Cistanche Deserticolasta eristetyn fenyylietanoidiglykosidin kokonaisfraktion hyödylliset vaikutukset luun mikrorakenteeseen rotilla, joilta on poistettu munasarjat

1. Esittely

Postmenopausaalisesta osteoporoosista, josta joka kolmas yli 50-vuotias nainen kärsii, on tulossa suurin terveysriski, joka koettelee yli 200 miljoonaa naista kaikkialla maailmassa [1]. Vaihdevuosien aikana estrogeenitason jyrkkä lasku johtaa yleensä lisääntyneen osteoklastogeneesin aiheuttamaan luun resorption ylittymiseen; silloin tasapaino osteoblastien aiheuttaman luunmuodostuksen ja osteoklastien aiheuttaman luun resorption välillä häiriintyy ja kiihtyyluun resorptioaiheutti lopulta osteoporoosin ja jopa lonkka- tai selkärangan murtuman [2]. Uskottiin, että osteoklastien erilaistuminen laukesi, kun ydintekijä kappa B:n (RANK) reseptoriaktivaattori sitoutui RANKL:iin, RANK:n ligandiin. RANK:n ja RANKL:n yhdistelmää ei kuitenkaan voida aktivoida, ellei proteiinituumorinekroositekijäreseptoriin liittyvää tekijää 6 (TRAF6) ole liitetty siihen [3], jota seuraa alavirran signalointireittien, mukaan lukien PI3K/AKT ja NF-KB, stimulointi. Lopuksi aktivoitujen T-solujen c2 (NFAT2) ja c-Fos tumatekijän ilmentymiä säädettiin [4] osteoklastien erilaistumisen sekä luun resorption moduloimiseksi. Siten tekijöitä ja säätelijöitä, jotka liittyvät suoraan tai epäsuorasti osteoklastien aktivaatioon ja erilaistumiseen, uskottiin olevan keskeisiä kohteita luukadon estämisessä. On todellakin joitain kliinisiä ja synteettisiä hormonikorvaushoitolääkkeitä, kuten estradiolivaleraatti, jotka ovat tehokkaita postmenopausaalisen osteoporoosin hoidossa. Valitettavasti jotkin näistä lisäsivät vakavien syöpien, mukaan lukien rinta- ja endometriumin syöpien, riskiä [5], mikä rajoitti niiden kliinistä käyttöä. Siksi on tarpeen valita muita vaihtoehtoja, joilla on sekä tehokkuus että minimaaliset sivuvaikutukset. Perinteiset kiinalaiset lääkkeet (TCM) sekä eristetyt bioaktiiviset yhdisteet ja fraktiot [6–9] osoittautuivat tehokkaiksi erilaisissa vaivoissa, mukaan lukien postmenopausaalisessa osteoporoosissa. Näiden bioaktiivisten komponenttien ja fraktioiden joukossa fenyylietanoidiglykosidiyhdisteitä (PhG), joilla on potentiaalista tehoa, uskottiin lupaaviksi aineiksi osteoporoosin hoidossa [10–12]. PhG:iden rakenteet koostuvat kanelihappoaglykonista, hydroksyylifenyylietyyliryhmästä, joka on yhdistetty -glukopyranoosiin, apioosiin, galaktoosiin, ramnoosiin tai ksyloosiin glykosidisidoksen kautta. Niitä esiintyy laajalti Cistanche-suvun lääkelajeissa [13]. Cistanche deserticola YC Ma on virallinen TCM, joka on kirjattu Kiinan farmakopeaan, ja sen lisäksi, että C.deserticola on tärkeä TCM [14], se on myös ikääntymistä estävä tonic yrtti, jolla on vähän sivuvaikutuksia ja joka on kehitetty lääkeliuokseksi ja ravintonesteeksi valtion elintarvike- ja lääkevirasto. Kiinan farmakopeaan perustuen C. deserticolaa oli perinteisesti käytetty hoitamaan munuaisesanssin puutosongelmia, kuten lihasten vajaatoimintaa ja lannerangan heikkoutta, ja fenyylietanoidiglykosidiyhdisteitä, mukaan lukienekinakosidija akteosidi ovat tämän yrtin tärkeimmät bioaktiiviset ainesosat. TCM-teorian "munuaiset hallitsevat luuta" mukaan luujärjestelmää hallitsee munuaisesanssi [15], ja luuhun liittyvät ongelmat, kuten osteoporoosi, voitaisiin korjata yrteillä tai yhdisteillä, joilla on munuaisesanssia ravitseva vaikutus. Siksi oletimme, että C. deserticolasta eristetty fenyylietanoidiglykosidifraktio oli ainakin osittain hyödyllinen osteoporoosin hoidossa. Tämän vuoksi nykyinen koe suunniteltiin vahvistamaan hypoteesimme käyttämällä OVX-rottamallia, josta on poistettu munasarjat; Luun resorption ja muodostumisen merkkiaineiden lisäksi, jotka on arvioitava, antioksidanttiindeksiä sekä RANKL/RANK/TRAF6--indusoituja PI3K/AKT- ja NF-κB-signalointireittejä käytettiin myös osteoporoottisen bioaktiivisuuden päämekanismien tutkimiseen. .

2. Materiaalit ja menetelmä

2.1. Kasvimateriaalit ja valmistus.

Yhteensä 30 kg Cistanche deserticola YC Ma:n varsia kerättiin Yongningin piirikunnasta 2015. syyskuuta koordinaatilla 106.026597 ja 38.262816, Ningxian maakunta, Kiina. Yrtin tunnisti tohtori Lin Dong (Ningxian lääketieteellisen yliopiston farmakognosian laitos), ja vastaava näyte (nro 20150901) säilytettiin laitoksella Farmaseuttinen analyysi. Ensin uutettiin 30,0 kg jauhettua C. deserticolaa käyttämällä palautusjäähdytysmenetelmää 70 % etanolilla liuottimena; materiaalin suhde liuottimeen asetettiin 1:10:ksi ja palautusjäähdytysaika oli 2 tuntia 3 kertaa. Sitten kaikki suodokset yhdistettiin ja tiivistettiin alennetussa paineessa 60 °C:ssa. Toiseksi alustavaan erotukseen käytettiin makrohuokoisia hartsikolonneja AB-8 ja erilaisia ​​etanolisuhteita vedessä (0 %, 20 %, Eluointiin käytettiin 30 %, 40 %, 50 % ja 60 %, kumpikin 60 I). Kolmanneksi 40 % ja 50 % eluentit yhdistettiin ja puhdistettiin edelleen käyttämällä toistuvia makrohuokoisia AB-8 hartsikolonneja, joiden eluentit olivat 0 %, 20 %, 30 %, 40 % ja 50 % etanolia vedessä, ja kukin eluentti oli 12 1. Lopuksi 40-prosenttinen fraktio kerättiin ja kondensoitiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin 150 g vaaleankeltaista C. deserticolan (CDP, saanto oli 0,5 %) fenyylietanoidiglykosidifraktiota. In vivo -kokeita varten käytettiin 0,5 % CMC-Na-liuotinta CDP:n liuottamiseen; oraalinen antaminen eläimille asetettiin 1 ml:ksi/100 g ruumiinpainoa; in vitro Western blot -analyysiä varten CDP liuotettiin DMSO:lla ja laimennettiin sitten DMEM:llä, jotta saatiin lopulliset pitoisuudet 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml ja 0,001 mg/ml. 

LUONNOLLINEN KISTANKSIuute LUUN KASVUA VARTENFENYLETAANIDIGLYKOSIDIJA 75 % EKINAKOSIDI 30 % AKTEOSIDI 12 %

2.2. Kemikaalit ja liuottimet.

Estradiolivaleraatti (EV) oli Delpharm Lille SAS:lta Ranskasta; alkalisen fosfataasin (ALP), luun gla-proteiinin (BGP), tartraattiresistentin happaman fosfataasin (TRAP) ja deoksipyridinoliinin (DPD) silloitus ELISA-sarjat yhtiöltä Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, Kiina, 201605; malondialdehydi (MDA, 20181221), superoksididismutaasi (SOD, 20121218) ja glutationi (GSH, 20181221) reagenssisarjat Institute of Nanjing Jiancheng Biological Engineeringistä, Nanjing, Kiina; lntact parathormoni (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalsitoniini (2L9ISN7AIU) ja estrogeeniin liittyvä alfareseptori (ERR, Y3AY8QEWB3) silloittavat ELISA-sarjat yhtiöltä Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Kiina; katepsiini K ELISA -reagenssipakkaus, BioVision, Amerikka, 11300141; RANKL:n (GR3193842-5), RANK:n (AA02113656), TRAF6:n (2), c-Fosin (AG12059411), NFAT2:n (AO11015648), NF-κB p65:n (AH04138226), PI3-alfakinaasin (p26638226), PI3-alfakinaasin (p2685) , AKT 1 (AF05173234), -aktiini (17AV0411) ja piparjuuriperoksidaasilla konjugoidun vuohen anti-kanin IgG:n sekundaariset vasta-aineet, ZSGB-BIO, Kiina, 136080; kokonais-BCA-proteiinin määrityspakkaus ja kaupallinen pakkaus oste oklastin muodostumisen ja naudan sikiön seerumin havaitsemiseksi ja Dulbeccon modifioitu Eagle-elatusaine (DMEM) yhtiöltä HyClone, Logan, UT, USA; polyvinylideenifluoridi (PVDF) -kalvo yhtiöltä Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA; penisilliini ja streptomysiini Gibcosta, Rockville, MD, USA. Kaikki muut käytetyt kemialliset aineet olivat AR-laatua.

2.3. CDP:n HPLC-kvantifiointi.

CDP:n koostumuksen tunnistamiseen ja kvantifiointiin käytettiin Agilent 1220 HPLC-laitetta. Kromatografiaolosuhteet olivat seuraavat: C18-kolonni (TSK-GEL, 4.6.id × 250 mm, 5 μm); gradienttieluointi sisälsi liuottimet A (asetonitriili) ja B (vesi, joka sisältää 0,5 % etikkahappoa) (0-10 min: 17-20 % A; 10-30 min: 20-25 % A; ja 30-40 min: 25-30% A); ilmaisuaallonpituus oli 333 nm; ympäristön lämpötila; virtausnopeus oli 1,0 ml/min; näytteen injektiotilavuus oli 5 µl. Kahdeksan PhG-yhdistettä, nimittäin cistanosidi F, ekinakosidi, 6'-asetyylilakteosidi, cistanosidi C, cistanosidi A, akteosidi, 2'-asetyylilakteosidi ja isoakteosidi, tunnistettiin; käyttämällä vastaavia vertailuaineita ja ulkoista standardimenetelmää edellä mainittujen 8 PhG:n pitoisuudet kvantifioitiin HPLC-analyysillä (kuva 1).

Kuva 1: CDP:n HPLC-sormenjälki. Tästä fraktiosta löydettiin kahdeksan fenyylietanoidiglykosidiyhdistettä, ja kokonaispitoisuudeksi määritettiin 50,7 %. Yhdisteet ja niiden pitoisuudet olivat seuraavat: (1) akteosidi F (3,6 %), (2) ekinakosidi (8,8 %), (3) cistanosidi A (5,0 %), (4) akteosidi (13,3 %), (5) isoakteosidi (3,3 %), (6) akteosidi C (3,6 %), (7) 2'-asetyylilakteosidi (9,9 %) ja (8) 6'-asetyylilakteosidi (3,2 %).

2.4. Animal Experimental Protocol.

Yhteensä 6 0 3 kuukauden ikäistä naaraspuolista aikuista Sprague-Dawley-rottaa oli tarkoitettu Ningxian lääketieteellisen yliopiston eläinkokeiden keskuksesta, joiden keskimääräinen alkupaino oli noin 234 ± 25 g. Rotat pidettiin tavanomaisessa spesifisessä patogeenivapaassa ympäristössä sopeutumaan 1 viikon ajan. Sitten kaikki rotat nukutettiin (kloraalihydraatti, 100 mg/kg, ip) vain tai näennäisesti munasarjapoisto (SHAM), tai molemmat munasarjat poistettiin ja jaettiin sitten satunnaisesti viiteen alaryhmään: oraalisesti käsitelty vehikkelillä (0,5 % CMC- Na) asetettiin malliryhmäksi (OVX), estradiolivaleraatti (1 mg/kg/vrk) positiiviseksi ryhmäksi (EV) ja 60, 120 ja 240 mg/kg/vrk CDP:tä alhaiseksi (CDPL), kohtalainen (CDPM) ja korkea (CDPH) annosryhmät, vastaavasti. Kaikille rotille annettiin suun kautta päivittäin ja ne kestivät 3 kuukautta annostusta säädettäessä 2 viikon välein, mikä riippui koko kehon painon muutoksesta. Eläinkokeen viimeisenä päivänä otettiin 24-tunnin virtsa käyttämällä aineenvaihduntahäkkejä; seerumi kerättiin nukutettujen rottien reisivaltimosta; oikea reisiluu, sääriluu ja kaikki elimet leikattiin ja säilytettiin -80 C asteessa lisäanalyysiä varten. Suorittamamme eläinkokeet hyväksyttiin Ningxian lääketieteellisen yliopiston Institutional Animal Care and Use -komiteassa.

2.5. Luun mineraalitiheyden määritys ja mikro-CT-analyysi.

Ensinnäkin käytettiin kaksienergiaista röntgenabsorptiometrialaitetta (Lunar, USA) kunkin rotan oikean reisiluun kokonaisluun mineraalitiheyden arvioimiseen; toiseksi samaa reisiluuta käytettiin arvioimaan trabekulaarisen luun mikroarkkitehtuurin 3D-kuvaa käyttämällä mikro-CT-skanneria (GE, Amerikka). Isotrooppiseksi resoluutioksi asetettiin 14 μm ihanteellisen 3D-kuvan saamiseksi; kiinnostava alue (ROI) valittiin asettamalla samat koordinaatit kunkin näytteen reisiluun kasvulevyyn; ja luun morfometriset parametrit, mukaan lukien trabekulaarinen erottuminen (Tb.Sp), trabekulaariluku (Tb.N), trabekulaarinen paksuus (Tb.Th), luun mineraalipitoisuus (BMC), kudoksen mineraalitiheys (TMD) ja kudoksen mineraalipitoisuus (TMC) ) saatiin analysoimalla ROI.

Kuva 2: OVX:n ja 12 viikon CDP- tai EV-hoidon vaikutukset luun kokonaistiheyteen rottien oikean reisiluun, jotka arvioidaan käyttämällä kaksoisenergiaröntgenabsorptiometriaa (n=10/ryhmä). Tiedot esitettiin keskiarvona ± SD; ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ja ∗∗∗p < 0 001 verrattuna OVX-ryhmään; ###p < 0 001 vs. SHAM-ryhmä.

Kuvio 3: Mikro-CT-skannauskuvat CDP-käsiteltyjen rottien oikean reisiluun mikroarkkitehtuurista; esitetyt valokuvat edustivat 4 erilaista rotta kussakin ryhmässä: (A) OVX-ryhmä; (B) SHAM-ryhmä; (C) EV-ryhmä; (D) CDPH-ryhmä; (E) CDPM-ryhmä; (F) CDPL-ryhmä. Mitattuja parametreja ovat mmluun mineraalipitoisuus(BMC), kudoksen mineraalipitoisuus (TMC), kudoksen mineraalitiheys (TMD), trabekulaarinen erottuminen (Tb.Sp), trabekulaariluku (Tb.N) ja trabekulaarinen paksuus (Tb.Th). OVX-rotat ilmensivät huomattavaa pienenemistä mikroarkkitehtuurin alueella ja trabekulaarisessa lukumäärässä. CDP-käsitellyt rotat ja EV-käsitellyt rotat kumosivat osittain edellä mainitut löydökset samassa määrin 12 viikon hoidon jälkeen. Kaikki arvot esitettiin keskiarvona ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ja ∗∗∗p < 0 001 verrattuna OVX-ryhmään; ###p < 0 001 vs. SHAM-ryhmä.

Kuva 4: OVX:n ja 12 viikon CDP- tai EV-hoidon vaikutukset virtsaan ja seerumin Ca- ja P-arvoihin sekä PTH:hen ja kalsitoniiniin rotilla (n=10/ryhmä). Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ja ∗∗∗p < 0 001 verrattuna OVX-ryhmään; # p < 0 05, ##p < 0 01 ja ###p < 0 001 verrattuna SHAM-ryhmään.

2.6. Seerumin ja virtsan biokemiallinen määritys.

Seerumin katepsiini K:n, TRAP:n, SOD:n ja GSH:n aktiivisuudet sekä seerumin PTH-, kalsitoniini-, ERR-, MDA-, BGP- ja virtsan DPD-pitoisuudet määritettiin käyttämällä vastaavia reagenssipakkauksia valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alkalisen fosfataasin (ALP) taso sekä seerumin ja virtsan kalsiumin (Ca) ja fosforin (P) pitoisuudet arvioitiin automaattisella koneella (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA).

2.7. Western Blot -analyysi.

Osteoklastit indusoitiin käyttämällä RAW 264.7 -soluja, joihin oli lisätty makrofagipesäkkeitä stimuloivaa tekijää (MCSF) ja RANKL:ää. Lyhyesti sanottuna 1 × 107 RAW 264.7 -solua viljeltiin 6-kuoppalevyllä 30 ng/ml MCSF:n ja 25 ng/ml RANKL:n läsnä ollessa. Kuuden päivän induktion jälkeen kypsyneet osteoklastisolut tunnistettiin käyttämällä TRAP-värjättyä menetelmää vastaavan pakkauksen kanssa ja käsiteltiin sitten CDP:llä (0,1, 0,01 ja 0,001 mg/ml). vastaavasti) 24 tunnin ajan; sitten solut hajotettiin lyysipuskurilla, joka sisälsi 0,5 mmol fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, proteaasi- ja fosfataasin estäjiä. Sitten lysaatti erotettiin käyttämällä 10 % SDS-PAGE:ta ja siirrettiin PVDF-kalvolle, joka tutkittiin AKT1:llä, NF-KB-p65:llä, RANKL:llä, PI3K p85:llä, RANK:lla, NFAT2:lla, TRAF6:lla, c-Fos:lla ja -aktiinilla ( 1 : 400) 5 % rasvattoman maidon salpauksen jälkeen 2 tunnin ajan. Samat kalvot irrotettiin ja tutkittiin uudelleen edellä mainituilla 9 vastaavalla vasta-aineella, ja sitten ne havaittiin Image Lab -ohjelmistolla lopussa. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

2.8. Tilastollinen analyysi.

Kaikki in vivo- ja in vitro -kokeista saadut tiedot, jotka kuvattiin keskiarvona ± SD, analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA:ta ja sen jälkeen Dunnettin testiä (SPSS 22.0 ohjelmisto, SPSS, USA); p < 0 05 oli tilastollisesti merkitsevä.

3. Tulokset

3.1. CDP:n kemiallinen koostumus.

HPLC-menetelmää käyttäen kahdeksanfenyylietanoidiglykosidiyhdisteetlöytyi tästä fraktiosta, kuten kuva 1 osoittaa. Standardiviittauksia ja ulkoista standardimenetelmää käyttäen yhdisteet ja niiden pitoisuudet tunnistettiin ja määritettiin seuraavasti: (1) akteosidi F (3,6 %), (2) ekinakosidi (8,8 %), (3)cistanosidiA (50%), (4) akteosidi (13,3 %), (5) isoakteosidi (3,3 %), (6) akteosidi C (3,6 %), (7) 2'-asetyylilakteosidi (9,9 %) ) ja (8) 6'-asetyylilakteosidi (3,2 %). Näiden kahdeksan komponentin kokonaispitoisuudet määritettiin 50,7 %:ksi.

LUONNOLLINEN PUTKU CISTANSSIUUTELUUN KASVUA VARTENFENYLETAANIDIGLYKOSIDIJA 75 % EKINAKOSIDI 30 % AKTEOSIDI 12 %

3.2. CDP:n vaikutukset luun mineraalitiheyteen ja trabeculan mikroarkkitehtuuriin.

Eri alaryhmien rottien luun mineraalitiheys on esitetty kuvassa 2. Luun mineraalitiheyden pitoisuudessa havaittiin laskeva trendi OVX-mallileikkauksen rotilla verrattuna SHAM-ryhmän rottiin (p < {{ 1}}). Kaikilla CDP-käsitellyillä rotilla luun mineraalitiheys lisääntyi merkittävästi 11,2 %, 120 % ja 10,7 % (p < 0 01) verrattuna OVX-malliryhmän rottiin. Lisäksi luun kokonaistiheyttä koskevien tietojen mukaisesti mikro-CT-rekonstruktio sekä reisiluun histomorfometrinen määritys osoittivat, että OVX-ryhmän rotilla trabekulaarinen arkkitehtuuri heikkeni selvästi, mikä osoitti trabekulan huomattavan määrän ja pinta-alan pienenemisen. sekä huomattavasti lisääntynyt Tb.Sp verrattuna SHAM-ryhmän rottiin. CDP-hoito esti OVX:n aiheuttaman trabekulaarisen arkkitehtuurin huononemisen; kuten kuva 3 osoittaa, BMC-, TMC- ja Tb.N-arvot kasvoivat merkittävästi ja Tb.Sp:n pinta-ala pieneni huomattavasti, kun taas TMD:n ja Tb.Th:n arvot eivät vaikuttaneet merkittävästi OVX-toiminnon ja meidän CDP:n väliintulo.

Kuva 5: OVX- ja 12-viikon CDP- tai EV-hoidon vaikutukset seerumin TRAP-, katepsiini K-, DPD-, ALP- ja BGP-aktiivisuuksiin OVX-rotilla (n=10/ryhmä). Kaikki arvot esitettiin keskiarvona ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ja ∗∗∗p < 0 001 verrattuna OVX-ryhmään; # p < 0 05, ##p < 0 01 ja ###p < 0 001 verrattuna SHAM-ryhmään.

3.3. CDP:n vaikutukset virtsan ja seerumin biokemiallisiin parametreihin.

Kuten kuva 4 osoittaa, virtsan P-pitoisuudessa ja seerumin kalsitoniinipitoisuudessa havaittiin merkittäviä laskusuuntauksia OVX-malliryhmän rotilla, mikä oli lähes 30 % ja 60 % pienempi kuin SHAM-rotilla (p < 0 001 ), kun taas OVX- ja SHAM-ryhmien välillä ei havaittu ilmeisiä nousevia tai laskevia suuntauksia virtsan Ca- ja seerumin Ca-tasoissa sekä seerumin P- ja seerumin PTH-tasoissa. Käsittely CDP:llä esti merkittävästi seerumin P- ja Ca-häviötä OVX-rotilla, mikä on osoituksena seerumin P- ja Ca-tasojen huomattavasta lisääntymisestä (p < 0 05) verrattuna OVX-malliryhmän rottiin. Lisäksi kalsitoniinin lisääntyneet, mutta ei-statistisesti merkitsevät suuntaukset havaittiin sekä CDP:n pieni- että korkeaannosryhmissä verrattuna OVX-malliryhmään.

Kuva 6: OVX:n ja 12-viikon CDP- tai EV-hoidon vaikutukset ERR-ilmentymiseen, ruumiinpainoon sekä rottien kohdun ja emättimen painoon (n=10/ryhmä). Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ja ∗∗∗p < 0 001 verrattuna OVX-ryhmään; ###p < 0 001 vs. SHAM-ryhmä.

3.4. CDP:n vaikutukset luun muodostumiseen ja luun resorptiomarkkereihin.

CDP:n suotuisat vaikutukset luunmuodostusindeksiin sekä esto vaikuttavatluun resorptioMarkkerit on kuvattu kuvassa 5. Mitä tulee luunmuodostusmarkkereihin, seerumin BGP-tasoihin ei juurikaan vaikuttanut munasarjojen poistoleikkaus, mikä osoitti ei-merkittävillä muutoksilla, joita havaittiin kaikissa hoidetuissa ryhmissä, kun taas seerumin ALP:n tilastollisesti merkitseviä parannuksia saavutettiin sekä alhaisissa (6 0 mg/kg) ja kohtalaiset (120 mg/kg) annokset CDP-interventioryhmille verrattuna SHAM-ryhmän rottiin (p < 0 01). Luun resorptioindeksin osalta seerumin katepsiini K:n ja DPD:n sekä TRAP:n tasot OVX-malliryhmän rotilla paranivat merkittävästi, vastaavasti noin 75,0 %, 41,4 % ja 21,0 %, verrattuna SHAM-rotteihin. ja kun niitä käsiteltiin CDP:llä, erityisesti pienellä annoksella 60 mg/kg, katepsiini K:n ja DPD:n sekä TRAP:n ominaisuudet OVX-malliryhmässä estyivät huomattavasti 67,3 %:lla, 41,4 %:lla ja 25,9 %:lla. verrattuna OVX-malliryhmän rottiin.

LUONNOLLINEN PUTKIPURKKA LUUN KASVUA VARTENFENYLETAANIDIGLYKOSIDIJA 75 % EKINAKOSIDI 30 % AKTEOSIDI 12 %

3.5. CDP:n vaikutukset emättimeen ja kohtuun sekä koko kehon painoon.

Ei-merkittäviä eroja rottien alkuperäisissä koko kehon painoissa havaittiin ennen käsittelyä kuudessa ryhmässä (kuvio 6). Munasarjapoistoleikkaus johti kuitenkin merkittävään kasvuun OVX-malliryhmän rottien lopullisessa ruumiinpainossa, joka on lähes 36.0%, kun taas kohdun ja emättimen märkäpainot laskivat dramaattisesti lähes 9{{4} }.0% ja 60,0%, vastaavasti, verrattuna SHAM-rotteihin (p < 0 001). Vaikka ERR-sisällössä ei ollut merkittävää eroa OVX- ja SHAM-ryhmien välillä, kaikki hoitoryhmät, mukaan lukien CDP ja EV, lisäsivät merkittävästi ERR-tasoa. Lisäksi OVX-rottien koko kehon painot sekä emättimen ja kohdun painon menetys kääntyivät osittain päinvastaiseksi (p < 0 001), mutta CDP-interventio ei vaikuttanut niihin.

3.6. CDP:n vaikutukset seerumin MDA-, SOD- ja GSH-tasoihin.

Seerumin SOD:n ja GSH:n ominaisuuksissa ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa SHAM- ja OVX-malliryhmien välillä; kuten kuvio 7 kuvaa, GSH:n kasvutrendi voidaan havaita edellä olevien kahden ryhmän välillä. Lisäksi seerumin MDA:n taso nousi jyrkästi lähes 50 % OVX-malliryhmän rotissa verrattuna SHAM-rottiin. CDP-hoito ei vaikuttanut SOD:n aktiivisuuteen, kun taas CDP:n interventio paransi merkittävästi GSH:n ominaisuuksia, ja CDP alensi MDA:n tasoa huomattavasti 33,9 % ja 42,4 % annoksilla 60 ja 240 mg/kg. p < 0 001).

3.7. CDP:n vaikutukset proteiinien ilmentymistasoihin.

Tietomme, jotka on esitetty kuviossa 8, viittasivat siihen, että CDP-käsittely vähensi merkittävästi TRAF6:n, RANK:n ja RANKL:n proteiinitasoja kontrolliin verrattuna. Alavirran signaalireitit, mukaan lukien NF-KB, tukahdutettiin, ja PI3K/AKT stimuloitiin CDP:n interventiolla, mikä osoitti NF-KB-p65:n alasäätelyn ilmentymistä, kun taas PI3K p85 ja AKT1 lisääntyivät. Tämän seurauksena NFAT2:n ilmentyminen väheni merkittävästi ja c Fos nousi CDP:n pitoisuuden 0.001-0,1 mg/ml jälkeen. Kuvassa 9 on kuvattu ehdotettu mekanismi, jossa CDP alensi RANKL:n ja RANK:n tasoja vähentäen tämän ligandin sitoutumismääriä reseptoriinsa. RANKL:n yhteyttä RANK:iin vähensi edelleen TRAF6:n alasäätely, jota seurasi alavirran kulkureittien, mukaan lukien NF-KB-reitti, tukahduttaminen. Sitä vastoin PI3K/AKT-signaalireittiä stimuloitiin, mikä lopulta johti NFAT2:n ilmentymisen laskuun ja c-Fos-tason nousuun.

4. Keskustelu

Fenyylietanoidiglykosiditovat luonnossa esiintyviä vesiliukoisia komponentteja, joita esiintyy laajalti lääkekasvikunnassa [11]. Toistaiseksi fenyylietanoidiglykosidien yhdisteet ovat houkutelleet yhä enemmän tutkijoita, koska niillä on ilmeinen rooli ihmisten erilaisten vaivojen ja poikkeavuuksien hoidossa [13]. Lukuisat osteoporoottisia bioaktiivisia fraktioita ja yhdisteitä, mukaan lukien polyfenoli- ja fenyylietanoidiglykosidit, tunnistettiin ja eristettiin kymmenistä luonnollisista lääkeyrteistä [5, 10, 12, 16, 17]

Kuva 8: CDP:n eri konsentraatioiden vaikutukset TRAF6:n (a), RANKL:n (b), RANK:n (c), PI3K:n (d), AKT:n (e), NF-kBIA:n (f), NFAT2:n (g) proteiiniekspressioihin, ja c-Fos (h) (n=3/ryhmä); proteiinin ilmentyminen normalisoitiin -aktiiniin, ja jokaisen signaaliproteiinin kvantitatiiviset tiedot esitettiin prosentteina kontrollin arvosta. Tulokset kuvattiin keskiarvona ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ja ∗∗∗p < 0 001 verrattuna kontrolliryhmään.

C. deserticola tunnetaan hyvin "aavikon ginsenginä", mikä viittaa tämän syötävän TCM:n turvallisuusprofiiliin [18, 19]. Yleisenä tonisoivana yrttinä ja luonnollisena terveysruokana, jota on pitkään käytetty Aasian maissa, C. deserticolalla oli hyödyllinen tehtävä munuaisten vahvuuden parantamisessa. Havaittiin, että TCM:ää, jota on perinteisesti käytetty munuaisesanssin virkistykseen ja säilyttämiseen, käytettiin yleensä osteoporoosin hoitoon. Sekä in vitro että in vivo julkaistut tiedot olivat osoittaneet C. deserticolan osteoporoosin vastaisen vaikutuksen [20–23], ja fenyylietanoidiglykosidiaineosat, mukaan lukien ekinakosidi ja akteosidi, ovat tärkeimmät bioaktiiviset komponentit, joita esiintyy tässä syötävässä lääkekasvissa; kaikki viittasivat siihen, että itse ekinakosidin ja akteosidin lisäksi myös muiden C. deserticolan sisältämien fenyylietanoidiglykosidikomponenttien katsottiin olevan vastuussa tämän yrtin osteoporoottisista ominaisuuksista. Tässä tutkimuksessamme käytettiin suotuisan turvallisuuden makrohuokoista hartsia eristämään ja rikastamaan C. deserticolan fenyylietanoidiglykosidifraktiota, ja HPLC-menetelmällä kahdeksan pääasiallista fenyylietanoidiglykosidikomponenttia, nimittäin akteosidi F, ekinakosidi, cistanosidi A, akteosidi, isoakteosidi, akteosidi C, 2'-asetyylilakteosidi ja 6'-asetyylilakteosidi löydettiin eristetystä fenyyliletanoidiglykosidifraktiosta, ja pitoisuudet olivat 3,6%, 8,8%, 5,0%, 13,3%, 3,3%, 3,6%. 9,9 % ja 3,2 %. Ekinakosidilla, yhdellä C. deserticolan [14] tärkeimmistä aktiivisista yhdisteistä, on osoitettu olevan osteoporoottista vaikutusta; 270 mg/kg:n annos oli kuitenkin niin suuri, että se rajoitti sen kliinistä käyttöä [24]. Nykyisissä kokeissa OVX-rotilla käytettiin fenyylietanoidiglykosidin kokonaisfraktiota pienemmällä annoksella 60-240 mg/kg ruumiinpainoa/vrk, ja tunnistettujen aineosien pitoisuudet olivat lähes 50 % puhtaita tässä fraktiossa käyttämällä HPLC-menetelmällä.

Tiedettiin hyvin, että OVX voi aiheuttaa osteoporoosia, ja OVX-rotan uskottiin olevan klassinen ja sopiva malli simuloimaan ihmisen postmenopausaalista osteoporoosia. Samaan aikaan luun mineraalitiheyden, trabekulaarisen luun mikroarkkitehtuurin, kohdun ja emättimen märkäpainon ja estrogeenitason merkittävää laskua sekä luun resorption ja ruumiinpainon selvää parantumista havaittiin munasarjojen poistoleikkauksen jälkeen. osittain estrogeenin menetyksestä [25]. Tähänastiset tietomme ovat selvästi osoittaneet, että OVX todellakin aiheutti postmenopausaalista osteoporoosia ja siihen liittyy aina luun laadun, luun mikroarkkitehtuurin sekä kohdun ja emättimen märkäpainon jyrkkä heikkeneminen. Koska EV on yleinen hormonikorvausaine, jota on käytetty kliinisessä käytännössä, käytettiin sitä positiivisena kontrollina in vivo -kokeessamme, ja painonnousu ja atrofoituneet kohdun painot sekä heikentynyt luun mineraalitiheys ja trabekulaarisen luun mikroarkkitehtuuri selvitettiin. odotetusti käännetty EV-lisäyksellä. Positiivisesta kontrollista poiketen CDP-hoito ei vaikuttanut OVX-malliryhmän rottien emättimen ja kohdun painon laskuun sekä lisääntyneeseen koko kehon painoon, mikä merkitsi sitä, että CDP saattoi tehostaa luun muodostumista aiheuttamatta sivuvaikutuksia. kehon ja kohdun orgaanisiin kudoksiin. Vaikka CDP-hoito nosti ERR-tasoja merkittävästi, se oli aivan kuin fytoestrogeenivaikutus, ettei kohdun ja emättimen orgaanisissa kudoksissa havaittu sivuvaikutuksia. Lisäksi CDP:n hoito vahvisti merkittävästi OVX-rottien luun laatua, joka oli huonontunut munasarjojen poistoleikkauksen seurauksena.

Lisäksi OVX-rottien virtsan ja seerumin P- ja Ca-tasoja käytettiin myös heijastamaan osteoporoottista vaikutusta, ja Ca:n ja epäorgaanisen P:n pitoisuudet olivat yleensä riippuvaisia ​​kalsitoniinin ja PTH:n tasoista [26]. Vaikka tässä tutkimuksessa ei havaittu merkittävää laskua tai nousua virtsan Ca-erityksen määrässä,

Kuva 9: ​​Oletettu molekyylimekanismi: CDP voisi estää OVX-rotan luukatoa RANKL/RANK/TRAF6-indusoidun NF-KB:n inaktivoinnin ja PI3K/AKT-reittien aktivoitumisen sekä c-Fos-stimulaation ja NFAT2-suppression kautta , mikä on todisteena TRAF6:n, RANKL:n, RANK:n, NF-κBIA:n ja NFAT2:n ilmentymistasojen alentumisesta, kun taas c-Fos, AKT ja PI3K lisääntyivät merkittävästi CDP-hoidolla verrattuna kontrolliryhmään.

seerumi P, seerumin Ca ja PTH OVX-malliryhmän rotista saatiin, ja virtsassa havaittiin merkittäviä P- ja kalsitoniinitasoja (p < 0 001). Yhdenmukaisesti julkaistujen tietojen kanssa, että munasarjojen poistoleikkauksen aiheuttama estrogeenipuutos johti aina veren kalsitoniinitason laskuun, tämä alentunut seerumin kalsitoniini johti lopulta kohonneeseen PTH-tasoon, jossa Ca:n uskottiin olevan tärkein PTH:n erityksen säätelijä. Koska PTH:n konsentraatio ei osoittanut merkittävää eroa OVX- ja SHAM-ryhmien välillä tässä tutkimuksessa, Ca-taso sekä seerumissa että virtsassa ei myöskään osoittanut ilmeisiä muutoksia kahden yllä olevan ryhmän välillä. Kuitenkin havaittiin merkittävästi alentunut taipumus kalsitoniinin tasossa OVX- ja SHAM-ryhmien välillä, ja tämän seurauksena P-pitoisuus OVX:n virtsassa väheni voimakkaasti. Uskomme, että yllä olevat tiedot voivat selittää ristiriitaisen ilmiön, miksi OVX-rottien Ca-pitoisuuden erittyminen virtsaan ei osoittanut selvää muutosta verrattuna SHAM-rotteihin, ja tämä ilmiö saattaa myös liittyä luun vaihtuvuuden lisääntymiseen [27] . CDP-hoidon jälkeen seerumin P- ja Ca-tasot nousivat huomattavasti ja virtsan P-pitoisuus aleni OVX-rotilla, mikä osoitti, että CDP ei voinut ainoastaan ​​estää luumineraalielementtien erittymistä, vaan myös parantaa näiden rottien seerumipitoisuutta. elementtejä, mikä estää epäsuorasti luukadon.

Lisäksi luunmuodostus- ja resorptiomarkkereita sekä antioksidanttientsyymejä, mukaan lukien SOD ja GSH, käytettiin myös selittämään CDP:n taustalla olevat osteoporoosin vastaiset mekanismit. Kuten julkaistut tiedot, ALP-taso OVX-malliryhmän rotilla osoitti ei-statistisesti merkitsevää noususuuntausta, mikä osoittaa luun vaihtuvuuden kiihtymistä postmenopausaalisessa osteoporoosissa [10]. Kuitenkin CDP-hoidon (60, 120 ja 240 mg/kg/päivä) jälkeen ALP:n ominaisuus parani merkittävästi. Tiedettiin hyvin, että OVX aiheutti estrogeenitasojen jyrkän laskun, mikä yleensä johtaa ylittyneeseen luun resorptioon ja oksidatiiviseen stressiin [28], mistä on osoituksena TRAP-, katepsiini K- ja DPD-tasot sekä MDA-tasot, jotka ovat selvästi lisääntyneet rotissa. OVX malliryhmä. CDP:n interventio paransi kuitenkin osittain näitä heikkenemiä. Lisäksi OVX-rotan käsittely CDP:llä (60 ja 240 mg/kg) osoitti GSH:n aktiivisuuden merkittävän kasvun (p < 0 05). Yllä olevat tulokset viittasivat siihen, että CDP:llä oli terapeuttinen vaikutus OVX-indusoituun osteoporoosiin, ja nämä vaikutukset olivat sekä luun muodostumista tehostamalla että luun resorptiota suppressoimalla sekä luun antioksidanttijärjestelmää parantamalla.

RANK:n aktivointi sen ligandilla RANKL stimuloi NFAT2:n ja c-Fosin ilmentymistä PI3K/AKT- ja NF-KB-signaloinnin kautta [29]. NF-κB osoittautui välttämättömäksi osteoklastogeneesille, koska NF-KB:n hajoaminen saattoi johtaa heikentyneeseen osteoklastien erilaistumiseen osteoporoottisen fenotyypin kanssa, ja NF-kB lisäsi c-Fos:a ja vähensi NFAT2-ekspressiota RANKL/RANK/TRAF-indusoidun osteoklastogeneesin aikana. CDP:n hyödyllisen vaikutuksen arvioimiseksi NFAT2- ja c-Fos-välitteiseen osteoklastogeneesiin analysoitiin RANKL:n ja RANK:n ilmentymistasot. Odotettiin, että CDP esti merkittävästi NFAT2:ta ja stimuloi c-Fos-tasoja alentamalla RANKL:n ja RANK:n ilmentymiä. Sillä välin RANK:lta itseltään puuttui sisäinen kinaasiominaisuus, ellei TRAF6 ole yhdistänyt sitä alavirran signaloinnin laukaisemiseksi [3]. CDP myös alensi TRAF6:n ilmentymistä, mikä johti siihen, että RANKL:n ja RANK:n sitoutumismäärät pienenivät merkittävästi. Oletus CDP:n osteoporoottinen mekanismi OVX-rotilla kattoi yllä olevat signalointireitit, ja säätelijät on kuvattu kuvassa 9. Lyhyesti sanottuna CDP alensi TRAF6-, RANKL- ja RANK-tasoja, mikä tukahdutti alavirran signalointireittejä, mukaan lukien PI3K/AKT ja NF-KB, jotka RANKL/RANK laukaisee ja lopulta vähensivät tärkeimpien osteoklastogeenisten proteiinien NFAT2 ja c-Fos ekspressiota ja aktiivisuutta. Siksi useat vihjeet tiedoista osoittivat CDP:n suotuisan vaikutuksen OVX-rottien luumetaboliaan pääasiassa RANKL/RANK/TRAF{25}}välitteisten PI3K/AKT- ja NF-κB-reittien kautta.

5. Päätelmät

Yhteenvetona voidaan todeta, että C. deserticolasta eristettyjen fenyylietanoidiglykosidien kokonaismäärällä oli merkittäviä edullisia vaikutuksia OVX-rottien postmenopausaaliseen osteoporoosiin, ja terapeuttinen potentiaali luukatoa hillitsee pääasiassa stimuloimalla luun muodostumista ja estämällä luun resorptiota sekä parantamalla luun antioksidanttia. järjestelmä; mekanismit voivat liittyä RANKL/RANK/TRAF{0}}indusoituun NF-KB-aktivaatioon ja PI3K/AKT-inaktivaatioon sekä c-Fos-stimulaatioon ja NFAT2-suppressioon, ja lopuksi osteoklastien erilaistuminen estyi.

LUONNOLLINEN PUTKIPURKKA LUUN KASVUA VARTENFENYLETAANIDIGLYKOSIDIJA 75 % EKINAKOSIDI 30 % AKTEOSIDI 12 %