immunologista tehokkuutta kanoissa ja sitä voitaisiin käyttää mahdollisena adjuvanttiehdokkaana siipikarjateollisuudessa.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Avainsanat: Newcastlen tautirokote, beetaglukaani, adjuvantti, mustaluuinen kana, RNA-seq

JOHDANTO

Hiivan soluseinän polysakkaridit irtoavat suoraan Saccharomyces cerevisiaen soluseinästä, ja niitä käytetään laajasti kasvunedistäjinä, antimikrobisina aineina tai immunomodulaattoreina siipikarjassa tuotannon ja terveyden parantamiseksi (Schiavone et al., 2017; Hasted et al., 2021). Aikaisemmin PW220-nimisen tuotteen, joka sisältää hiivan soluseinämän polysakkarideja, osoitettiin voimistavan Newcastlen tautiviruksen (NDV) aiheuttamaa immuunivastetta ja muuttavan kanojen umpisuolen mikrobiyhteisöä suun kautta annettaessa (Bi et al., 2020). ). Hiivan soluseinän polysakkaridit koostuvat pääasiassa b-glukaanista ja mannaanioligosakkarideista (Wang et al., 2018). Tässä tutkimuksessa tutkittiin b-glukaanin vaikutusta immuunivasteeseen NDV-rokotteelle kanoilla. Perna on keskeinen elin immuunivasteen käynnistämiseksi. Äskettäinen tutkimus osoitti, että PW220, joka on hiivasolun seinämätuote, säätelee TGF-b:n, IL{10}}:n, TLR5:n, GATA-3:n ja T-betin mRNA:n ilmentymistä kanojen pernassa ( Bi et ai., 2022). Tarkka mekanismi on kuitenkin selvitettävä. RNA-sekvensointi (RNA-seq) on yksi korkean suorituskyvyn tekniikoista, joita voidaan soveltaa kvantitatiivisen geeniekspression määrittämiseen ja eri ekspressioprofiilien analysointiin koko transkriptomin tasolla (Zhao et al., 2018). Korkean herkkyyden ja alhaisten kustannusten etujen ansiosta RNA-seq:ää on käytetty laajalti kotieläin- ja siipikarjatutkimuksissa (Teixeira et al., 2019; Yuan et al., 2020). Siten tässä tutkimuksessa arvioitiin b-glukaanin antamisen vaikutus NDV-spesifiseen hemagglutinaation eston (HI) tiittereihin, lymfosyyttien proliferaatioon ja T-lymfosyyttialapopulaatioihin kanoissa, jotka oli rokotettu suun kautta NDV-rokotteella. Lisäksi transkriptianalyysiä käytettiin arvioimaan b-glukaanin vaikutusta geeniekspressioon ja taustalla oleviin signaalinsiirtoreitteihin kanojen pernassa.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Eläimet

Päivän ikäisiä kaupallisia mustaluukanoja (uros) hankittiin Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd.:ltä (Anshun, Kiina). Kanat jaettiin lankahäkkeihin, jotka mahdollistivat vapaan pääsyn rehuun ja veteen. Ensimmäisen 7 vuorokauden aikana huoneen lämpötila pidettiin 33 - 35 celsiusasteessa, minkä jälkeen se laskettiin vähitellen 1 asteella joka 2 vuorokausi 27 celsiusasteeseen asti. Kaikki kanat prosessoitiin Southwest University Animal Caren ja -järjestön asettamien standardien mukaisesti. Käytä toimikuntaa (eettisen todistuksen numero: IAC-2021-0057). Kaikki koelinnut lopetettiin CO2:lla tutkimuksen lopussa.

cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

Rokote

Elävän NDV-rokotteen (La Sota -kanta) toimitti Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Qingdao, Kiina).

Reagenssit 

Hiivasolun seinämätuote (YP) G70 saatiin hiivasolun (Saccharomyces cerevisiae) seinämästä, joka sisältää b-glukaania (suurempi tai yhtä suuri kuin 70 %) (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Yichang, Kiina). Sekä antigeeni- että positiiviset kontrolliseerumit NDV-spesifisten HI-tiitterien mittaamiseksi ostettiin Qingdao Regen Diagnostics Development Centeristä (Qingdao, Kiina). Anti-kana CD3-APC (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) ja CD8- PE (L{{14) }}TH49T) rotilla tarjosi Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Kiina).

Kokeellinen suunnittelu

Neljäkymmentäkahdeksan 5 päivän ikäistä mustaluuista kanaa jaettiin satunnaisesti 3 ryhmään (taulukko 1), ja niille annettiin joko perusruokavalio (taulukko 2) tai perusruokavalio, jossa oli 0,1 % G7{{10}. } (b-glukaani, 0,7 g/kg) lisäravinteena tämän tutkimuksen ajaksi. Ryhmä H (G70 +-rokote) ja C (rokote) immunisoitiin suun kautta NDV-rokotteella 14. ja 28. päivänä, vastaavasti. Ryhmä S (Sailne) käsiteltiin yhtä suurella tilavuudella suolaliuosta. Verinäytteet kerättiin siipilaskimopunktiolla 5, 7, 14, 21, 28, 35 ja 42 päivän iässä HI-tiitterin testaamiseksi. Seitsemän päivää tehosterokotuksen jälkeen 8 kanaa kustakin kolonnista poimittiin satunnaisesti ja tapettiin tukehduttamalla CO2:ta käyttäen. Lymfosyytit erotettiin sekä ääreisverestä että jejunumista lymfosyyttien proliferaatio- ja virtaussytometria-analyysin suorittamiseksi. Jejunaalnäytteenoton tapauksessa pohjukaissuolen ripustusside oli jejunumin aloituskohta ja 5 cm pitkä leike otettiin tyhjäsuolen alkupisteestä. Perna jäädytettiin nopeasti nestetypessä ja säilytettiin sitten -80 asteessa RT-qPCR:ää ja sekvenssiprofilointia varten.

Taulukko 1. Kokeellinen suunnittelu

Taulukko 2. 1 Broilerien kokeellisten perusravintojen koostumus ja ravintosisältö.

HI-tutkimus

NDV-spesifisten HI-tiitterien määritys seerumissa suoritettiin edellisen kuvauksen mukaisesti (Ball et al., 2019). Lyhyesti sanottuna seerumi laimennettiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) 1:2:sta 1:1 024:ään V-pohjaisella 96-kuoppamikrotiitterilevyllä. Sitten lisättiin 25 ml NDV-laimennusta kuoppaa kohti ja inkuboitiin 37 asteessa 30 minuuttia. Sen jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 25 ml 1-prosenttista kukon erytrosyyttisuspensiota ja inkuboitiin 37 asteessa 30 minuuttia. Kaikki näytteet testattiin kahdesti ja sekä positiiviset että negatiiviset kontrollit sisällytettiin kullekin levylle. HI-tiitterit perustuivat suurimpaan laimennukseen, joka johti hemagglutinaation täydelliseen estoon. Keskimääräinen HI-tiitteri ja standardivirhe (SE) mitattiin ryhmää kohden.

Lymfosyyttien eristäminen ääreisverestä

Lymfosyytit eristettiin ja kerättiin perifeerisen veren lymfosyyteistä käyttämällä Lymphocyte Separation Medium Kit -sarjaa (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Tianjin, Kiina). Sitten lymfosyytit säilytettiin suspensiossa RPMI 1640 -elatusaineella (Solarbio, Peking, Kiina), joka sisälsi 5 % vasikan sikiön seerumia ja 25 mM HEPES:ää (pH 7,0).

Lymfosyyttien eristäminen jejunumista

Toimeksiantoprosessi suoritettiin edellisen kuvauksen mukaisesti ja pienin muutoksin (Yuan et al., 2020). Lyhyesti sanottuna, käytä 70 mm:n solusuodatinta jakaaksesi suolisto 4 ml:aan kylmää PBS:ää. Sen jälkeen näytesolujen suspensiota sentrifugoitiin nopeudella 4 500 rpm 12 minuuttia poistamalla supernatantti. Suspendoi sitten suolistosolut uudelleen täyteen elatusaineeseen (Solarbio Co., Beijing, Kiina), joka koostuu 5 %:sta naudan sikiön seerumia (FBS) RPMI 1640:ssa (Sijiqing Co., Hangzhou, Kiina). Lopulta kanan lymfosyyttien eristyssarja (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) lymfosyyttien erottamiseksi. suolistokudos jaettiin 4 ml:aan kylmää PBS:ää käyttämällä 70 mm:n solusuodatinta. Seuraavaksi näytesolujen suspensiota sentrifugoitiin nopeudella 4 500 rpm 12 minuuttia ja supernatantti heitettiin pois. Sen jälkeen suolistosolut suspendoitiin uudelleen RPMI 1640:een (Solarbio Co.), joka sisälsi 5 % FBS:ää (Sijiqing Co.). Lopuksi lymfosyytit erotettiin käyttämällä kanan lymfosyyttien eristyspakkausta (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.).

Lymfosyyttien lisääntyminen 

Solut kylvettiin 96-kuoppalevyille (5 £105 per kuoppa), joita stimuloitiin inaktivoidun NDV:n antigeenillä 4 hemagglutinaatioyksikköä tai yhtä suurella tilavuudella suolaliuosta. Jokainen näyte testattiin 3 rinnakkaisena. Soluja ja antigeeniä inkuboitiin 44 tuntia 37 asteessa 5 % C02:ssa ja sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 ml metyylitiatsolyylitetratsoliumia (MTT) (2 mg/ml) ja inkuboitiin vielä 4 tuntia. Näytteitä sentrifugoitiin 1 200 £ g:ssä 8 minuuttia sisälämpötilassa. Sen jälkeen supernatantti poistettiin varovasti ja kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 ml DMSO:ta. Levyjä ravisteltiin 8 minuuttia kiteiden täydelliseksi liukenemiseksi. Lopuksi keskimääräinen optinen tiheys (OD) rekisteröitiin 570 nm:ssä. Stimulaatioindeksi (SI) saatiin käyttämällä yhtälöä: stimuloitujen kuoppien OD-arvot/stimuloimattomien kuoppien OD-arvot (Cui et al., 2020).

cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

T-lymfosyyttialapopulaatioiden virtaussytometrinen analyysi

Lymfoidisolususpensiot eristettiin ja pestiin kahdesti PBS:llä. Solukonsentraatio muutettiin arvoon 106 ug/ml ja pidettiin sitten jäillä. Jokainen näyte värjättiin 2 ml:lla rotan anti-kana CD3-APC, CD4- FITC ja rotan anti-kana CD8-PE valonpitävissä olosuhteissa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen 2 pesulla PBS:llä. Solut analysoitiin virtaussytometria-analyysillä Flow-sytometrillä (BD Bioscience, San Jose, CA).

RT-qPCR-analyysi

Kokonais-RNA johdettiin pernasta käyttämällä TRIzol-reagenssia (Takara, Shiga, Japani) valmistajan ohjeiden mukaisesti ja muutettiin sitten cDNA:ksi käyttämällä PrimeScript RT Master Mixiä (Takara, Dalian, Kiina) T100-lämpösyklilaitteella (Bio-Rad, Hercules, CA). Kanan beeta-aktiinia käytettiin sisäisenä kontrolligeeninä. Valittujen geenien RT-qPCR suoritettiin Multiple Real-Time PCR Systemillä (AB, Carlsbad, CA) SYBR Premix Ex Taq II:lla (Tli RNaseH Plus) (Takara). Suhteellinen kvantitatiivinen menetelmä (244CT) suoritettiin kvantitatiivisen vaihtelun arvioimiseksi (Bi et al., 2022). Alukesekvenssit on lueteltu taulukossa 3.

RNA:n uuttaminen

Kutakin kolmesta ryhmän H (G70 +rokote) ja ryhmän C (rokote) pernanäytteestä käytettiin RNA-sekvenssiin TRIzol-reagenssilla (Takara). Sen jälkeen RNA testattiin kontaminaatio ja hajoaminen 1 % agaroosigeelillä ja RNA:n puhtaus analysoitiin käyttäen NanoPhotometer spektrofotometriä (IMPLEN, Westlake Village, CA). RNA:n pitoisuus määritettiin käyttämällä Qubit RNA Assay Kitiä Qubit 2:ssa.0 Fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, CA). RNA:n eheys mitattiin käyttämällä Bioanalyzer 2100 -järjestelmän RNA Nano 6000 -määrityssarjaa (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Tulokset osoittivat, että RNA oli täydellinen ja ilman DNA-kontaminaatiota.

Transkriptioanalyysi

Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Peking, Kiina) tarjosi transkriptomisekvensoinnin, sekvenssien kokoamisen ja data-analyysin. Transkriptomin päämenettelyt lueteltiin seuraavasti: 1) mRNA:n puhdistus kokonais-RNA:sta suoritettiin käyttämällä poly-T-oligo-kiinnittyneitä magneettihelmiä. Fragmentointi suoritettiin kaksiarvoisilla kationeilla NEB Next First Strand Synthesis Reaction -puskurissa (5X) korkeassa lämpötilassa. 2) Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttämällä satunnaista heksameerialuketta ja Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV) Reverse-muotoa. Toisen juosteen cDNA-synteesi syntetisoitiin sitten käyttämällä DNA-polymeraasi I:tä ja RNaasi H:ta. 3) Jäljelle jääneet ulkonevat osat muutettiin tylpäiksi päiksi eksonukleaasi/polymeraasiaktiivisuuksien kautta. Hiusneulasilmukkarakenne NEB Next Adapter ligoitiin sitten hybridisaatioon valmistautumiseksi DNA-fragmenttien 3'-pään adenylaation jälkeen. 4) Saatiin noin 25{33}} - 300 bp cDNA-fragmentteja ja kirjasto puhdistettiin käyttämällä Beckman Coulterin AMPure XP -järjestelmää (Beckman Coulter, Beverly, MA). Sitten 3 ml NEBU SER -entsyymiä (Thermo Fisher, Hillsboro, OR) levitettiin kokovalitun, adapterilla ligoidun cDNA:n kanssa 37 °C:ssa 15 minuutin ajan ja sen jälkeen 5 minuuttia 95 °C:ssa. PCR-monistus suoritettiin Phusion High-Fidelity DNA -polymeraasilla. Lopulta PCR-tuotteet puhdistettiin (AMPure XP -järjestelmä) ja kirjaston laatu arvioitiin Agilent Bioanalyzer 2100 -järjestelmällä. Indeksikoodattujen näytteiden klusterointi suoritettiin TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS:llä (Illumina, San Diego, CA). Sitten sekvensointi suoritettiin Illumina Novaseq -alustalla ja luotiin 150 bp:n paritetun pään lukuja. Viitegenomi ja geenimallin merkintätiedostot ladattiin genomisivustolta (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ ja ftp://ftp. ensembl.org/pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). Vertailugenomin indeksi määritettiin käyttämällä HISAT2:ta (v2.0.5) ja paripään puhtaat lukemat kohdistettiin referenssigenomiin. Kullekin geenille kartoitettujen lukujen määrä ja kunkin geenin fragmentit kiloemästä kohden (FPKM) geenin pituuden perusteella ja geeniin kartoitettujen lukujen määrä laskettiin käyttämällä Feature Counts v1.5:tä.{38} }p3. Erilainen ekspressio ryhmän H (G70 + rokote) ja ryhmän C (rokote) välillä johdettiin käyttämällä DESeq2 R -pakettia (1.16.1). Geenit, joiden P < 0,05 ja |log2 (kertamuutos)| > 1 määriteltiin differentiaalisiksi ilmentymisgeeneiksi (DEG).

Taulukko 3. Alukkeiden sekvenssit RT-qPCR:lle.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-validointi 

Kaksi ylöspäin säädeltyä DEG:tä ja 4 alhaalla säädeltyä DEG:tä vertailussa ryhmää H (G70 + Rokote) vs. ryhmään C (rokote) valittiin transkriptomisekvensointitulosten vahvistamiseksi RT-qPCR:llä. RNA muutettiin cDNA:ksi käyttämällä PrimeScript RT Master Mixiä (Takara) T100-lämpösyklilaitteella (Bio-Rad). Alukesekvenssit on lueteltu taulukossa 3. Kanan b-aktiinia käytettiin sisäisenä kontrolligeeninä. Valittujen geenien RT-qPCR suoritettiin Multiple real-time PCR Systemillä (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) SYBR Premix Ex Taq II:lla (Tli RNaseH Plus) (Takara). Suhteellista kvantitatiivista menetelmää (244CT) sovellettiin kvantifioinnin vaihtelun arvioimiseen. Kaikki näytteet otettiin kolmena kappaleena analyysiä varten.

Tilastollinen analyysi

Yksisuuntaista ANOVAa ja Duncanin post hoc -testiä käytettiin useisiin ryhmien välisiin vertailuihin käyttämällä SPSS-ohjelmistoa (versio 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona § SE. P < 0,05 arvoa pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.

TULOKSET b-glukaanin vaikutus seerumin vasta-ainetiittereihin

Kuten kuvassa 1 esitetään, NDV-spesifiset HI-tiitterit laskivat kaikissa ryhmissä ennen rokotusta ja nousivat H- (G70+rokote)- ja C- (rokote)-ryhmissä immunisaation jälkeen. Mielenkiintoista on, että korkeammat HI-tiitterit havaittiin ryhmässä H (G70+rokote) 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{ 14}}5), 35 (P > 0,05) ja 42 (P > 0,05) d iässä kuin ryhmässä C (rokote).

b-glukaanin vaikutus lymfosyyttien lisääntymiseen

G70:n vaikutus perifeerisen veren lymfosyyttien lisääntymiseen on kuvattu kuviossa 2A. Veren lymfosyyttien SI-arvo parani linnuilla, joita oli täydennetty G70-rokotteella (G70 +-rokote) 7 vuorokauden tehosteimmunisaatiossa (P < 0,05) verrattuna rokoteryhmään. Lisäksi SI jejunaallymfosyyteissä lisääntyi merkitsevästi 7 päivää (P < 0,05) tehosteimmunisaation jälkeen verrattuna rokoteryhmään (kuvio 2B).

b-glukaanin vaikutus CD4 +/CD8 + T-solujen suhteeseen perifeerisessä veressä 

Kuvat 3A ja 3B osoittavat lymfosyyttien ja CD3 +-solujen portituksen ja kuviot 3C - 3E osoittavat CD4 + /CD8 + T-solujen suhteen G70-soluissa, rokote- ja suolaliuosryhmät, vastaavasti. Kuten kuvasta 3F näkyy, rokoteryhmän ja suolaliuosryhmän välillä ei ollut merkittävää eroa tehosteimmunisaation jälkeen (P > 0.05), kun taas CD4 + /CD{{12} } T-solut olivat selvästi korkeammat G70-ryhmässä (G70 + Rokote) kuin rokoteryhmässä (P < 0,05).

Kuvio 1. B-glukaanin oraalisen antamisen vaikutus NDV-rokotteen seerumin vasta-ainetiittereihin. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona § SE.

Related Gene Expression

Kuten kuvasta 4 näkyy, TGF-b:n (P < 0.05), IL-6 (P < 0) ​​mRNA:n ilmentyminen lisääntyi merkittävästi.{13} }5) ja TLR5 (P < 0.05) havaittiin G70:llä (G70 + rokote) käsiteltyjen kanojen pernasta verrattuna rokoteryhmään. IFN-g:n (P > 0,05), TLR4:n (P > 0,05) ja TLR3:n (P > 0,05) mRNA:n ilmentymisessä pernassa ei havaittu merkittävää eroa G70:n (G70 + Rokote) ja Rokotteen välillä. ryhmiä.

RNA-sekvensointitietojen analyysi 

RNA:n sekvensointi 8 pernakirjastosta tuotti 24,1 G raakadataa, kuten on esitetty lisämateriaalin taulukossa S1. CN tarkoittaa ryhmärokotetta ja HN tarkoittaa ryhmän G70 + rokotetta. Kirjasto C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 ja H4, vastaavasti, koostuu 45,591,492, 47,424,782, 46,193,492, 54,403,376, 47,118,476, 47,118,476, 47,118,476, 47,118,476, 47,118,476, 47,118,476, 47,118,476, 45,8,4,5,4,8 438 alkuperäistä lukukertaa. Aptameerin jälkeen epäselvät sekvenssit ja huonolaatuiset sekvenssit poistettiin, jolloin jäljelle jäi 44 050 198, 45 449 884, 44 261 112, 52 097 846, 45 542 404, 44 566 290, 34 566 290, 34, 290, 64, 211 ja 44, 40, 210. Yli 96 % puhtaista lukemista kuului alkuperäisiin lukuihin, ja 8 kirjastoa sovitettiin käyttämällä HISAT2:ta lukujen sekvensoimiseksi vertailutietokantaa vastaan, joka koostuu Gallus-genomista. Lisäksi puhtaat lukemat kartoitettiin tähän tietokantaan yli 95 prosentissa tapauksista. Erityiset kirjastoille C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 ja H4 olivat 40 921 384 (92,9 %), 41 302 100 (90,87 %), 40 771 075 (92,11 %), 46 771 075 (92,11 %), 46, 4, 4, 4, 4, 4, 2, 4, 4, 4, 4, 0, 4, 0, 4, 0, 4, 0, 4, 0, 4, 0, 4, 4, 0, 4, 5 2 %), 40 213 444 (90,23 %), 40 922 895 (92,77 %) ja 40 971 972 (93,06 %) lukua määritettiin yksilöllisesti viitetietokantaan.

Erilaisesti ilmentyvät geenit

Kuten kuviossa 5A on osoitettu, tunnistettiin yhteensä 198 eri tavalla ilmentynyttä geeniä, mukaan lukien 47 ylös- ja 151 alas-säädeltyä geeniä. DEG:t on kuvattu yksityiskohtaisesti lisämateriaalitaulukossa S2. Kuvio 5B osoittaa, että DEG:illä on hyvä hoitojen toistettavuus.

Geeniontologian luokituksen ja Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Enrichmentin analyysi

Geenit, jotka ovat eri tavalla ilmentyneitä geenejä, luokiteltiin kolmeen toiminnalliseen pääluokkaan Gene Ontologyn (GO) luokittelujärjestelmän perusteella: biologinen prosessi, solukomponentti ja molekyylifunktio. 10 suosituinta GO-termiä kolmessa kategoriassa on esitetty kuvassa 6. Valtaosa geeneistä, jotka osallistuivat "vasteeseen humoraaliseen immuunijärjestelmään", "kemokiinivasteeseen", "vasteeseen antimikrobiseen humoraaliseen", "puolustusvasteeseen bakteeria vastaan, " "Immuunivaste antimikrobiselle huumorille, jota välittävät antimikrobiset peptidit", "puolustusvaste gramnegatiivista bakteeria vastaan" ja "puolustusvaste grampositiivista bakteeria vastaan" biologisten prosessien luokassa. Lisäksi molekyylifunktion kategoriassa geenien huomattava suhde liittyi "CC-motiivin kemokiinireseptorin (CCR) kemokiinireseptorin sitoutumiseen", "kemokiinireseptorin sitoutumiseen" ja "lipopolysakkaridin sitoutumiseen". Lisäksi "mitokondrioiden hengitysketjukompleksi I", "NADH-dehydrogenaasikompleksi" ja "hengitysketju" olivat solukomponenttien luokan hallitsevimpia rikastettuja termejä. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes -polkuanalyysi suoritettiin myös differentiaalisesti ilmennetyille geeneille. Tulokset viittaavat siihen, että geenit ryhmiteltiin pääasiassa 7 reittiin, mukaan lukien "Neuroaktiivinen ligandi-reseptorivuorovaikutus", "Aukoliitos", "mitogeenin aktivoima proteiinikinaasi (MAPK) signaalireitti", "ABC-kuljettajat", "aminohappojen biosynteesi" "Lääkeaineenvaihdunta" ja "Proteiinin vienti".

Kuvio 2. B-glukaanin oraalisen annon vaikutus lymfosyyttejä stimuloivaan indeksiin (SI). (A) ääreisveren lymfosyytit; (B) suolen lymfosyytit. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona § SE.

Kuva 3. B-glukaanin oraalisen annon vaikutus perifeerisen veren CD4+/CD8+-solusuhteeseen. (A) lymfosyyttien portti; (B) portti CD3+ T-soluissa; (C) CD3+ CD4 + CD8 + T-solujen taajuudet G70+rokoteryhmässä; (D) CD3+ CD4 + CD8 + T-solujen taajuudet rokoteryhmässä; (E) CD3+ CD4 + CD8 + T-solujen taajuudet suolaliuosryhmässä; (F) viivakaavio, joka edustaa CD4+/CD8+-suhdetta. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona § SE.

Kuvio 4. B-glukaanin oraalisen antamisen vaikutus mRNA:n ilmentymiseen kanan pernassa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona § SE.

Kuva 5. Yhteenveto RNA-Seq-tiedoista. (A) Luettelo differentiaalisesti ilmennetyistä geeneistä, (B) DEG:ien klusterikartta.

RT-qPCR:llä erilailla ilmennettyjen geenien todentaminen

6 DEG:tä, joita säädeltiin ylös- tai alaspäin, vahvistettiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR:llä. Tulos viittasi siihen, että RT-qPCR-tiedot olivat yleisesti ottaen RNA-seq-tietojen mukaisia, mikä osoitti luotettavaa sekvensointitulosta (kuvio 7). MAPK-polkuun liittyvien geenien mRNA:n ilmentyminen Kuten kuvasta 8 näkyy, FAS:n (P < 0.05) ja CACNA2:n (P < 0.05) mRNA-ilmentyminen väheni merkittävästi. havaittu G70-ryhmän kanojen pernasta (G70 + Rokote) verrattuna rokoteryhmään. Lisäksi G70-ryhmässä (G70 + Rokote) havaittiin numeerisesti lisääntynyt DUSP5:n ​​ja DUSP4:n mRNA-ilmentyminen ja p38:n, JNK:n ja ERK:n numeerisesti vähentynyt mRNA-ilmentyminen verrattuna rokoteryhmään (P > 0,05). .

KESKUSTELU

Elävää ND-rokotetta rokotetaan laajalti kanatiloilla, ja silti Newcastlen taudin taudinpurkauksia esiintyy edelleen satunnaisesti immunisoiduissa siipikarjaparvissa (Zhang et al., 2022). Optimaaliset rokotteet on määritelty stimuloimaan solujen ja limakalvojen immuniteettia sekä tehokasta humoraalista immuniteettia (Shan et al., 2019). Siksi yhä enemmän huomiota kiinnitettiin adjuvantteihin, jotka voisivat saada aikaan limakalvojen sekä solujen immuunivasteita (Chen et al., 2014; Yu et al., 2015). Injektioreittiin verrattuna suun kautta antaminen on helpompi lähestymistapa, joka vähentää kustannuksia ja aiheuttaa vähemmän stressiä broilereille (Boyaka et al., 2003; Zhang et al., 2008). Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että b-glukaanilla täydennetty ruokavalio nosti huomattavasti NDV-spesifisten HI-tiitterien tasoa kanojen seerumissa, mikä on yhdenmukaista aikaisempien raporttien kanssa (Horst et al., 2019). NDV-spesifinen vasta-aine on välttämätön humoraalisen immuunivasteen kehittymiselle kanojen suojaamiseksi NDV-infektiolta (Martinez et al., 2018; Li et al., 2020). B-lymfosyytit tuottavat vasta-aineita ja T-lymfosyytit laajenevat vasteena mitogeenille (Bohacova et al., 2021). Tässä tutkimuksessa kanan ääreisveren lymfosyyttien stimulaatioindeksi G70-ryhmän NDV:hen oli selvästi korkeampi kuin rokoteryhmän, mikä osoittaa, että enemmän T-lymfosyyttejä aktivoitui. T-lymfosyyttien hallitsevat alapopulaatiot ovat CD4 + ja CD8 + T-solut (Cui et al., 2020). CD4 + T-solut tuottavat pääasiassa sytokiinejä ja edistävät B-solujen kypsymistä, kun taas CD8 + T-solut liittyvät kohdesolujen tappamiseen (Zhang et al., 2021b). Tässä tutkimuksessa G70-ryhmässä havaittujen CD4 +/CD8 + T-solujen suhde oli selvästi nousussa, mikä viittaa siihen, että G70 voisi aktivoida enemmän CD4 + T-soluja perifeerisestä verestä. Lisäksi havaitsimme merkittävästi korkeamman suolen lymfosyyttistimulaatioindeksin G70-ryhmässä kuin rokoteryhmässä, mikä vahvisti, että b-glukaani voi myös stimuloida suoliston lymfosyyttejä. Aiemmat kokeemme vahvistivat, että hiivan soluseinäuute PW220 lisäsi merkittävästi suolistospesifisiä sIgA- ja IgA + -soluja (Bi et al., 2020). Toisin sanoen sekä b-glukaani G70 että PW220 ovat tehokkaita edistämään suolen limakalvon immuniteettia.

cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

Aiemmin on raportoitu eläinten parantuneen immuniteetin antamisesta b-glukaania. Guo et ai. (2003) vahvistivat, että b-glukaanin antaminen paransi bursa- ja NDV-spesifisten vasta-aineiden indeksiä kanoissa. Levine et ai. (2018) ehdottivat, että b-glukaanin lisäys voi nostaa suoliston MHC Ⅱ -tasoa ja lisätä CD45 +-solujen määrää suoliston vaurioiden lievittämiseksi.

Li et ai. (2005) paljasti, että ravinnon b-glukaani voi nostaa IL-8:n ja TGF-b:n mRNA:n ilmentymistasoja sikojen suolistossa. B-glukaanin immunomodulatorisen vaikutuksen mekanismi ei ole selvä. Kim et ai. (2010) osoittivat, että b-glukaani edisti dendriittisolujen kypsymistä lisäämällä CD40:n, CD80:n ja CD:n ilmentymistä86. Lisäksi Lee ja Kim (2014) ja Su et al. (2020) raportoivat, että b-glukaani aktivoi hahmontunnistusreseptoreja, kuten dektiini-1-reseptorin, Toll-like reseptorin ja CR3:n (Baert et al., 2015). Perna on kriittinen elin immuunivasteen käynnistämisessä ja sillä on keskeinen rooli sekä synnynnäisessä että hankitussa immuniteetissa (Bronte ja Pittet, 2013). On kuitenkin olemassa vain vähän tutkimusta, joka perustuu RNA-seq-analyysiin mRNA:n ilmentymisestä pernassa oraalisen hiivapolysakkaridien antamisen jälkeen. Tässä tutkimuksessa Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes -polkuanalyysi ehdotti, että nämä geenit ryhmiteltiin ensisijaisesti kahteen reittiin, mukaan lukien "Neuroaktiivinen ligandi-reseptori-vuorovaikutus" ja "MAPK-signalointireitti". B-glukaaniin kohdistavat muodontunnistuksen reseptorit rikastuivat immuunisolujen pinnalla (Goodridge et al., 2009). B-glukaanin tunnistamisen jälkeen nämä reseptorit stimuloivat tyrosiinikinaasia ja ydintekijä kappaB:tä (NF-kappaB), mikä johti tulehdusta edistävän sytokiinierityksen indusoitumiseen ja immuunivasteiden aktivoitumiseen (Kankkunen et al., 2010; Masuda et al. ., 2012; Xu et ai., 2016; Bode et ai., 2019). MAPK, seriini-treoniiniproteiinikinaasien perhe, näyttelee ratkaisevaa roolia tulehduksissa ja sytokiinituotannossa kanoissa. Byun et ai. (2016) osoittivat, että b-glukaani lisäsi interferoni-g:n ja interleukiinin -2 tuotantoa ja laukaisi merkittävästi enemmän MAPK p38:n fosforylaatiotasoja vatsakalvon makrofageissa. Wang et ai. (2014) raportoivat, että b-glukaani heikentää tulehdusvasteita THP-1-soluissa estämällä p38 MAPK:n aktivaation. Tässä tutkimuksessa MAPK-signalointireitillä tunnistettiin 13 DEG:tä, mukaan lukien DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB ja EGFR, mikä viittaa siihen, että b-glukaani on säädellyt. pernasta MAPK:n kautta kanoissa. MAPK on konservoitunut Ser/Thr-kinaasien luokka soluissa, jotka ovat pääasiassa mukana soluvasteissa, kuten immuunivasteessa, apoptoosissa ja proliferaatiossa. MAPK-perheeseen kuuluu vähintään 3 alaryhmää: c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK), p38 MAPK ja solunulkoinen signaalisäädelty kinaasi (ERK) (Hong et ai., 2020; Zhang et ai., 2021a). DUSP4 ja DUSP5 ovat kaksoisspesifisiä fosfataaseja, jotka estävät spesifisesti MAPK-perheen jäsenten, kuten p38:n, JNK:n ja ERK:n toimintaa, ja niillä on tärkeä säätelyrooli tulehduksellisen ylireaktion estämisessä ja tulehduksen taantumisen edistämisessä kehossa (Imasato et al. ., 2002; Talreja et al., 2021). Lisäksi pienen ei-koodaavan RNA:n nimeltä gga-miR-200a-3p on raportoitu tukahduttavan tulehdusta edistävien tekijöiden ilmentymistä ja säätelevän siten isännän autoimmuunivastetta säätelemällä negatiivisesti MAPK-reittiä. ja sen alavirran signalointimolekyylit (Pham et al., 2017). Tässä tutkimuksessa RT-qPCR-analyysi osoitti, että P38:n, JNK:n ja ERK:n mRNA-ilmentyminen väheni ja DUSP4:n ja DUSP5:n ​​mRNA-ilmentyminen lisääntyi kanoissa, joita ruokittiin b-glukaanilla (G70). Nämä tulokset viittaavat siihen, että b-glukaanin (G70) immuunijärjestelmää vahvistava vaikutus Newcastlen tautirokotteeseen saattaa liittyä MAPK:n kautta välittyvään tulehdusta edistävien tekijöiden negatiiviseen palautesäätelyyn. Lisäksi FAS on olennainen aine, joka välittää apoptoosia ja on elintärkeä immuunijärjestelmän homeostaasille (Krueger et al., 2003; Guegan ja Legembre, 2018). Samaan aikaan CACNA2 on jännitteestä riippuvainen kalsiumkanavan alayksikkö, jolla on edistävä vaikutus solujen lisääntymiseen, migraatioon ja invaasioon (Sun et al., 2020). Tässä tutkimuksessa FAS ja CACNA2 vähenivät merkittävästi kanoissa, joita oli täydennetty b-glukaanilla (G70), mikä osoittaa, että b-glukaanilla (G70) on immuunijärjestelmää vahvistavia vaikutuksia pääasiassa estämällä immuunisolujen apoptoosia ja tasapainottamalla autoimmuniteettia. Nämä havainnot tarjoavat teoreettisen viittauksen b-glukaanin (G70) käytölle immuunijärjestelmän vahvistajana kliinisissä olosuhteissa. Kuitenkin mekanismi, jolla b-glukaani tehostaa immuunivastetta MAPK-reitin negatiivisen palautevaikutuksen kautta, tarvitsee lisätodisteita. On mielenkiintoista huomata, että geenit, jotka koodaavat katelisidiiniä sisältäen CATH3:n, CATH1:n, CATH2:n, ja geenit, jotka koodaavat b-defensiiniä, mukaan lukien AvBD6, AvBD7, AvBD1 ja AvBD4, olivat huomattavasti heikommin säädeltyjä vertailussa H (Group G70 + Vaccine). vs. kontrolli (ryhmärokote). HDP:t (Host Defense Peptids) ovat efektorimolekyylejä, joilla on ratkaiseva rooli synnynnäisessä immuunijärjestelmässä (Cuperus et al., 2013). Näitä peptidejä on löydetty useista eläinlajeista nisäkkäistä lintuihin. Poikasissa on 4 katelisidiiniä, jotka koostuvat CATH1:stä, CATH2:sta, CATH3:sta ja CATHB1:stä, jotka tappavat tehokkaasti erilaisia ​​bakteereja (Hamad et al., 2017). Lintujen beeta-defensiinit (AvBD), vaihtoehtoisesti nimeltään gallinacean, ovat pieniä kationisia peptidejä, joissa on 3 kysteiinidisulfidisidosta kysteiinitähteidensä välissä, ja niillä on tärkeä rooli synnynnäisessä immuunijärjestelmässä (Yoshimura, 2015). Katelisidiinien ja beeta-defensiinin ilmentymisen väheneminen selittyy mahdollisesti takaisinkytkentäsäätelyllä, jossa bakteeri- ja parabakteeripopulaatioita vähensivät hiivan soluseinän polysakkaridit (Bi et al., 2020). Samanlaisia ​​tuloksia paljastettiin muissakin tutkimuksissa. Shao et ai. (2016) osoitti, että hiivan b-glukaanin lisääminen broilereilla tukahdutti Salmonella-infektion ja vähensi HDP:iden ilmentymistä kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR-analyysin avulla. Tässä tutkimuksessa pääosin b-glukaanista koostuva tuote G70 lisäsi NDV-spesifisten vasta-aineiden tasoa seerumissa, lisäsi ääreisveren lymfosyyttien ja suoliston lymfosyyttien NDV-stimulaatioindeksiä ja edisti ääreisveren T-lymfosyyttien erilaistumista CD-soluiksi 123}} T-solut. Lisäksi RNA-seq-analyysi osoitti, että G70 lisäsäätelee G-proteiiniin kytkettyyn serotoniinireseptoriin ja MHC-luokan I polypeptidiin liittyviä mRNA-ilmentymiä ja vähensi katelisidiiniin ja beeta-defensiiniin liittyviä mRNA-ilmentymiä. Kun otetaan huomioon G70:n tehostunut vaikutus kanan ND-rokotteeseen, G70:n vaikutusta muihin siipikarjarokotteisiin, kuten lintuinfluenssarokotteeseen, voidaan tutkia edelleen.

Kuva 6. KEGG-reitin analyysi.

Kuva 7. Valittujen DEG-ehdokkaiden RT-qPCR-vahvistus. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona § SE.

Kuva 8. Suhteellinen mRNA:n ilmentyminen pernassa. Kokonais-RNA uutettiin pernasta. Kanan b-aktiinia toimitettiin sisäisenä kontrolligeeninä. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona § SE.

VIITTEET

Baert, K., E. Sonck, BM Goddeeris, B. Devriendt ja E. Cox. 2015. Solutyyppispesifiset erot b-glukaanin tunnistamisessa ja signaloinnissa sian synnynnäisissä immuunisoluissa. Dev. Comp. Immunol. 48:192–203.

Ball, C., A. Forrester, A. Herrmann, S. Lemiere ja K. Ganapathy. 2019. Newcastlen tautivirusta tai lintujen metapneumovirusta vastaan ​​annetuilla elävillä rokotteilla saatu vertaileva suojaava immuniteetti, kun niitä annetaan yhdessä klassisten ja tarttuvan keuhkoputkentulehdusviruksen muunnelmien kanssa untuvikkojen broilereilla. Rokote. 37:7566–7575.

Bi, S., J. Zhang, Y. Qu, B. Zhou, X. He ja J. Ni. 2020. Hiivasoluseinämätuote paransi suoliston IgA-vastetta ja muutti umpisuolen mikroflooralajeja kanojen oraalisen rokotuksen jälkeen. Poult. Sci. 99:6576–6585.

Bi, S., J. Zhang, L. Zhang, K. Huang, J. Li ja L. Cao. 2022. Hiivasoluseinämän säätelemä soluvälitteinen immuunivaste Newcastlen taudin virusrokotteelle. Poult. Sci. 101:101712–101721.

Bode, K., F. Bujupi, C. Link, T. Hein, S. Zimmermann, D. Peiris, V. Jaquet, B. Lepenies, H. Weyd ja PH Krammer. 2019. Dektiinin-1 sitoutuminen apoptoottisten solujen anneksiineihin indusoi perifeeristä immuunitoleranssia NADPH-oksidaasin-2 kautta. Cell. Rep. 29:4435–4446.

Bohacova, P., J. Kossl, M. Hajkova, B. Hermankova, V. Holan ja E. Javorkova. 2021. Ero mitogeeni-stimuloitujen B- ja T-solujen välillä R-fykoerytriinikonjugoitujen vasta-aineiden epäspesifisessä sitoutumisessa. J. Immunol. menetelmät. 493:113013–113023.

Boyaka, PN, A. Tafaro, R. Fischer, K. Fujihashi, E. Jirillo ja JR McGhee. 2003. Immuunijärjestelmän terapeuttinen manipulointi: synnynnäisen ja mukautuvan limakalvon immuniteetin parantaminen. Curr. Pharm. Design. 9:1965–1972.

Bronte, V. ja MJ Pittet. 2013. Perna immuniteetin paikallisessa ja systeemisessä säätelyssä. Immuniteetti. 39:806-818.

Byun, E., S. Park, B. Jang, N. Sung ja E. Byun. 2016. Gammasäteilytetty b-glukaani indusoi immunomodulaatiota ja syövänvastaista aktiivisuutta MAPK- ja NF-kB-reittien kautta. J. Sei. Ruokaa. Agr. 96:695–702.

Chen, X., X. Chen, S. Qiu, Y. Hu, C. Jiang, D. Wang, Q. Fan, C. Zhang, Y. Huang, Y. Yu, H. Yang, C. Liu, Z Gao, R. Hou ja X. Li. 2014. Epimedium polysakkaridi-propolis flavonin oraalinesteen vaikutukset kanojen limakalvon immuniteettiin. Int. J. Biol. Macromol. 64:6–10.

Cui, X., Y. Wang, R. Guan, M. Lu, L. Yuan, W. Xu ja S. Hu. 2020. Tehostetut immuunivasteet hu-lammasten seerumiproteomisella analyysillä suu- ja sorkkatautirokotteelle emulgoituna kasviöljyadjuvanttiin. Rokotteet. 8:180–197

Cuperus, T., M. Coorens, A. van Dijk ja HP ​​Haagsman. 2013. Lintujen isäntäpuolustuspeptidit. Dev. Comp. Immunol. 41:352–369.

Goodridge, HS, AJ Wolf ja DM Underhill. 2009. Luontaisen immuunijärjestelmän beeta-glukaanin tunnistus. Immunol. Ilm. 230:38–50.

Guegan, J. ja P. Legembre. 2018. Fas/CD95:n ei-apoptoottiset toiminnot immuunivasteessa. FEBS J 285:809–827.

Guo, Y., RA Ali ja MA Qureshi. 2003. Beeta-glukaanin vaikutus immuunivasteisiin broilereilla. Immunopharm. Immunol. 25:461–472.

Hamad, SK, S. Kim, SW El-Kadi, EA Wong ja RA Dalloul. 2017. Isännän puolustuspeptidien vertaileva ilmentyminen kalkkunanpoikoissa. Poult. Sci. 96:2083–2090.

Hasted, T., S. Sharif, P. Boerlin ja MS Diarra. 2021. Hedelmien ja niiden uutteiden immunostimuloiva potentiaali siipikarjassa. Edessä. Immunol. 12:641696.

Hong, Y., J. Lee, TH Vu, S. Lee, HS Lillehoj ja YH Hong. 2020. Kanalintujen b-defensiini 8 moduloi immuunivastetta mitogeenin aktivoimien proteiinikinaasin signaalireittien kautta kanan makrofagisolulinjassa. Poult. Sci. 99:4174–4182.

Horst, G., R. Levine, R. Chick ja C. Hofacre. 2019. Beeta- 1,3-glukaanin (AletaTM) vaikutukset rokotusvasteeseen broilereilla. Poult. Sci. 98:1643–1647.

Imasato, A., C. Desbois-Mouthon, J. Han, H. Kai, ACB Cato, S. Akira ja J. Li. 2002. P38 MAPK:n esto glukokortikoideilla MAPK-fosfataasin -1 induktion kautta tehostaa ei-tyyppistä Haemophilus-vaikutuksen aiheuttamaa maksullisen reseptorin ilmentymistä 2. J. Biol. Chem. 277:47444–47450.

Kankkunen, P., L. Teiril€a, J. Rintahaka, H. Alenius, H. Wolff ja S. Matikainen. 2010. (1,3)-beetaglukaanit aktivoivat sekä dektiini-1- että NLRP3-tulehduksen ihmisen makrofageissa. J. Immunol. 184:6335–6342.

Kim, HS, JY Kim, HK Lee, MS Kim, SR Lee, JS Kang, HM Kim, K. Lee, JT Hong, Y. Kim ja S. Han. 2010. Dendriittisolujen aktivaatio umbilicaria esculentasta eristetyllä glukaanilla. Immuuni. Netw. 10:188–197.

Krueger, A., SC Fas, S. Baumann ja PH Krammer. 2003. CD95:n rooli perifeerisen T-soluapoptoosin säätelyssä. Immunol. Ilm. 193:58–69.