Atriplex Canescens on uusi isäntä Cistanche Deserticolalle

Ota yhteyttä: emily.li@wecistanche.com

Fangming Wang et ai

Abstrakti

Cistanche deserticolasitä on perinteisesti käytetty perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä munuaisten (yang) toiminnan täydentämiseen, veren ja esanssin parantamiseen sekä suoliston kostuttamiseen ulosteen poistamiseksi. Sen isäntä, Haloxylon ammodendron, on tärkeä edelläkävijäkasvi, jota käytetään tuulensuojassa ja hiekkadyynien kiinnittämisessä, joita käytetään aavikoitumisen hallintaan. Jo pitkään on katsottu, että C. deserticola voi loistaa vain H. ammodendronia. Tässä tutkimuksessa suoritettiin morfologinen tunnistus, geeniviivakooditunnistus ja rokotuskokeet. Lopulta havaitsimme, että C. deserticola voi myös loistaa Atriplex canescensia. A. canescens on Chenopodiaceae-laji, jolla on laaja sopeutumiskyky. H. ammodendroniin verrattuna sillä on enemmän biomassaa ja laajempi ekologinen sopeutumiskyky, mikä tekee siitä sopivamman C. deserticolan teolliseen tuotantoon. Lisäksi havaitsimme myös, että aktiivisten komponenttien konsentraatio oli korkeampi A. canescensille loistaneissa C. deserticolassa kuin H. ammodendronissa loislajeissa; tämä havainto viittaa lisäksi siihen, että C. deserticolan levittäminen suuremmassa mittakaavassa vaatii lisätutkimusta.

Avainsanat:Cistanche deserticola, Parasitismi, DNA-viivakoodipohjainen tunnistaminen, Perinteinen kiinalainen lääketiede, Cistanche-salsa

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja cistanchesta

1. Esittely

Cistanchen käyttö perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä kirjattiin ensimmäisen kerran Shennong Herbal Scripture -kirjaan sen vaikutusten vuoksi.sävytysmunuainenyang, tehostaatheolemus/verta, jakostutusthesuolethelpottaa ulosteiden kulkeutumista. Se on myös tallennettu muinaisen kasviperäisen lääketieteen teoksiin nimellä "aavikkoginseng'. Cistanche deserticola YC Ma:n ja Cistanche tubulosa (Schenk) Wightin kuivat, mehevät varret ja hilseilevät lehdet ovat olleet ensimmäinen Kiinan farmakopeassa vuonna 2005 kuvattu nivel. Cistanchea kasvatetaan pääasiassa Xingjiangissa, Sisä-Mongoliassa ja Kiinan Gansussa, ja maailmanlaajuisesti sitä tavataan puolikuivilla ja kuivilla alueilla koko Euroopan Iberian niemimaalla, Pohjois-Afrikassa, Arabiassa, Iranissa, Afganistanissa, Pakistanissa, Pohjois-Intiassa, Mongoliassa jne. al. [1]. Se kestää ankaria ympäristöolosuhteita, kuten äärimmäisen kuivaa ilmastoa, voimakkaita lämpötilavaihteluita ja köyhtyvää maaperää [2]. Kiinan korkeampien kasvien taksonomisen indeksin mukaan Kiinassa on kuusi Cistanche-lajia. Lisätutkimus vahvisti kuitenkin vain neljän lajin ja yhden Cistanchen muunnelman olemassaolon, nimittäin C. deserticola YC Ma, C. tubulosa (Schenk) R. Wight, C. salsa (CA Mey.) G. Beck, C. sinensis G. Beck ja C. salsa var. albiflflora PF Tu et ai., [3].

C. deserticolaa pidetään ainoana perinteisenä Cistanchen lähteenä, ja sillä on pitkä käyttöhistoria lääketieteessä Itä-Han-dynastiasta (25–220 jKr) lähtien [4]. Materia Medican kokoelmassa (kirjoittanut Li Shizhen, Ming-dynastia), sen dokumentoitiin pehmentävän yangia (toisin kuin muut yrtit, joilla on voimakkaampi vaikutus). C. deserticolasta on eristetty nykyaikaisilla fytokemiallisilla menetelmillä joukko tehokkaita kemiallisia aineosia, mukaan lukien fenyylietanoidiglykosideja, iridoideja, lignaaneja, alditoleja, oligosakkarideja, polysakkarideja ja alkaloideja. Farmakologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että fenetyyliglykosidi on tärkein aktiivinen komponentti, ja sen on raportoituparantaaseksuaalinentoiminto, ponnistellahermoja suojaavatehosteita, parantaaoppimistajamuisti, jasuojellathemaksa. Sillä on myös terapeuttisia vaikutuksia dementiaan,Alzheimerin tautisairaus, Parkinsonin tauti sairaus, väsymys, jakasvaimianäyttelyiden kanssaanti-tulehduksellinenjaimmunomoduloivaominaisuudet [6, 7].

C. deserticola on pakollinen loiskasvi, joka elää yksinomaan Haloxylon ammodendronin juurissa [8]. Eräässä tutkimuksessa kerrottiin, että C. deserticolaa ei löydy edes Haloxylon persicumista [9]. Viime vuosina C. deserticolaan on kiinnitetty yhä enemmän huomiota, koska se ei ole vain lääketieteellisten ainesosien lähde, vaan myös edistää suuresti aavikoitumisen hallintaa [10]. H. ammodendron on ainoa isäntä, jota on käytetty C. deserticolaan liittyvissä tutkimuksissa. Huhtikuussa 2017 Wang Shuai, Zhejiang Quheng Public Welfare Fundin työntekijä, rokotti C. deserticolan siemeniä Atriplex canescensiin Minqinin aavikkokasvitieteellisessä puutarhassa Gansun maakunnassa, ja C. deserticolan havaittiin kukkivan toukokuussa 2018 ja jatkoi. kukkimaan toukokuuhun 2019 asti. Siemenet ostettiin kuitenkin markkinoilta, ja on kyseenalaista, olivatko ne todella C. deserticolan siemeniä. Lisäksi tämä ilmiö rikkoo perinteistä tietoa, ja sitä on tutkittava lisää

A. canescens on C4-luokan monivuotinen pensas, joka on kotoisin Lounais-Amerikan aavikoista ja sopeutuu nopeasti suolapitoisuuteen, raskasmetalleihin, kuivuuteen ja korkeisiin lämpötiloihin [11]. Koska se on erittäin maukasta ja runsaasti ravinteita, sitä käytetään useimpien kotieläinten ja suurten eläinten rehuna [12]. Lisäksi se on erityisen käyttökelpoinen eroosion torjuntaan ja reunamaiden kunnostamiseen erinomaisen sopeutumiskykynsä ja laajan juuriston ansiosta. Se tuotiin ensimmäisen kerran Kiinaan Yhdysvalloista vuonna 1989, ja sitä on käytetty laajalti maaperän ja veden suojeluun, hiekan kiinnittämiseen ja suolaisen maan ennallistamiseen [13]. Vaikka tutkimus, joka raportoi C. deserticolan kasvusta A. canescensilla, kumoaa yksinomaisen C. deserticolan loiskäsityksen, tämä saattaa osoittautua vallankumoukselliseksi löydökseksi, koska A. canescens sopii paremmin C. deserticolan kasvuun, koska se sillä on enemmän biomassaa ja laajempi ekologinen sopeutumiskyky verrattuna H. ammodendroniin.

Satunnaisen löydön tarkkuuden varmistamiseksi suoritettiin kasvien tunnistus- ja keinorokotuskokeita. Perinteiseen kasvien tunnistamiseen kuuluu organoleptinen arviointi (kuten kosketus, haju, näkö ja maku), morfologisten ominaisuuksien (kuten mikroskooppinen ja makroskooppinen) analyysi ja kemiallinen profilointi (kuten korkean suorituskyvyn nestekromatografia, ohutkerroskromatografia ja kaasu kromatografia) [14]. On suhteellisen helppoa sulkea pois C. tubulosa ja C. Sinensis johtuen koon, värin ja verisuonikimppujen sijoittelun eroista varressa. Todellinen haaste on tehdä ero C. deserticolan ja C. salsan välillä. Kiinan kasviston mukaan C. salsan suojuslehti on noin 1/3 teriivästä, kun taas C. deserticolalla se on yhtä suuri. Mehukkaiden varsien poikkileikkaus on samanlainen C. deserticolan ja C. salsan välillä, ja se koostuu orvaskestä, aivokuoresta, verisuonikimpuista ja sisusta. Suurin ero on verisuonikimpun tupessa, koska se on caudate-muotoinen C. deserticolalla ja kolmiomainen tai puolipyöreä C. salsalla.

Viime vuosina DNA-viivakooditekniikkaa on käytetty usein lajien tunnistamiseen. Se on prosessi, joka käyttää lyhyttä DNA-sekvenssiä standardigenomista, joka on yleensä konservoitunut ja johon ulkoiset tekijät, kuten kasvikudoksen ikä ja tyyppi, eivät vaikuta. Kasvin DNA-viivakoodien suositut ehdokassekvenssit ovat rbcL, matK, psbA-trnH, ITS ja ITS2 [15]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ITS/ITS2 on tehokkain kasvien tunnistustyökalu. On myös ehdotettu, että ITS2-alue tulisi sisällyttää ydinviivakoodeihin, koska sen erottelukyky on suurempi kuin plastidiviivakoodien. On hyväksytty, että ITS2:ta voitaisiin käyttää uutena yleisenä viivakoodina useiden kasvitaksonien tunnistamiseen [16, 17, 18, 19, 20, 21]. Vaikka monissa tutkimuksissa on yritetty tunnistaa universaali kasviviivakoodi, mikään saatavilla olevista lokuksista ei toimi kaikissa lajeissa, joten monipaikkamenetelmä on välttämätön kasvilajien erottamiseksi [22, 23, 24, 25, 26, 27, 28] . Tässä tutkimuksessa viivakoodeina käytettiin ITS2, rbcL, psbA-trnL.

Morfologisten ja molekyylien tunnistustekniikoiden lisäksi suoria todisteita saadaan rokotuskokeista. Inokulaatiokokeet on suoritettava sen osoittamiseksi, että C. deserticola voi loistaa A. canescensiä. Tunnistamisen lisäksi laadunvalvonta tulee ensisijaiseksi huomioksi. Lisätutkimuksia tarvitaan, jotta voidaan varmistaa ero H. ammodendronin juurella loistetun C. deserticolan ja A. canescensin loislajin välillä.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Kasvimateriaalit

Cistanche kasvaa pehmeillä hiekkamailla, joissa on lievä suolapitoinen maa, loistaen yleensä isännän 30–100 cm syvyydessä sivujuurissa. Sopivan kasvualueen ilmasto on kuiva, vähemmän sateinen, haihtuu runsaasti, auringonpaistetta on pitkät ja päivän ja yön lämpötilaero on suuri. Minqinin piirikunta ja Baiyingin kaupunki ovat näiden näytteiden keräyspaikat. Ne ovat maantieteellisesti lähellä, ja niissä on lauhkea mannermainen ja kuiva ilmasto, keskimääräinen vuotuinen sademäärä 113,2 mm ja keskimääräinen vuotuinen suhteellinen kosteus 44 prosenttia. Tarkat ja yksityiskohtaiset näytteenottotiedot on esitetty taulukossa 1. Kaikki näytteet pakastettiin ja säilytettiin -20 C:ssa State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs Labissa Pekingissä, Kiinassa.

2.2. Kudosvärjäys ja tarkkailu

Tuoreet näytteet otettiin ja säilytettiin liuoksessa, joka sisälsi 70 prosenttia etanolia, jääetikkaa ja formaldehydiä suhteessa 90:5:5, ja dehydratoitiin käyttämällä etanoligradienttia (75 prosenttia, 95 prosenttia, 100 prosenttia, 100 prosenttia). 1 tunnin ajan. Kuivatut leikkeet altistettiin ksyleenigradientille (25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 100 %) 1 tunnin ajan läpinäkyvien leikkeiden saamiseksi. Läpinäkyvät osat alistettiin parafiiniinfiltraatiolle, jolloin ksyleeniä sisältävä tilavuus parafiinia lisättiin näytettä sisältävään ksyleeniin, puolet saadusta liuoksesta imettiin sitten ulos ja sama tilavuus parafiinia lisättiin uudelleen. Tämä prosessi toistettiin 10 kertaa, ja lopuksi kaikki liuokset imettiin ulos ja korvattiin yhtä suurella tilavuudella parafiinia; tämä viimeinen vaihe toistettiin kahdesti ja kunkin vaiheen jälkeen saatua liuosta inkuboitiin 1 tunti 75 °C:ssa. Parafiiniinfiltraation jälkeen leikkeet upotettiin, jolloin näytteet asetettiin rautasäiliöön, joka sisälsi nestemäistä parafiinia ja lisää nestemäistä parafiinia. lisätään nopeasti täyttämään koko säiliö ja jätettiin jähmettymään. Tuloksena oleva vahalohko leikattiin ja leikattiin. Upotetut osat asetettiin lämpimään veteen, viimeisteltiin, asetettiin objektilasille ja inkuboitiin 45 °C:ssa 30 minuuttia. Objektilasin osista poistettiin vaha liottamalla ne 100-prosenttisessa ksyleenissä, 100-prosenttisessa ksyleenissä, 50-prosenttisessa ksyleenissä, 50-prosenttisessa ksyleenissä, 100-prosenttisessa etanolissa, 100-prosenttisessa etanolissa, 100-prosenttisessa etanolissa, 95-prosenttisessa etanolissa ja 75-prosenttisessa etanolissa ja liotettiin sitten safraniinissa. min. Tätä seurasi toinen sarja, nopea liotus 75-prosenttisessa etanolissa ja 95-prosenttisessa etanolissa, ja sitten objektilasit upotetaan nopeasti vihreään 1 minuutiksi. Lopuksi leikkeille suoritettiin viimeinen sarjaliotus 95-prosenttisessa etanolissa, 95-prosenttisessa etanolissa, 100-prosenttisessa etanolissa, 100-prosenttisessa etanolissa, 50-prosenttisessa ksyleenissä, 50-prosenttisessa ksyleenissä ja 100-prosenttisessa ksyleenissä. Leikkeiden värjäyksen jälkeen objektilasille laitettiin pisara hartsiliimaa ja peitelasi asetettiin sen päälle. Objektilasit jätettiin häiritsemättä viikon ajan, ja kudosleikkeitä tarkkailtiin optisella Olympus-mikroskoopilla ja kuvattiin.

2.3. DNA:n uutto ja PCR-monistus

Kokonaisgenominen DNA uutettiin kukkanäytteistä käyttämällä kasvien genomisen DNA:n uuttosarjaa (Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Peking, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alukkeet geenin monistamista ja sekvensointia varten sekä reaktio-olosuhteet on esitetty taulukossa 2. Kukin geenin monistaminen toistettiin kolmesti kullekin näytteelle.

2.4. Sekvensointianalyysi

Tarkkojen sekvenssien saamiseksi lopulliset PCR-tuotteet kloonattiin erikseen pEASY®-Blunt Cloning Vektoreihin valmistajan ohjeiden mukaisesti sen jälkeen, kun ne oli puhdistettu käyttämällä Transgene Quick Gel Extraction Kits -pakkauksia. Kloonauksen jälkeen ne transformoitiin kemiallisesti kompetenteiksi Trans5ɑ-soluiksi. Kolme pesäkettä kustakin näytteestä valittiin satunnaisesti ja sekvensoitiin käyttämällä M13-alukkeita. Nämä pesäkkeet sekvensoitiin kaksisuuntaisesti Sanger-sekvensoinnilla käyttämällä BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit -sarjoja ABI Prism 3700 DNA-analysaattoreissa. Saadut sekvenssit rinnastettiin käyttämällä Clustal X:ää (v1.8.7) [29] ja synkronoitiin manuaalisesti BioEditissä (v7.1.3.0) [30]. Kohdistettua sekvenssidataa käyttäen rekonstruoimme filogenian MEGA 7 -ohjelmistolla naapuriliitosmenetelmää (NJ) käyttäen, Kimura 2-parametrimallia (K2P) käytettiin ja bootstrap oli 1000 toistoa [31].

2.5. C. deserticolan rokottaminen

Kolme grammaa C. deserticolan siemeniä lisättiin hiekkamaata sisältäviin ruukkuihin (halkaisija korkeus pohjan halkaisija ¼ 20 cm- 20 cm-12 cm) ja sekoitettiin tasaisen leviämisen varmistamiseksi. Kontrolliryhmä koostui 3 g:sta C. salsan siemeniä, jotka oli lisätty samanlaisiin hiekkamaata sisältäviin ruukkuihin. Lopuksi A. canescens istutettiin jokaiseen ruukkuun ja ruukut asetettiin ulos. Kun maaperän kosteuspitoisuus on alle 13 prosenttia (g/g), ruukut kasteltiin. Koe suoritettiin Zhongguancun Life Science Parkissa, Pekingissä, Kiinassa (leveysaste 39-560 N, pituusaste 116 200 E; 20 m merenpinnan yläpuolella) toukokuusta heinäkuuhun. Päivälämpötila vaihteli 16 ja 35 C välillä, yölämpötila 12 ja 16 -C välillä. Ilman suhteellinen kosteus on yli 50 prosenttia. Auringonvaloa on runsaasti. Noin 80 päivää myöhemmin ruukuista poistettiin maa ja siirrostusnopeus määritettiin.

2.6. Lääkekomponenttien pitoisuuden määrittäminen

Lääkekomponenttien pitoisuuden määrittäminen sisältää kaksi osaa, joista toinen on nestekromatografian menetelmä ja toinen vertailuaineen ja testiaineen valmistus, tarkemmat tiedot ovat seuraavat:

i). Ekinakosidin ja verbaskosidi-ekinakosidin ja verbaskosidin määritys punnittiin ja lisättiin 50-prosenttisessa metanolissa, jolloin saatiin 0,2 mg/ml liuos, jota käytettiin vertailuliuoksena. Ensimmäinen on jauhaa kuiva C. deserticola jauheeksi, jauhe sekoitettiin 50 ml:aan 50-prosenttista metanolia 100 ml:n ruskeassa mittapullossa, ja testineste saatiin sen jälkeen, kun seosta oli ravisteltu ja liotettu. , ultraäänikäsittely, seisominen ja suodatus. Kromatografinen pylväs oli Agilent ZORBAX SB-C18 -kolonni (4,6 mm 150 mm, 5 μm), jossa metanoli (A) - 0,1 % muurahaishappoliuos (B) liikkuvana faasina, gradienttieluointi (0-17 min, 26,5 prosenttia A; 17–20 min, 26,5 prosenttia → 29,5 prosenttia A; 20–27 min, 29,5 prosenttia A), virtausnopeus oli 1,0 ml/min, kolonnin lämpötila 35 C, detektioaallonpituus 330 nm, injektiotilavuus oli 10ul.

ii). Betaiinin, mannitolin, fruktoosin, glukoosin ja sakkaroosin määritys Betaiini, mannitoli, fruktoosi, glukoosi ja sakkaroosi punnittiin tarkasti ja lisättiin veteen, jolloin saatiin {{0}},25 mg/ml liuos, joka oli käytetään vertailuliuoksena. Viisi millilitraa edellä mainittua Cistanchen testiliuosta sekoitettiin 5 0-prosenttiseen metanoliin 25 ml:n mittapullossa, ravisteltiin hyvin ja suodatettiin 0,2 μm:n mikrohuokoisella kalvolla. Kromatografiakolonni oli SHODEXASHAIPAK NH2P-50 4E-polymeroitu geelikolonni (250 mm 4,6 mm, 5 μm), liikkuva faasi asetonitriili-vesi (77:23), virtausnopeus 0,7 ml/min, kolonnin lämpötila oli 25 C, Haihduttavalla valonsirontadetektorilla (ELSD) drift-putken lämpötila oli 100 C, kantokaasun virtausnopeus 3 l/min, vertailuaineen ja näytteen injektiotilavuus 5 ul.

3. Tulokset

3.1. Kukkien morfologinen tunnistaminen

A. canescensin loislajin Cistanche-lajin vahvistamiseksi kukkanäytteiden morfologinen analyysi suoritettiin (kuva 1 ja kuva S1). Loiskasvin kukkien yleinen morfologia oli samanlainen kuin C. deserticolalla. Lisäksi teriö oli paksumpi kuin C. salsan eri isännillä. Flora of China:n mukaan C. deserticolalla ja C. salsalla on ilmeisiä eroja kukkien lehtisuussa. C. deserticolassa suojuslehti on pienempi kuin teräslehti, kun taas C. salsa -suojuslehti on 1/3 lehden pituudesta. Tilastollisen analyysimme perusteella A. canescensin ja C. deserticolan loislehdet olivat pienempiä kuin teriä (kuva S2). A. canescensin Cistanche osoitti C. deserticolan morfologisia piirteitä, mikä viittaa siihen, että C. deserticola saattaa olla A. canescensin loinen.

Kuva 1. Cistanche-kukkien morfologiset piirteet. (A) Cistanche deserticola (isäntä: Haloxylon ammodendron); (B) Cistanche (isäntä: Atriplex canescens); (C) Cistanche salsa (isäntä: Sympegma regelii); (D) Cistanche salsa (isäntä: Salsola passerina).

3.2. Värjättyjen kudosnäytteiden mikroskooppinen tunnistaminen

C. deserticolan mehevän varren poikkileikkaus on hyvin samanlainen kuin C. salsan, ja ne molemmat koostuvat orvaskesta, aivokuoresta, verisuonikimpusta ja sisusta. Molempien kasvien verisuonikimput on järjestetty aaltoileviin tai syviin aaltoileviin renkaisiin, ja juuret ovat selvästi näkyvissä. Suurin ero on verisuonikimpun vaipan lateraalisessa muodossa; se on caudate C. deserticolassa ja kolmiomainen tai puolipyöreä C. salsassa. Suorittaessamme mikrorakenneanalyysin Cistanchelle, joka loisti A. canescensillä, havaitsimme, että sillä oli hännän muotoinen verisuonikimpputuppi, joka muistutti C. deserticolan vastaavaa (kuvio 2).

Kuva 2. Mehukkaan varren mikroskooppiset ominaisuudet eri Cistanche-lajeissa. (A) Cistanche deserticolan mehevän varren mikroskooppiset ominaisuudet: 1. orvaskesi, 2. aivokuori, 3. lehtikimppu, 4. verisuonikimppu, 5. ydinsäde, 6. verisuonikimpun tuppi, 7. floeemi, 8. ksyleemi , 9. ydin. (B) Suurennettu kuva Cistanche deserticolan verisuonikimpusta: 1. verisuonikimpun vaippa, 2. kuitu, 3. proliinisolut, 4. niinikuitu, 5. floeemi, 6. ksyleemi, 7. suoni, 8. nylon. (C) Cistanche salsan mehevän varren mikroskooppiset ominaisuudet: 1. orvaskesi, 2. lehtien jälkikimppu, 3. aivokuori, 4. verisuonikimppu, 5. ydinsäde, 6. ydin. (D) Suurennettu kuva Cistanche salsan verisuonikimpusta: 1. verisuonikimpputuppi, 2. proliinisolut, 3. kuitu, 4. floeemi, 5. suoni, 6. ksyleemi. (E) Atriplex canescensille loistetun Cistanchen mehevän varren mikroskooppiset ominaisuudet. (F) Suurennettu kuva Atriplex canescens -suonessa loistaneesta Cistanchen verisuonikimpusta 1. suoni, 2. ksyleemi, 3. kambium, 4. floeemi, 5. verisuonikimpputuppi.

3.3. Molekyylitunnistus

Morfologisen tunnistamisen lisäksi suoritimme myös molekyylitunnistuksen ja valitsimme kolme geenifragmenttia, nimittäin ITS2:n, rbcL:n ja psbA-trnL:n. Evoluutiopuu rakennettiin käyttämällä kunkin fragmentin sekvenssitietoja (kuvio 3), ja kaikki kolme fylogeneettistä puuta osoittivat, että Cistanchella, joka loisti A. canescensillä, oli läheinen fylogeneettinen suhde C. deserticolaan. Nämä tulokset osoittavat, että C. deserticola voi olla A. canescensin loinen. Yksityiskohtaisia ​​geenieroja eri Cistanche-lajien välillä havaittiin useiden sekvenssien rinnastamisen yhteydessä (kuvio 4). Löysimme kolme yhden nukleotidin polymorfismia (SNP) ITS2-geenirungosta C. deserticolan ja C. salsan väliltä, ​​emäksistä 139, 295 ja 472. RbcL-geenirungossa C. deserticolan ja C. salsan välillä oli neljä geenieroa. salsa, joka sisältää kaksi SNP:tä ja kaksi insertio- ja deleetiomutaatiota (indel). Verrattuna ITS2:een ja rbcL:ään, erot psbA-trnL-geenirungossa C. deserticolan ja C. salsan välillä olivat selvempiä, ja sekvenssipoikkeavuuksia oli seitsemän, joista neljä oli SNP:tä ja kolme InDel-mutaatioita. Erityisesti sarjaa tymiinitoistoja, jotka alkavat kohdistetun sekvenssin emäksestä 414, voitaisiin käyttää kehittämään yksinkertaisia ​​sekvenssitoistomarkkereita (SSR) C. deserticolan ja C. salsan erottamiseksi.

3.4. C. deserticolan rokottaminen

Sen testaamiseksi, voisiko C. deserticola tai C. salsa loistaa A. canescensiä, suoritettiin rokotuskoe, ja löysimme todisteita loisista kaikista C. deserticolalla rokotetuista ruukuista, joiden siirrostusaste oli lähes 100 prosenttia (kuva 5). Kontrolliryhmissä ei havaittu loisia. Tämä tulos osoittaa suoraan, että C. deserticola loisti helposti A. canescensissä, kun taas C. salsa ei voinut.

3.5. Merkittävien lääkekomponenttien pitoisuuden määrittäminen

Arvioimme tärkeiden lääkeaineosien pitoisuuden A. canescensille loistetussa C. deserticolassa. Tarkka kromatogrammi on esitetty lisämateriaalissa. Tarkkojen tulosten saamiseksi suoritettiin neljä riippumatonta koetta. Mittauksiemme (taulukko 3) perusteella havaitsimme, että verbaskosidin ja ekinakosidin pitoisuus oli 20 kertaa suurempi kuin Kiinan farmakopeassa (Kiinan farmakopean mukaan ekinakosidin pitoisuuksien summan prosenttiosuus) ja verbaskosidin C. deserticolassa tulisi olla alle 0,30 prosenttia ). Konsentraatiot olivat myös merkittävästi korkeammat kuin H. ammodendronilla loistetussa C. deserticolassa (yleensä 0,2–1,5 prosenttia) [32]. Mannitolin, betaiinin, fruktoosin ja muiden hiilihydraattikomponenttien pitoisuus oli myös erittäin korkea, ja kokonaislaatu oli parempi kuin H. ammodendronilla loistetussa C. deserticolassa. Näin ollen nämä tulokset osoittavat, että A. canescensiä voidaan käyttää C. deserticolan kasvattamiseen teollisella tasolla ja uhanalaisten luonnonvarojen suojelemiseen.

4. Keskustelu

Aikaisemmin C. deserticolan on katsottu loistavan yksinomaan H. ammodendronissa. Tässä tutkimuksessa osoitimme kuitenkin käyttämällä morfologisia ja molekyylien tunnistustekniikoita, että C. deserticola voi myös loistaa A. canescensissä. Vaikka H. ammodendron, A. canescens ja H. persicum kuuluvat kaikki Chenopodiaceae-heimoon, on mielenkiintoista ja omituista, että C. deserticolalla on lajiselektiivisyys, jota mahdollisesti säätelevät isännän erittämät signaalimolekyylit. Amerikan yhdysvalloista peräisin oleva A. canescens vastustaa voimakkaasti ympäristön häiriöitä ja sillä on suhteellisen suuri biomassa. A. canescens on elinkelpoinen isäntä C. deserticolalle useista syistä. Ensinnäkin se voi selviytyä erilaisissa ympäristöolosuhteissa. Toiseksi C. deserticolan biomassa ja kasvunopeus voivat olla suurempia ja vastaavasti nopeampia A. canescensillä kuin H. ammodendronilla. Kolmanneksi, koska A. canescensin sopeutumiskyky on laaja, istutusaluetta voidaan edelleen laajentaa. Siten A. canescensillä on erityisiä etuja H. ammodendroniin verrattuna isäntänä ja se auttaa C. deserticolan teollista tuotantoa.

C. deserticola ja C. salsa on vaikea erottaa toisistaan, ja morfologinen tunnistaminen on aikaisemmin tuottanut hämmentäviä tuloksia. Molekyylibiologian alan edistymisen myötä molekyylipohjaisia ​​tunnistustekniikoita on käytetty laajalti kiinalaisessa kasviperäisessä lääketieteessä. Koska useimmat kiinalaiset kasviperäiset lääkkeet tarjoavat vain vähän genomitietoa, DNA-viivakooditekniikasta on tullut läpimurto tunnistustekniikka. Tässä tutkimuksessa morfologista ja DNA-viivakooditekniikkaa sovellettiin kattavasti tuntemattomien sistancheslajien tunnistamiseen; tätä ei ole yritetty aiemmin, ja tuloksemme osoittavat, että tämä lähestymistapa on toteutettavissa.

Koska C. deserticola loistaa A. canescensissä, on tärkeää määrittää erot C. deserticolan laadussa A. canescentin juurissa ja H. ammodendronin juurissa. Tulostemme mukaan aktiivisten komponenttien konsentraatio oli korkeampi A. canescensillä loistetussa C. deserticolassa kuin H. ammodendronilla loistetussa. Siten tuloksemme luovat vankan teoreettisen perustan A. canescensille loistetun C. deserticolan laajamittaiselle tuotannolle.

5. Johtopäätökset

C. deserticolan on pitkään katsottu loistavan yksinomaan H. ammodendronia. Aikaisemmin todettiin, että markkinoilta ostetut C. deserticola -siemenet voivat loistaa A. canescensiä,

Chenopodiaceae-kasvi. Käyttämällä morfologisia ja molekulaarisia tunnistusmenetelmiä vahvistimme, että A. canescensiä loistava Cistanche-laji oli C. deserticola. Tämä tulos vahvistettiin edelleen rokotuskokeella. Määritimme merkittävien lääkeaineosien pitoisuudet, ja tuloksemme viittaavat siihen, että komponenttien pitoisuus ja laatu olivat suurempia A. canescensille loistetussa C. deserticolassa kuin H. ammodendronissa loislajissa. Uusien isäntien löytäminen voi edistää C. deserticolan teollista tuotantoa, ja se voi myös suojella tehokkaasti luonnonvaroja ja ekologista ympäristöä.

Viitteet
[1] DY Tan, QS Guo, CL Wang, Tutkimus Cistanche deserticolan status quosta ja sen hyödyntämisestä ja hyödyntämisestä Kiinassa, For. Resurssi. Manag. 33 (2004) 29–32.
[2] XY Qiao, HL Wang, YH Guo, tutkimus Cistanchen siementen itämisolosuhteista, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32 (2007) 1848–1850.
[3] PF Tu, YP He, ZC Lou, Tutkimus Chinchen Cistanchen alkuperästä ja luonnonvarojen suojelusta. Tradit. Yrtti. Drugs 25 (1994) 205-208.
[4] LD Karalliedde, CT Kappagoda, Perinteisten kiinalaisten lääkkeiden haaste allopaattisille harjoittajille, Am. J. Physiol. Sydän Circ. Physiol. 297 (2009) 1967–1969.
[5] Y. Jiang, PF Tu, Cistanche-lajin kemiallisten ainesosien analyysi, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 1970–1979.
[6] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, "aavikon ginseng": arvostelu, Am. J. Chin. Med. 40 (2012) 1123–1141.
[7] Farmakopoa NCOC, Kiinan kansantasavallan farmakopea, The Chemical Industry Press, Peking, 2020.
[8] GX Meng, XS Cui, Y. Wu, YH Guo, Leveillula saxaoulin vaikutukset kasvuun, klorofylliin ja Haloxylon ammodendronin hiilihydraattiin, North. Hortic. 14 (2012) 141–143.
[9] YC Chen, M. Li, MZ Wu, YX Song, juurten rakenne ja koostumus kahdessa Haloxylon Bunge -lajissa, Plant Physiol. J. 49 (2013) 1273–1276.
[10] PF Tu, Y. Jiang, YH Guo, YZ Tian, ​​et ai., Cistanches herban ekologisen teollisuuden kehittäminen läntisen autiomaa-alueen ekologisen sivilisaation edistämiseksi, Mod. Leuka. Med. 4 (2015) 297–301.
[11] SC Sanderson, HC Stutz, Korkeat kromosomimäärät Mojavean ja Sonoran autiomaassa Atriplex canescens (Chenopodiaceae), Am. J. Bot. 81 (1994) 1045–1053.
[12] JL Peterson, DN Ueckert, RL Potter, JE Huston, Ekotyyppinen vaihtelu valituissa nelisiipisissä suolapensaspopulaatioissa Länsi-Texasissa, J. Range Manag. 40 (1987) 361-366.
[13] DS Kong, Atriplex canescensin morfologiset ominaisuudet ja ekofysiologinen sopeutumiskyky: katsaus, Chin. J. Ecol. 32 (2013) 210–216.
[14] MA Bashir, MS Faezah, SSO Mohd, W. Alina, Review: DNA-viivakoodien ja kromatografian sormenjäljet ​​kasviperäisten lääkkeiden autenttistamiseen. Evid. Perustuva täydennys, vaihtoehto. Med. 2017 (2017) 1.–28.
[15] XW Li, Y. Yang et ai., Plant DNA Barcoding: from gene to genom, Biol. Rev. 90 (2015) 157–166.
[16] SL Chen, H. Yao, JP Han, et ai., Validation of the ITS2-alueen uusi DNA-viivakoodi lääkekasvilajien tunnistamiseen, PloS One 5 (2010), e8613.
[17] K. Luo, SL Chen, KL Chen, et ai., Assessment of ehdokaskasvin DNA-viivakoodit käyttäen Rutaceae-perhettä, Sci. China Life Sci. 53 (2010) 701–708.
[18] T. Gao, H. Yao, JY Song et ai., Fabaceae-heimon lääkekasvien tunnistaminen käyttämällä mahdollista DNA-viivakoodia ITS2, J. Ethnopharmacol. 130 (2010) 116–121.
[19] T. Gao, H. Yao, JY Song, et ai., Evaluating DNA-kandidaattiviivakoodien käytön toteutettavuus suuren Asteraceae-perheen erottavissa lajeissa, BMC Evol. Biol. 10 (2010) 324.
[20] XH Pang, JY Song, YJ Zhu, et ai., DNA-viivakoodien käyttö Euphorbiaceae-lajin tunnistamiseen, Planta Med. 76 (2010) 1784–1786.
[21] XH Pang, JY Song, YJ Zhu et ai., Kasvien DNA-viivakoodien soveltaminen Rosaceae-lajin tunnistamiseen, Cladistics 27 (2011) 165–170.
[22] PD Hebert, EH Penton, JM Burns, DH Janzen, W. Hallwachs, Kymmenen lajia yhdessä: DNA-viivakoodaus paljastaa salaperäisiä lajeja neotrooppisessa kippariperhosessa Astraptes fulguration, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 14812–14817.
[23] MW Chase, RS Cowan et ai., Ehdotus standardoiduksi protokollaksi kaikkien maakasvien viivakoodaamiseksi, Taxon 56 (2007) 295–299.
[24] WJ Kress, DL Erickson, Kahden lokuksen globaali DNA-viivakoodi maakasveille: koodaava rbcL-geeni täydentää ei-koodaavaa trnH-psbA-välikealuetta, PloS One 2 (2007) e508.
[25] DL Erickson, J. Spouge, A. Resch, et ai., DNA-viivakoodaus maakasveissa: standardien kehittäminen menestyksen maksimoimiseksi, Taxon 57 (2008) 1304–1316.
[26] NC Kane, Q. Cronk, Kasvitiede ilman rajoja: viivakoodi fokusoituna, Mol. Ecol. 17 (2008) 5175–5176.
[27] R. Lahaye, M. van der Bank, D. Bogarin, et ai., DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 (2008) 2923–2928.
[28] N. Kane, S. Sveinsson, H. Dempewolf, et ai., Ultra-barcoding in cacao (Theobroma spp.; Malvaceae) käyttäen kokonaisia ​​kloroplastigenomeja ja tuman ribosomaalista DNA:ta, Am. J. Bot. 99 (2012) 320–329.
[29] JD Thompson, TJ Gibson, F. Plewniak, F. Jeanmougin, DG Higgins, The CLUSTAL_X windows interface: joustavat strategiat useiden sekvenssien rinnastukseen laatuanalyysityökalujen avulla, Nucleic Acids Res. 25 (1997) 4876–4882.
[30] TA Hall, BioEdit: käyttäjäystävällinen biologisen sekvenssin kohdistuksen editori ja analyysiohjelma Windows 95/98/NT, Nucl. Acids Symp. Ser. 41 (1999) 95-98.
[31] S. Kumar, M. Nei, J. Dudley, K. Tamura, MEGA: biologikeskeinen ohjelmisto DNA- ja proteiinisekvenssien evoluutioanalyysiin, lyhyt. Bioinform. 9 (2008) 299–306.
[32] PF Tu, B. Wang, T. Deyama, ZG Zhang, ZC Lou, Herba cistanchiksen fenyylietanoidiglykosidien analyysi RP-HPLC:llä, Acta Pharm. Sinica. 32 (1997) 294-300.