Echinakosidin hyödylliset vaikutukset diabeettiseen kardiomyopatiaan diabeettisilla Db/Db-hiirillä

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Xiang Zhang & Yarong Hao

Johdanto

Diabeettinen kardiomyopatia (DCM) on merkittävä diabeteksen komplikaatio, jolla on korkea sairastuvuus ja suuri sydän- ja verisuonitautien ja kuolleisuuden riski diabeetikoilla.1 Dikloigaattorin esiintyvyys potilailla, joilla on ollut diabetes ≥ 5 vuotta, on yli 44,4 %, mikä nousee 56 %:iin 8 vuoden kuluttua.2,3 dikloorimeumatauti on eräänlainen primaarinen kardiomyopatia, joka ilmenee sydämen rakenteellisina ja toiminnallisina poikkeavuuksina, jotka johtuvat sydänfibroosisolun apoptoosista ja mikrovaskulaarisista vaurioista diabeetikoilla, joilla ei ole iskeemistä tai hypertensiivistä sydänsairautta, ja jotka voivat aiheuttaa sydämen rytmihäiriöitä, joihin liittyy sydämen alkuperäshokki ja äkillinen kuolema sydämen vajaatoiminnassa.4 DCM:n monimutkaisen patogeneesin ja sen pitkälle edenneessä vaiheessa olevan diagnoosin vuoksi tehokkaita hoitoja ei ole olemassa.5 Hyperglykemia on DCM-patogeneesin aloitustekijä. Pitkäaikainen hyperglykemia johtaa häiriintyneeseen glukoosi- ja lipidiaineenvaihduntaan diabeetikoiden kardiomyosyyteissä, mikä johtaa verisuonten endoteelisolujen ja muiden kudosten loukkaantumiseen, mikä edistää patologisia muutoksia, kuten hypertrofiaa, nekroosia, apoptoosia ja sydänlihaksen interstitiaalista fibroosia.6,7 Glukoosi- ja lipidiaineenvaihdunnan häiriöt ovat avain dikloorimetaanin patologisiin mekanismeihin. Siksi kardiomyosyyttien energia-aineenvaihdunnan tehokas hallinta on tärkeä terapeuttinen strategia dikloorimetaanille.

cistanche tubulosa -hoitoDiabeettinen kardiomyopatia

Sydänlihaksen lipidien kertyminen DCM: ään pahentaa sydämen vajaatoiminnan etenemistä. PPAR-α on keskeinen säätelijä erilaisille toisiinsa liittyville geeneille soluperoksidaasien, mitokondrioiden ja mikrosomien rasvahappojen hapetusjärjestelmässä, ja sillä on keskeinen rooli lipidien aineenvaihdunnan ja tulehduksen ja immuniteetin säätelyn aikana.8 PPAR-α parantaa lipidien aineenvaihduntaa mitokondrioiden ja peroksidaasirasvahapon beetahapetuksen avulla, välittämänä karnitiinipalmitoyylitransferaasi-I:n (CPT-I) kautta.9 Pitkien ja haarautuneiden rasvahappojen hapettuminen10 vähentää lipoproteiinien ja VLDL:n synteesiä ja kokoonpanoa. 11 Sappihapposynteesin epäsuora säätely edistää kolesterolin erittymistä12 ja estää tulehduksellisiin geenien ilmentymiseen. PPAR-α ilmentyminen maksassa on huomattavasti alhaisempi potilailla, joilla on alkoholiton rasvamaksasairaus, tai eläinmalleissa, joissa on pitkäaikainen runsasrasvainen kulutus.13,14 Everett et al osoitti, että maksaan liittyvien vapaiden rasvahappojen tasot lisääntyivät merkittävästi PPAR-α tyrmäyshiirimalleissa heikennetyn lipidiaineenvaihdunnan vuoksi, mikä edistää maksan steatoosia.15 Nämä havainnot viittaavat siihen, että PPAR-α on tärkeä rooli lipidiaineenvaihdunnan patogeneesissä.

Echinosidi (ECH) on luonnollinen yhdiste, joka on eristettycistanche tubulosa.ECH:n aktiivinen kemikaali on fenyylietanoidi, jolla on antioksidanttisia, väsymystä estäviä, kasvainvastaisia ja anti-inflammatorisia vaikutuksia ja joka voi parantaa muistia, hermoja ja maksan suojaa sekä parantaa immuunijärjestelmän säätelyä.16,17 Db/db-diabeettisilla hiirillä tehdyssä tutkimuksessa havaittiin, että ECH voisi parantaa insuliiniresistenssiä, lisätä HDL-tasoa ja vähentää TG-, TC- ja LDL-tasoja, osoittaen, että ECH voisi tehokkaasti parantaa diabeettista lipidiaineenvaihduntaa.18 Lisäksi Shimoda et ai osoitti, että echinakosidi voi vaikuttaa lipidien aineenvaihduntaan säätelemällä hepatobiliaariseen sterolin kuljetukseen liittyvää mRNA:ta

ja aineenvaihdunta.19 Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ECH säätelee TGF-β ja sen alavirran geenien ilmentymistä munuaisfibroosin parantamiseksi db/db-hiirillä.20 Tässä tutkimuksessa, jotta voisimme ymmärtää paremmin ECH:n suojaavia vaikutuksia sydänlihassoluvaurioihin dikloimishormonissa ja tutkia sen mahdollisia molekyylimekanismeja, käytimme db/db-hiiriä dikloorimediaanitautimallina ja tutkimme ECH:n säätelymekanismeja proteiineissa, jotka säätelevät glukoosia ja lipidien aineenvaihdunnan häiriöitä, oksidatiivinen stressi ja apoptoosi kardiomyosyyteissä. Tavoitteenamme oli tarjota teoreettinen perusta dikloorimetaanin tehokkaalle hoidolle.

cistanche tubulosa

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

ECH-jauhe (HPLC:n havaitsema 94 %:n puhtausaste, eränumero 190906) (täydennyskuva 1) saatiin Shanghai Medical Science Company, Ltd:ltä (Shanghai, Kiina). ECH liuotettiin veteen 2 mg/ml ja varastoitiin 4 °C:ssa pimeässä. ECH:ta annettiin annoksena 100–500 mg/kg·d ja sitä alennettiin merkittävästi

verensokeri ja parantuneet veren lipiditasot.18 ECH osoitti annoksesta riippuvia hypoglykeemisiä ja hyperlipideemisiä vaikutuksia.

Koe-eläimet ja hoito

Eläinkokeet suoritettiin National Institutes of Healthin ohjeiden (NIH Pub) mukaisesti. Nro 85-23, tarkistettu 1996). Kokeellisen eläimen eettinen komitea ja Wuhanin yliopiston (Wuhan, Kiina, nro 20190517) Renmin-sairaalan eläinten ruokintakeskus hyväksyivät pöytäkirjat. Aikuiset urospuoliset C57BLKS/J db/db -hiiret ja db/m-hiiret (SPF-luokka) ostettiin Nanjingin yliopiston – Nanjingin biolääketieteellisen tutkimuslaitoksen (Nanjing, Kiinan kansantasavalta, numero: SCXK (Sue) 2018-0001). Eläimet olivat häkissä Renminin sairaalan eläinkeskuksessa (Wuhan, Kiinan kansantasavalta) huoneenlämmössä (20 °C), suhteellisessa kosteudessa 50–60 % ja 12 tunnin valo-/pimeän syklin alaisena. Adaptiivinen ruokinta suoritettiin 1 tunnin ajan, eikä hypoglykeemisiä lääkkeitä annettu.

Karanteenin jälkeen db/db-hiiret jaettiin satunnaisesti diabeteksen malliryhmään (db/db-ryhmä, n= 10), ECH-hoitoryhmään (db/db+ECH-ryhmä, n=11) tai db/m-kontrolliryhmään (db/m, n=9). 8 viikon kuluttua db/db- ja db/m-ryhmien hiirille annettiin suun kautta 0,05 ml/10 g suolaliuosta 10 viikon ajan, kun taas db/db+ECH-ryhmän hiirille annettiin 300 mg/(kg/d) suun kautta

ECH painon mukaan 10 viikon ajan. Kolmen hiiriryhmän painoja seurattiin viikoittain, ja ruokintaa, juomista ja aktiivisuutta arvioitiin. Kun hiiret olivat paastonneet 8 tuntia, verinäytteet (~ 50ul) otettiin hännän päästä 2 viikon välein verensokerimittarilla ja testipaperilla (Johnson &Johnson , Johnson, New Brunswick, NJ, USA) verensokeritasojen määrittämiseksi. 10 viikon toimenpiteen jälkeen hiiret nukutettiin vatsaontelonsisäisellä injektiolla 2% pentobarbitaalisella natriumilla (Shanghai Harvest -yhtiö, Shanghai, Kiinan kansantasavalta) (100 mg/kg). Veri kerättiin kapillaarineulan asettamisen jälkeen ja seerumi erotettiin nopeasti ja varastoitiin −80 °C:ssa analyysia varten. Sydämen perfuusion jälkeen kylmällä PBS: llä veren poistamiseksi ilmainen PBS poistettiin suodatinpaperilla. Sydänkudos erotettiin ja punnittiin, ja sydämen kuivapaino mitattiin. Hiirien vatsa ajeltiin, vatsa avattiin alkoholin (70%) desinfioinnin jälkeen, ja vatsan ihonalainen rasvakudos poistettiin nopeasti ja punnittiin märkänä. Hiirien sääriluu eristettiin ja mitattiin. Sydämen hypertrofiaa arvioitiin sydämen painon ja sääriluun pituuden (HW/TL) (mg/mm) suhteena. Sydänkudokset kiinnitettiin 4%: lla paraformaldehydillä (Google-biotekniikka, Wuhan, Kiinan kansantasavalta) ja biopsiat suoritettiin sydänlihaskudoksen morfologian seuraamiseksi. Jäljelle jäävä sydänkudos asetettiin nestemäiseen typpeen 1 tunniksi ja varastoitiin −80 °C:ssa ennen RT-PCR- ja Western blot -analyysiä.

Ehokardiografia

Ultraääni (VisualSonics, Toronto, ON, Kanada) suoritettiin ehokardiografisia mittauksia varten kokeen lopussa. Hiiret nukutettiin vatsakalvonsisäisellä injektiolla 4%: n kloorihydraatilla nopeudella 30 mg/kg puolen tunnin ajan, 21 ajeltiin rintakehän paljastamiseksi ja kiinnitettiin tasaiselle levylle. Määritettiin vasemman kammion systolinen halkaisija (DVDD), LV-diastolinen halkaisija (LVD), LV-ejektiofraktio (EF) ja LV-murto-osan lyheneminen (FS).

Metaboliset ja biokemialliset parametrit

18 viikon iässä verinäytteitä sentrifugoitiin 4 °C:ssa 20 minuutin ajan seerumin keräämistä varten. Kokonaisautomaattista biokemiallista analysaattoria (ADVID2400, Tokio, Japani) käytettiin kokonaiskolesterolin (TC), triglyseridien (TG), vapaiden rasvahappojen (FIFA), suuritiheyksisen lipoproteiini-kolesterolin (HDL-c) ja pienitiheyksisen lipoproteiini-kolesterolin (LDL-c) havaitsemiseen seerumissa.

Hapettumisenesto: cistanche tubulosa

Hapetusindeksi ja antioksidanttitasot

Saatiin tuoreita vasemman kammion sydänlihaskudoksia (50 mg) kustakin ryhmästä. SOD-, GSH-px- ja MDA-tasot sydänlihassoluissa määritettiin kaupallisilla sarjoilla (Nanjing Jiangcheng Bioengineering Institute, Kiina).

Trikromi, Tunel ja Sudan II Värjäys Kunkin hiiriryhmän sydänlihaskudoksen vasen kammioalue kiinnitettiin 4%: iin paraformaldehydiin 24 tunnin ajan, parafiini upotettu, leikattu ja HE värjätty. Kunkin hiiriryhmän sydänlihaskuitujen patologisia ja morfologisia muutoksia havaittiin valomikroskopiassa (JEOL, Tokio, Japani). Sydämen myosyyttiapoptoosi havaittiin Tunel-määritykset (numero11684817910, Roche, USA). Sydänkudosta esikäsiteltiin paraformaldehydillä, upotettiin ja viipaloitiin. Leikkeet pestiin ksyleeni I: llä (Shanghai, Kiinan kansantasavalta) (20 min) -ksyleeni II (20 min) -vedetön etanoli I (10 min) -vedetön etanoli II (10 min) -95% alkoholia (5 min)-90% alkoholia (5 min)-80% alkoholia (5 min) -70% alkoholia (5 min) ja tislattua vettä. Osat kuivattiin ravistamalla ja histokemiallisia harjarenkaita käytettiin nestehäviön estämiseen. Proteaasi K lisättiin renkaisiin kudoksen peittämiseksi. Kun inkubointia oli inkuboitu 37 °C:ssa 15 minuutin ajan, liukumäet asetettiin PBS:ään (pH 7,4) ja pestiin väriherkistysmittarissa (kolme kertaa 5 minuutin ajan). Reagensseja 1 (TdT) ja 2 (dUTP) sekoitettiin suhteessa 1:9 ja lisättiin kudoksen sisäpeitteeseen. Seoksia inkuboitiin vesihauteessa 37 °C:ssa 60 minuutin ajan. Pieni määrä vettä lisättiin kosteuden ylläpitämiseksi. Dioja huuhdeltiin PBS- ja DAPI-värjätyissä (Aspen biological, Wuhan, Kiinan kansantasavalta) pimeässä 5 minuutin ajan. Liukumäet huuhdeltiin PBS: ssä ja asennettiin fluoresenssinestoaineella. Osiot visualisoitiin fluoresoivalla mikroskopialla ja kuvattiin. Sudan II -värjäystä käytettiin tarkkailemaan lipidien kertymistä sydämen myosyyttiin. Vasemman kammion kudokset kiinnitettiin 10-prosenttiseen paraformaldehydiin 30 minuutin ajan, värjättiin Sudanin punaisella II: lla (Gefen, Shanghai, Kiinan kansantasavalta) huoneenlämmössä 10 minuutin ajan, värjättiin värit 75-prosenttisella alkoholilla ja värjättiin uudelleen PBS: ssä 15 minuutin ajan. Sydänlihaksen fibroosin suhde Massonin värjättyjen kolmiväristen osien kokonaispinta-alaan määritettiin Image-Pro Plus -kvantitatiivisella ohjelmistolla. Diat asennettiin glyseriinigelatiinilla ja kuvattiin mikroskopialla.

Tulokset

ECH:n vaikutukset Db/Db-hiiriin

Db/db-ryhmien hiirillä oli ilmeinen polyfagia ja polyuria. Kehon koot olivat myös huomattavasti suurempia kuin db/m-hiirillä. Painot db/db-ryhmässä kasvoivat merkittävästi suhteessa db/m-ryhmään (kuva 1A; **p<0.01). body="" weights="" of="" the="" db/db="" +="" ech="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" of="" the="" db/="" db="" group="" after="" 10="" weeks="" of="" ech="" treatment="" (figure="" 1a;=""><0.05). at="" week="" 15,="" the="" difference="" in="" body="" weight="" of="" each="" group="" gradually="" appeared="" after="" ech="" intervention.="" the="" abdominal="" fat="" thickness="" of="" mice="" in="" the="" db/db="" group="" was="" higher="" than="" those="" in="" the="" db/m="" group="" (figure="" 2b;=""><0.01). ech,="" therefore,="" improves="" obesity="" in="" db/db="" mice,="" the="" specific="" mechanisms="" of="" which="" require="" further="">

Paastoveren glukoositasot arvioitiin viikoittain. Kuten kuvasta 1B käy ilmi, db/m-hiiriin verrattuna db/db-hiirten paastoveren glukoosipitoisuus nousi merkittävästi iän myötä ja osoitti ilmeistä hyperglykemiaa (kuva 1B; *p<0.01). over="" a="" 10="" week="" period,="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/db="" and="" db/db="" +="" ech="" group="" increased,="" whilst="" glucose="" levels="" in="" the="" db/m="" group="" remained="" stable.="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/="" db="" +="" ech="" group="" were="" slower="" than="" those="" of="" the="" db/db="" group="" (figure="" 1b;=""><0.01), suggesting="" that="" ech="" markedly="" improved="" hyperglycemia="" in="" db/db="" diabetic="" mice.="" we="" speculated="" that="" ech="" could="" promote="" the="" synthesis="" of="" liver="" glycogen="" and="" inhibited="" the="" activity="" of="" α-glucosidase="" to="" suppressed="" glucose="" transport="" in="" the="" small="" intestine,="" significantly="" contributing="" to="">

Keskustelu

Diabeettinen kardiomyopatia on yleensä jaettu neljään vaiheeseen. Ensimmäisessä vaiheessa vasemman kammion massa kasvoi, diastolinen toimintahäiriö ja ejektiofraktio (EF) normaalit. Jopa kliinisesti oireeton, sydänlihasfibroosi lisääntyi, varhainen diastolinen täyttymys väheni ja vasemman kammion loppudiastolinen paine nousi.22 Toiselle vaiheelle on ominaista lisääntynyt vasemman kammion massa, paksuuntuneet kammioseinät, systolinen ja diastolinen toimintahäiriö (EF<50%), mild="" cardiac="" dilatation.="" in="" the="" third="" stage,="" diastolic="" dysfunction="" and="" arterial="" hypertension="" contribute="" to="" systolic="" dysfunction="" and="" microangiopathy.="" stage="" iv,="" moderate-severe="" systolic="" dysfunction,="" cardiac="" dilatation,="" fibrosis,="" and="" microvascular="" and="" macrovascular="" lesions="" cause="" severe="" and="" irreversible="" changes="" in="" heart="" tissue="" ultimately.26="" myocardial="" cell="" apoptosis,="" necrosis,="" hypertrophy,="" and="" fibrosis="" increase="" leading="" to="" disorders="" of="" diastolic="" and="" systolic="" functioning.6,27="" this="" eventually="" develops="" into="" ischemic="" heart="" disease="" and="" heart="" failure.28="" in="" this="" study,="" blood="" glucose="" and="" serum="" lipid="" levels="" of="" db/db="" mice="" significantly="" increased="" in="" the="" db/db="" group.="" symptoms="" of="" obesity="" were="" also="" observed,="" including="" body="" weight="" changes="" and="" increases="" in="" the="" rate="" of="" hw/tl="" compared="" to="" the="" db/m="" group.="" he="" staining="" and="" masson’s="" trichrome="" staining="" of="" the="" heart="" showed="" obvious="" pathological="" changes="" in="" the="" cardiac="" myocytes="" of="" the="" db/db="" group,="" including="" hypertrophy="" and="" necrosis,="" disordered="" cardiac="" myocytes,="" and="" high="" levels="" of="" extracellular="" matrix="" deposition.="" these="" data="" indicate="" that="" db/db="" mice="" exhibit="" early="" dcm="" under="" long-term="">

ATP on sydämen perusenergianlähde. Sydänenergiaa aikaansaa FA:n hapettuminen ja hajoaminen, jonka osuus sydämen energian saannista on ~70 %.29 Loput saadaan hiilihydraateista, kuten glukoosista ja maitohaposta.30 Diabeettisiin sydämiin kohdistuu lisääntynyt energiankulutus ja sydänlihaksen kapasiteetin epätasapaino, mikä on sydänlihaksen aineenvaihduntahäiriöiden pääasiallinen syy, mukaan lukien vähentynyt glukoosiaineenvaihdunta ja lisääntynyt FA-aineenvaihdunta. Tämä johtaa fa:n lisääntyneeseen imeytymiseen ja hapettumiseen, mikä johtaa rasvan kertymiseen ja myrkyllisten rasva-aineiden muodostumiseen, mikä johtaa suoraan dikloorimesioihin.31

Päätelmät

Db/db-hiirillä, joilla on diabeettinen sydänlihas, glukoosi- ja lipidiaineenvaihdunta on säätelemätön, mikä johtaa lisääntyneeseen oksidatiiviseen stressiin ja apoptoosiin. Tämä tutkimus vahvisti, että ECH voi merkittävästi vähentää pitkäaikaista hyperglykemiaa db/db-hiirillä PPAR/M-CPT-1/GLUT-4-signaloinnin avulla. Samaan aikaan ECH paransi oksidatiivista stressiä ja esti sydänlihaksen apoptoosia db/db-DCM-hiirillä, mikä voi liittyä parantuneeseen energia-aineenvaihduntaan. Vaikka näitä vaikutuksia ohjaavia taustalla olevia mekanismeja ei löydetty, nämä havainnot tarjoavat uuden suunnan dikloigaattorin hoidolle ja ECH:n suojaavalle roolille sydänlihasvaurioiden parantamisessa.

Viittaukset

1. Bauters C, Lamblin N, Mc Fadden EP, Van Belle E, Millaire A, de

Groote P. Diabetes mellituksen vaikutus sydämen vajaatoiminnan riskiin ja lopputulokseen. Cardiovasc Diabetol. 2003;1(8):1–2. doi:10.1186/1475- 2840-2-1

2. Tate M, Grieve DJ, Ritchie RH. Ovatko diabeettisen kardiomyopatian kohdennetut hoidot horisontissa? Clin Sci. 2017;131(10):897–915. doi:10.1042/CS20160491

3. Khan H, Anker SD, Januzzi JJ, ym. Sydämen vajaatoiminnan epidemiologia potilailla, joilla on diabetes mellitus ilman sepelvaltimotautia. J-kortti epäonnistui. 2019;25(2):78–86. doi:10.1016/j.cardfail.2018.10.015

4. Sheila K, Patel B. CTGF-geeni −945 G/C polymorfismi ei liity sydän- tai munuaiskomplikaatioihin tyypin 2 diabetesta sairastavilla henkilöillä. Cardiovasc Diabetol. 2012;1(11):42.