​Perustuu verkostofarmakologiaan ja eläinkokeisiin, joilla tutkitaan Cistanche Tubulosan fenyylietanoidiglykosidin vaikutusta diabeettiseen nefropatiaan

Tiivistelmä: Tavoite Tutkia vaikutustaCistanchefenyylietanoliglykosidit(CPhGs) päällädiabeettinen munuaissairaus(DKD) perustuu verkostofarmakologiaan ja eläinkokeisiin. Menetelmät UHPLC-QE-MS-menetelmää käytettiin analysoimaanCPhG:n kemialliset komponentit. Ydinkomponenttien seulomiseen käytettiin TCMSP- ja Swiss Target Prediction -tietokantoja. DKD:hen liittyvien kohteiden hankkimiseen käytettiin OMIM- ja GeneCards-tietokantoja. Yhteisten kohteiden saamisen jälkeen STRING-verkkosivustoa käytettiin proteiinien vuorovaikutusverkoston rakentamiseen. DAVID-tietokantaa käytettiin GO, KEGG-polkuanalyysiin ja Cytoscape-ohjelmistoa "CPhGs-ydinkomponentti-kohde-polku" -verkon rakentamiseen. Kymmenen rottaa valittiin satunnaisesti normaaliksi ryhmäksi, ja loput rotat ruokittiin runsaasti sokeria ja rasvaa sisältävällä rehulla ja niille annettiin yksi intraperitoneaalinen STZ-injektio DKD-mallin luomiseksi. Heidät jaettiin malliryhmään, dapagliflotsiiniryhmään (1 mg/kg) ja CPhG:t korkeaan ja keskimääräiseen ja matalaan annokseen (500, 25{{40}}, 125). mg/kg) ryhmät, 10 eläintä kussakin ryhmässä, lääkehoitoa 6 viikon ajan, yleisiä olosuhteita tarkkailtiin, ruumiinpaino määritettiin ja verensokeri testattiin joka viikko; Virtsa kerättiin 24 tunnin kuluttua viimeisen annoksen jälkeen. Tunnista 24-tunnin kokonaisvirtsan proteiini (24-UTP); kerätä verta vatsa-aortasta ja uhrata se, erottaa seerumi ja havaita urea typpi (BUN), virtsahappo (UA), kokonaiskolesteroli (TC), triglyseridi (TG) ja korkea verenpaine. Korkeatiheyksisten lipoproteiinien (HDL) ja matalatiheyksisten lipoproteiinien (LDL) tasoja, HE-värjäystä ja Masson-värjäystä käytettiin havainnoimaan patologisia muutoksia munuaiskudoksessa, ELISA:lla havaittiin seerumin IL-1, IL{{17} } ja TNF-tasot, ja Western blottia käytettiin munuaiskudoksen havaitsemiseen. JAK2-, p-JAK2-, STAT3-, pSTAT3-, SOCS3-proteiinin ilmentyminen. Tulokset UHPLC-QE-MS-tekniikalla havaittiin yhteensä 699 komponenttia. Seulonnan jälkeen saatiin 16 CPhG:n ydinkomponenttia ja 323 samankaltaista kohdetta. CPhG:t ja DKD jakoivat 99 kohdetta. Tärkeimmät kohteet olivat STAT3, SRC, EGFR jne. KEGG-reittianalyysissä seulottiin 151 signalointireittiä, mikä osoitti, että IL-17-signalointireitillä, PI3K/Akt-signalointireitillä, TNF-signalointireitillä jne. voi olla keskeinen rooli DKD:n hoito CPhG:llä. CPhG:t voivat lisätä DKD-rottien ruumiinpainoa (P＜0,01), vähentää vedenkulutusta (P＜0,01), säädellä glukoosi- ja lipidiaineenvaihduntaa, alentaa 24-UTP- ja BUN-tasoja (P＜0,01) ja parantaa munuaiskudosta. . Patologinen vaurio vähensi p-JAK2/JAK2:n ja p-STAT3/STAT3:n proteiiniekspressiota munuaiskudoksessa (P＜0,01) ja lisäsi SOCS3:n proteiiniekspressiota (P＜0,01). Johtopäätös CPhG:t puuttuvat DKD:hen useiden komponenttien, useiden kohteiden ja useiden reittien kautta, mahdollisesti estämällä JAK2/

STAT3-signalointireitti.

Avainsanat: Cistanche-fenyylietanoliglykosidi; diabeettinen nefropatia; UHPLC-QE-MS; verkko farmakologia; eläinkoe; JAK2 /STAT3-signalointireitti

KUINKA KAUVAN KESTÄÄ, ETTÄ CISTANCHE TOIMII MUNUAISPOTILAATILLE?

Diabeettinen munuaissairaus (DKD), joka on yksi tärkeimmistä diabeteksen mikrovaskulaarisista komplikaatioista, ei ole vain ensisijainen tekijä, joka johtaakrooninen munuaissairausmutta myös pääasiallinen loppuvaiheen munuaissairauden (ESRD) syy maailmanlaajuisesti. Syy [1-2]. DKD:n kliiniseen hoitoon kuuluu pääasiassa ensinnäkin verensokerin, verenpaineen ja veren lipidien hallinta ja toiseksi munuaisten toiminnan suojaaminen, munuaistoksisten lääkkeiden käytön välttäminen ja elämäntapojen parantaminen [3-4]. DKD:n monimutkaisen patogeneesin ja erityisten interventiokohteiden puuttumisen vuoksi nykyisillä hoitovaihtoehdoilla on kuitenkin rajoituksia, eivätkä ne ole tehokkaita. Loppuvaiheen DKD:n ilmaantuvuus kasvaa edelleen. Siksi on erittäin tärkeää löytää tehokkaita luonnollisia lääkkeitä.

Cistanche Deserticola Y. C． äiti taiCistanche C.Kuivatut mehevät varretCistanche tubulosa (Schenk) Wighthilseilevät lehdet [5] kirjattiin ensimmäisen kerran "Shen Nong's Materia Medicaan" ja ne listattiin huippuluokkaan. Ne tunnetaan nimellä "aavikon ginseng" [6]. Ne ovat makeita, suolaisia ​​ja lämpimiä. , palaa munuaisten ja paksusuolen meridiaaneihin, ja sillä on ravitseva munuaisten yang, täydentävä esanssi ja verta, kosteuttava suolistoa ja laksatiivinen vaikutus. Tutkimukset osoittavat, että fenyylietanoidiglykosidit (CPhG) ovat yksi sen tärkeimmistä vaikuttavista ainesosista ja ovat vastuussa sen kehityksestä.

Aineellinen perusta farmakologisten vaikutusten aikaansaamiseksi; Cistanche-uutteella on diabetesta [7-8], maksasyöpää [9], munuaisia ​​suojaavia [10-11], hermostoa suojaavia [12-13] ja muita farmakologisia vaikutuksia, mutta tällä hetkellä CPhG:t eivät ole tehokkaita DKD:n hoidossa. Sen vaikutukset ja mekanismit ovat epäselviä.

Tässä tutkimuksessa käytettiin verkkofarmakologiaa ja molekyylitelakointimenetelmiä [14], otettiin CPhG:t tutkimuskohteena, ennustettiin ja analysoitiin sen tärkeimmät vaikuttavat ainesosat ja mahdolliset kohteet DKD:n hoidossa ja sitten muodostettiin yhdistelmä streptososiinin (STZ) aiheuttamaa korkeaa Lipidirehulla ruokittua DKD-rottamallia käytettiin in vivo -tutkimuksen kohteena antamaan referenssiä siihen liittyvien hoitojen kliiniseen laajentamiseen ja soveltamiseen sekä vaikutusmekanismin lisätutkimukseen.

1 materiaalia

1.1 Eläimet

70-viikon ikäiset urospuoliset SD-rotat, joilla on SPF-taso, paino (240±20) g, ostettiin Xinjiangin lääketieteellisen yliopiston eläinkoekeskuksesta [Kokeellinen eläinten käyttölupa nro SYXK (uusi) {{4} }], klo Eläimiä kasvatettiin adaptiivisesti 1 viikko lämpötilassa (22 ± 2) , suhteellisessa kosteudessa 50 % - 70 % ja 12 h/12 ​​h vuorotellen valon ja pimeyden syklissä. Kokeen hyväksyi Xinjiangin lääketieteellisen yliopiston lääketieteellisen koeeläinkeskuksen eläinetiikkakomitea (eettinen numero IACUC-20220127-19).

1.2 Reagenssit ja lääkkeet

CPhGs (batch number 201610, purity >80 %) toimitti Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. Dapagliflozin (eränumero NB2248) ostettiin AstraZenecalta, UK. Runsaasti sokeria ja rasvaa sisältävä rehu (luettelonro Boaigang-B1135DM) ja STZ (eränumero 2021110307) ostettiin yhtiöltä Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.; virtsan mikroalbumiini (eränumero 20220611), urea typpi (eränumero 20220626), virtsahappo (eränumero 20220613), kokonaiskolesteroli (eränumero 20220615), triglyseridit (eränumero 20220615), triglyseridit (eränumero 20220616), korkea proteiinipitoisuus 20 2020616. ) ja matalatiheyksinen lipoproteiini (eränumero 20220615) ostettiin Nanjing Jiancheng Bioengineering Institutelta; interleukiini-6 (IL-6, eränumero JL20896), interleukiini-1 (IL-1, eränumero JL20884) ja tuumorinekroositekijä- (TNF-, eränumero 13202) ) ostettiin Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.:ltä; JAK2 kanin polyklonaalinen vasta-aine (erä numero 22v9316), p-JAK2 kanin polyklonaalinen vasta-aine (erä numero 78g9360), STAT3 kanin polyklonaalinen vasta-aine (erä numero 15x8824), p-STAT3 kanin polyklonaalinen vasta-aine (erä numero 74mSOCSal78), polyclont kani vasta-aine numero 31d4841) kaikki ostettiin Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.:ltä; HRP-leimattu vuohen anti-kanin IgG polyklonaalinen vasta-aine (eränumero 20000758) ostettiin Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.:ltä; -aktiinin kanin monoklonaalinen vasta-aine (eränumero AC230205001), RIPA-lyysipuskuri (eränumero 20220416), BCA-proteiinipitoisuuden määrityspakkaukset (eränumero 20230401) ostettiin Beijing Solebao Technology Co., Ltd:ltä.

1. 3 Instrumentit

Vanquish ultra-korkean suorituskyvyn nestekromatografia, Q Exactive Focus korkearesoluutioinen massaspektrometri, Heraeus Fresco17 sentrifugi, FC automaattinen mikrolevylukija (Thermo Fisher Scientific, USA); JXFSTPRP-24 hiomakone (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Mingche D24 UV puhdasvesimittari (Saksa Merck Millipore Company); ACQUITY UPLC BEH C18 -kolonni (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm) (American Waters Company); Accu Chek Performa verensokerimittari (Swiss Roche Company); CM1850UV-kryostaatti, DM300 pystysuora fluoresenssimikroskooppi (Leica Company, Saksa); GL-88B pyörremittari (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); elektroninen analyyttinen vaaka (Bio-Rad Company, USA).

2 menetelmää

2. 1 UHPLC-QE-MS-analyysi

2.1.1 Testiliuoksen valmistaminen

Punnitse 100 mg CPhG:tä, lisää 500 μL 80 % metanolia, vorteksoi 30 s, ultraääni jäävesihauteessa 1 h, anna seistä -40 asteessa 1 h, sentrifugoi 4 asteessa , 12 000 r/min 15 min, ime supernatantti, 0. Suodata 22 μm:n mikrohuokoisen kalvon läpi ja säilytä -80 asteisessa jääkaapissa.

2.1.2 Kromatografiset olosuhteet

ACQUITY UPLC BEH C18 -kolonni (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm); liikkuva faasi asetonitriili (A) -1 % muurahaishappoa (B), gradienttieluointi (0 - 11 min, 15 % - 75 % A; 11 - 12 min, 75 - 98 % A; 12 - 14 min, 98 % A 14 - 14,1 min, 98 % - 15 % A 14,1 - 15 %; Tilavuusvirtausnopeus 0 . 5 ml/min; kolonnin lämpötila 35 astetta; injektiotilavuus 5 μl.

2.1.3 Massaspektrometriaolosuhteet

täysi skannaus ddMS2 täysi tarkistustila; vaippakaasun tilavuusvirtausnopeus 45 arb; apukaasun tilavuusvirtausnopeus 15 arb; kapillaarilämpötila 400 astetta ; törmäysenergia NCE-tilassa 15 % ~ 30 % ~ 45 % sykli; suihkujännite ± 4,0 kV.

2.2 Verkkofarmakologian tutkimus

2. 2. 1 CPhGs

Komponenttien kohdeseulonta: Lajittele UHPLC-QE-MS:llä analysoidut kemialliset komponentit suhteellisen sisällön mukaan ja poista ne, joiden kemiallisia rakenteita ei ole vielä määritetty. Syötä seulottujen ainesosien InChIKey-sarjanumero TCMSP-tietokantaan saadaksesi kunkin ainesosan farmakokineettiset parametrit. Ehtojen perusteella, että oraalinen biologinen hyötyosuus (OB) > 30% ja lääkkeen kaltaisuus (DL) > 0,18, vaatimukset täyttävät ehdokkaat seulotaan. Syötä kunkin komponentin SMILES-numero Swiss Target Prediction -tietokantaan ennustaaksesi kohde ja saadaksesi CPhG:n kemiallisen komponentin kohteen.

2. 2. 2 DKD

Taudin kohdeseulonta Käytä "diabeettista nefropatiaa" hakusanana etsiäksesi taudin kohteita OMIM-, GeneCards- ja NCBI-tietokannoista.

2. 2. 3 Komponentti-kohde-tautiverkoston rakentaminen

CPhG:n komponenttien ja sairauksien ristikohteet saatiin R-ohjelmistokartoituksen avulla, ja Cytoscape 3.7.2 -ohjelmistolla rakennettiin komponenttikohdeverkkojärjestelmä, jossa analysointilaajennus havaitsi ydinkohteet.

2. 2. 4 Proteiini-proteiini-vuorovaikutusverkoston (PPI) rakentaminen

Tuo komponenttien ja sairauksien leikkauskohdeproteiinit STRING-tietokantaan, rakenna proteiini-proteiini-vuorovaikutusverkko (PPI), poista proteiinit, joissa ei ole yhdistettyjä solmuja verkossa ja aseta alhaisimman proteiinivuorovaikutuspisteen luottamustasoksi {{1} }.700. Rakenna PPI-verkko, lataa sen TSV-muotoiset tulokset, tuo ne Cytoscape 3.7.2 -ohjelmistoon ja käytä analysointilaajennusta näytön ydinkohteiden lisäämiseen.

2. 2. 5 GO, KEGG-analyysi

Käytä DAVID-tietokannan Functional Annotation -osiota suorittaaksesi rikastusanalyysin komponenttien sairauksien leikkauskohteille. Aseta ensin analyysiparametrit, syötä risteyskohde Gene List -ruutuun, valitse kohteen tunnisteeksi virallinen-geeni-symboli, valitse tietotyypiksi Gene List (Listatyyppi) ja valitse "Homo Sapiens (Laji)". kohdelähde (Laji). Race)", aloita analyysi analyysiparametrien vahvistamisen jälkeen, hanki GO- ja KEGG-analyysitulokset ja käytä sitten ImageGP-verkkopiirustusalustaa KEGG- ja GO-analyysitulosten kuplakaavion piirtämiseen. Cytoscape 3.7.2 -ohjelmisto rakentaa komponentin -target-pathway verkkokuva.

2. 2. 6 Molekyylitelakka

Lataa ensin vaikuttavan aineen 3D-rakennekaavio SDF-muodossa PubChem-tietokannasta, lataa sitten risteyskohteen 3D-rakennekaavio PDB-muodossa US Global Protein Database -tietokannasta (PDB) ja lopuksi lataa se CB-Dockiin. molekyylitelakointisivusto. Seulo hallitsevat telakointimuodot ja visualisoi ne Pymolilla.

2.3 Eläinkokeet

2.3.1 Mallintaminen, ryhmittely ja lääkkeiden anto

1 0 rotta valittiin satunnaisesti normaaliksi ryhmäksi ja ruokittiin tavallisella rehulla, ja loput rotat ruokittiin runsaasti sokeria ja rasvaa sisältävällä rehulla. Kuuden viikon kuluttua heille annettiin kerran vatsaontelonsisäinen injektio 30 mg/kg STZ (0,1 mmol/l STZ liuotettuna pH 4,5 natriumsitraattipuskuriin), ja 72 tuntia myöhemmin häntälaskimosta otettiin verta. paastoverenglukoosin (FBG) havaitsemiseen. Jos FBG on suurempi tai yhtä suuri kuin 16,7 mmol/l, diabeteksen malli luotiin onnistuneesti [15]; jatka Heille syötettiin runsaasti sokeria ja rasvaa sisältävää rehua 2 viikkoa. DKD-mallinnuksen määritettiin onnistuneen virtsan glukoosipositiivisuuden ja 24-tunnin virtsan kokonaisproteiinin (24-UTP) perusteella, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 20 mg. Heistä 3 kuoli mallinnuksen aikana ja 7 epäonnistui. , yhteensä 50 onnistui. Rotat, jotka mallinnettiin onnistuneesti, jaettiin satunnaisesti malliryhmään, dapagliflotsiiniryhmään (1 mg/kg) ja CPhG:n suuren, keskisuuren ja pienen annoksen (500, 250, 125 mg/kg) ryhmiin. Kukin annosteluryhmä annettiin mahalaukunsisäisesti. Normaaliryhmän ja malliryhmän rotille annettiin vastaavat lääkkeet ja normaaliryhmän ja malliryhmän rotille sama määrä normaalia suolaliuosta letkulla kerran päivässä yhteensä 6 viikon ajan. Annostelujakson aikana rotille kussakin ryhmässä normaalia ryhmää lukuun ottamatta jatkettiin runsasrasvaisen rehun antamista.

2.3.2 Biokemiallisen indikaattorin tunnistus

6 viikon CPhG-toimenpiteen jälkeen rotilta kerättiin 24-tunnin virtsa ja mitattiin 24-tunnin kokonaisvirtsan proteiini (24-UTP); verta kerättiin paaston häntälaskimosta FBG-tasojen havaitsemiseksi; veri kerättiin vatsa-aortasta, 4 astetta, 1500 r/min. Sentrifugoi 10 minuuttia seerumin erottamiseksi ja seerumin ureatypen havaitsemiseksi.

BUN), virtsahappo (UA), kokonaiskolesteroli (TC), triglyseridi (TG), korkeatiheyksinen lipoproteiini (HDL), matalatiheyksinen lipoproteiini (LDL).

2.3.3 Munuaiskudoksen patologisen morfologian havainnointi

Rotat nukutettiin natriumpentobarbitaalilla ja tapettiin. Munuaiset kuorittiin pois, punnittiin, kiinnitettiin 4-prosenttisella paraformaldehydillä, kuivattiin, läpinäkyvät, kastettiin vahaan, upotettiin ja leikattiin hematoksyliini-eosiinivärjäystä (HE) varten.

Masson-värjäyksen jälkeen kudoksen morfologiaa tarkkailtiin mikroskoopilla ja Image-Pro Plus 6.0 -ohjelmistoa käytettiin integroidun optisen tiheyden analysointiin ja suhteellisen kollageenikuitualueen kvantifiointiin.

2. 3. 4 ELISA

Menetelmää käytettiin seerumin tulehdustekijöiden tasojen havaitsemiseen rotilla. IL-6-, IL-1- ja TNF-tasot havaittiin pakkauksen ohjeiden mukaisesti.

2. 3. 5 Western blot -menetelmä sukua olevan proteiinin ilmentymisen havaitsemiseksi

Rotan munuaiskudosta otettiin, RIPA-lysaattia lisättiin kokonaisproteiinin uuttamiseksi ja pitoisuus määritettiin BCA-menetelmällä.

Natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesin jälkeen siirrä PVDF-kalvolle ja salpauksen jälkeen JAK2 (1:2000), p-JAK2 (1:1000), STAT3 (1:2000), p-STAT3 (1:2000), SOCS3 (1:2000), -aktiini (1:2000) vasta-aineet, inkuboi 4 asteessa yön yli, lisää HRP-leimattua IgG-sekundaarivasta-ainetta (1:5000) ja inkuboi huoneenlämmössä 1 tunti, kehitetty elektroluminesenssipakkauksella, altistettu proteiinigeelikuvantajalla Image J -ohjelmistolla

Kappaleiden kvantitatiivinen analyysi. Käyttämällä -aktiinia sisäisenä referenssinä kohdevyöhykkeen ja sisäisen vertailuvyöhykkeen harmaa-arvon suhde on suhteellinen proteiinin ilmentyminen.

2.4 Tilastollinen analyysi

Tiedot käsiteltiin SPSS 25.0 -ohjelmistolla ja tiedot ilmaistiin muodossa (x±s). Ryhmien väliseen vertailuun käytettiin yksisuuntaista varianssianalyysiä. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.