ASK1-inhibiittori NQDI-1 vähentää oksidatiivista stressiä ja neuroapoptoosia ASK1/p38- ja JNK-signaalireitin kautta rottien subaraknoidaalisen verenvuodon jälkeisessä varhaisessa aivovauriossa, osa 1

Abstrakti. Oksidatiivinen stressi ja neuroapoptoosi ovat keskeisiä patologisia prosesseja subarachnoidaalisen verenvuodon (SAH) jälkeen. Tässä tutkimuksessa arvioitiin apoptoosin signaalia säätelevän kinaasi 1:n (ASK1) inhibiittorin etyyli-2,7-diokso-2,7-dihydro-3H-nafton (1,2, 3-de) kinoliini1-karboksylaatti (NQDI-1) varhaisessa aivovauriossa (EBI) SAH:n jälkeen rottamallissa. Yhteensä 191 rottaa käytettiin ja SAH-malli indusoitiin käyttämällä monofilamenttiperforaatiota. Western blottausta käytettiin myöhemmin proteiinien endogeenisten ilmentymistasojen havaitsemiseksi. Immunofluoresenssia käytettiin sitten vahvistamaan ASK1:n hermosolujen sijainti. Lyhyen aikavälin neurologinen toiminta arvioitiin käyttämällä modifioituja Garcia-pisteitä ja säteen tasapainotestiä 24 tuntia SAH:n jälkeen, kun taas pitkäaikaista neurologista toimintaa arvioitiin käyttämällä rotarod-testiä ja Morris-vesilabyrinttitestiä. Neuronien apoptoosi arvioitiin TUNEL-värjäyksellä ja oksidatiivinen stressi arvioitiin dihydroetidiumvärjäyksellä 24 tuntia SAH:n jälkeen. Fosforyloidun (p-)ASK1:n ja ASK1:n proteiinin ilmentymistasot nousivat SAH:n jälkeen. NQDI-1 injektoitiin aivokammioon 1 tunti SAH:n jälkeen, ja se osoitti merkittäviä parannuksia sekä lyhyen että pitkän aikavälin neurologisessa toiminnassa ja vähensi merkittävästi oksidatiivista stressiä ja hermosolujen apoptoosia. NQDI-1:n injektio aiheutti merkittävän laskun p-ASK1:n, p-p38:n, p-JNK:n, 4 hydroksynoneaalin ja Baxin proteiinin ilmentymistasoissa ja lisäsi merkittävästi hemioksygenaasi 1:n ja Bcl-2:n proteiinin ilmentymistasoja. p38-estäjän BMS-582949 tai JNK-estäjän SP600125 käyttö johti p-p38:n tai p-JNK:n proteiinin ilmentymistasojen merkittävään laskuun, ja oksidatiivisen stressin ja hermosolujen apoptoosin merkittävään vähenemiseen; nämä estäjät eivät kuitenkaan osoittaneet vaikutusta p-ASK1- tai ASK1-proteiinin ilmentymistasoihin. Yhteenvetona voidaan todeta, että hoito NQDI-1:llä paransi neurologista toimintaa ja vähensi oksidatiivista stressiä ja hermosolujen apoptoosia EBI:ssä SAH:n jälkeen rotilla, mahdollisesti estämällä ASK1-fosforylaatiota ja ASK1/p38- ja JNK-signalointireittiä. NQDI-1:tä voidaan pitää mahdollisena aineena SAH-potilaiden hoidossa.

Cistanchen glykosidi voi myös lisätä SOD:n aktiivisuutta sydämen ja maksan kudoksissa ja vähentää merkittävästi lipofussiinin ja MDA:n pitoisuutta kussakin kudoksessa, poistaen tehokkaasti erilaisia ​​reaktiivisia happiradikaaleja (OH-, H₂O₂ jne.) ja suojaamalla DNA-vaurioilta. OH-radikaalien toimesta. Cistanche-fenyylietanoidiglykosideilla on vahva vapaita radikaaleja poistava kyky, suurempi pelkistyskyky kuin C-vitamiini, ne parantavat SOD:n aktiivisuutta siittiösuspensiossa, vähentävät MDA-pitoisuutta ja niillä on tietty suojaava vaikutus siittiöiden kalvon toimintaan. Cistanche-polysakkaridit voivat lisätä SOD:n ja GSH-Px:n aktiivisuutta D-galaktoosin aiheuttamien kokeellisesti vanhenevien hiirten punasoluissa ja keuhkokudoksissa sekä vähentää MDA- ja kollageenipitoisuutta keuhkoissa ja plasmassa sekä lisätä elastiinipitoisuutta. hyvä huuhteluvaikutus DPPH:lle, pidentää hypoksian aikaa vanhenevilla hiirillä, parantaa SOD:n aktiivisuutta seerumissa ja viivyttää keuhkojen fysiologista rappeutumista kokeellisesti vanhenevilla hiirillä Solumorfologisen rappeutumisen yhteydessä kokeet ovat osoittaneet, että Cistanchella on hyvä antioksidanttikyky ja sillä on potentiaalia olla lääke ihon ikääntymisen sairauksien ehkäisyyn ja hoitoon. Samaan aikaan Cistanchen ekinakosidilla on merkittävä kyky poistaa DPPH-vapaita radikaaleja ja se voi poistaa reaktiivisia happilajeja, estää vapaiden radikaalien aiheuttaman kollageenin hajoamisen ja sillä on myös hyvä korjaava vaikutus tymiinin vapaiden radikaalien anionivaurioihin.

Napsauta Anti-aging Cistanche Para Que Serve

【Lisätietoja: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Avainsanat: subarachnoidaalinen verenvuoto, NQDI-1, apoptoosin signaalia säätelevä kinaasi 1, oksidatiivinen stressi, apoptoosi, varhainen aivovaurio

Johdanto

Subaraknoidaalinen verenvuoto (SAH) on vakava akuutti aivoverisuonisairaus, jonka aiheuttaa veren virtaus aivojen subaraknoidaalitilaan (1). Tällä hetkellä ei kuitenkaan ole saatavilla tehokkaita lääkkeitä, jotka parantaisivat aivokudosvaurioita SAH:n jälkeisen verenvuodon estämisen jälkeen (2). Siksi tarvitaan kiireellisesti lisätutkimuksia SAH:n jälkeisen aivovaurion mekanismeista ja sopivien hoitovaihtoehtojen kartoittamista SAH:n ennusteen parantamiseksi.

Varhainen aivovaurio (EBI) tarkoittaa sekundaarista aivokudosvauriota, joka johtuu useista fysiologisista häiriöistä ja useista patologisista muutoksista, jotka tapahtuvat 72 tunnin sisällä SAH:n alkamisesta (3). SAH:n jälkeisessä akuutissa vastevaiheessa vamma alkaa suurten verimäärien tunkeutumisesta subarachnoidaalitilaan ja sitä seuraa joukko patologisia vammoja (4). Koska mitokondriot ovat erityisen herkkiä hypoksialle ja iskeemiselle vauriolle, mitokondrioiden toimintahäiriö on yksi tärkeimmistä SAH:n jälkeen koetuista patologisista vammoista (5). Suuria määriä reaktiivisia happilajeja (ROS) vapautuu, mikä johtaa oksidatiivisen stressin voimistumiseen ja mitokondrioiden apoptoottisen reitin aktivoitumiseen, mikä aiheuttaa mitokondrioiden vaurioita ja toimintahäiriöitä (6). Siksi terapeuttiset menetelmät, jotka vähentävät oksidatiivista stressiä ja apoptoosia, ovat avainasemassa SAH:n ennusteen parantamisessa.

Apoptoosisignaalia säätelevä kinaasi 1 (ASK1), joka on mitogeeniaktivoidun proteiini 3 -kinaasi (MAP3K) -perheen jäsen, aktivoituu useiden erityyppisten solustressien vaikutuksesta, ja sillä on tärkeä rooli oksidatiivisessa stressissä ja apoptoosissa (7). Hiiren hippokampuksen hermosolujen primääriviljelmissä Rho-kinaasi-inhibiittori fasudiili kumoaa -amyloidin aiheuttaman fosforyloidun (p-)ASK1:n nousun, mikä vähentää hermosolujen apoptoosia Alzheimerin taudissa (8). Tietojemme mukaan SAH:n jälkeen ASK1:een kohdistuvia hoitovaihtoehtoja ei kuitenkaan ole arvioitu.

Etyyli-2,7-diokso-2,7-dihydro-3H-nafto(1,2,3-de)kinoliini1-karboksylaatin (NQDI-1) on raportoitu olevan spesifinen ASK1:n estäjä, ja se on validoitu käyttämällä in vitro kinaasimäärityksiä (9, 10). Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että NQDI-1 voi olla tehokas useiden sairauksien hoidossa estämällä ASK1-aktiivisuutta (11, 12). NQDI-1 lievittää mikrokystiini-LR:n aiheuttamaa mitokondriovauriota ja apoptoosia munasarjojen granulosasoluissa estämällä ASK1:n aktivaatiota (13). Lisäksi indometasiini voi indusoida apoptoottisia kaskadivasteita gliasoluissa endoplasmisen retikulumin stressin ASK1-aktivoinnin kautta (14). Siksi ASK1-spesifinen estäjä NQDI-1 voi aiheuttaa hermostoa suojaavia vaikutuksia SAH:n jälkeen estämällä ASK1-aktiivisuutta. p38:n ja JNK:n katsotaan muodostavan ASK1:n alavirran signalointireitit; aktivoitu p38 ja JNK voivat edelleen aktivoida erilaisia ​​substraatteja, mukaan lukien tuman transkriptiotekijät sekä proteiinikinaasit ja muut toiminnalliset proteiinit, mikä johtaa oksidatiivisen stressin ja apoptoosin puhkeamiseen (15).

Oletuksena oli, että ASK1-estäjällä NQDI-1 on hermostoa suojaavia vaikutuksia ja se vähentää oksidatiivista stressiä ja neuroapoptoosia ASK1/p38- ja JNK-signalointireitin kautta EBI:ssä SAH:n jälkeen rotilla.

Materiaalit ja menetelmät

Koeeläimet.Eläinkokeet hyväksyi Central South Universityn koeeläinten eettinen komitea (hyväksyntänumero 2019sydw0104). Yhteensä 191 urospuolista Sprague-Dawley (SD) -rottaa, jotka painoivat 280-320 g, pidettiin vakiolämpötilassa (21-23 ˚C) ja kosteudessa (45-50 prosenttia) ympäristössä 12/12 tunnin valo/pimeysjaksolla. ja sai vapaasti vettä ja ruokaa. Kaikki eläinkokeet suoritettiin Animal Research: Reporting In vivo Experiments -ohjeiden (16) mukaisesti, ja ne suoritettiin National Institutes of Healthin (NIH) Guide for the Care and Use of Animals -ohjeiden mukaisesti (17). Kun rotat saavuttivat kokeen ennalta asetetun ajankohdan tai täyttivät tietyt eutanasiakriteerit [täydellinen ruokahaluttomuus 24 tunnin ajan tai huono ruokahalu (50 prosenttia alle normaalin) 3 päivän ajan, kyvyttömyys syödä tai juoda, tai niiden arvioitiin olevan lähellä kuolemaa (itse vahingoittava käyttäytyminen, epänormaali asento, hengitysvaikeudet jne.)], rotat asetettiin hiilidioksidin eutanasialaitteeseen, jonka CO2-tilavuuden siirtymänopeus asetettiin arvoon 30 prosenttia/min (18). Kuolema vahvistettiin hengityksen ja sydämen sykkeen lakkaamisen ja pupillien laajentumisen vuoksi. Kaikkien rottien ruhot pakastettiin ja pakastettiin ympäristöystävällistä hävittämistä varten.

SAH malli. The rat SAH model was induced using monofil‑  ment perforation (19). After anesthetizing the rats (induction,  3% isoflurane; maintenance, 2% isoflurane), the left common,   internal and external carotid arteries of the rats were exposed.  The distal external carotid artery was clipped using cauterize‑ to form the stump of the external carotid artery. A 3‑cm   sharpened model 4‑0 proline wire was inserted ~2 cm through the external carotid artery until a slight resistance was felt. The puncture line was slowly advanced by ~3 mm to puncture the arterial wall. Brain tissue was removed at the corresponding time points predetermined for the experiment. If a blood clot was found on the ventral side of the brain tissue, it indicated that the rat had SAH. Rats with a score >8 arvioiden SAH-arvostelupisteiden katsottiin täyttävän kokeelliset vaatimukset ja olevan onnistunut malli. Menettely valeryhmälle oli samanlainen kuin SAH-ryhmässä, sillä poikkeuksella, että 4-0 proliinilanka ei lävistynyt valtimon seinämään. Hengitystä, sykettä, ihon väriä ja poljinrefleksiä tarkkailtiin 5 minuutin välein koko kirurgisen ja anestesian toipumisvaiheen ajan. Näistä 23 rottaa kuoli ja 8 rottaa suljettiin pois, ja näitä kuolemia ja poissulkemisia täydennettiin uusilla SAH-mallinnetuilla rotilla.

SAH:n vakavuus.SAH:n vakavuus arvioitiin SAH-luokituspisteillä 24 tuntia SAH:n jälkeen (20). Aivokudoksen vatsapuoli jaettiin kuuteen alueeseen, joista kunkin arvo oli 0-3 veritulpan määrästä ja verisuonten peittävyydestä riippuen: Pistemäärä 0 tarkoittaa, ettei hyytymistä, 1 tarkoittaa pientä hyytymismäärää, 2 tarkoittaa kohtalaista hyytymää, mutta suuret verisuonet kallon pohjassa ovat edelleen tunnistettavissa, ja 3 tarkoittaa suurta määrää hyytymiä ja tunnistamattomia verisuonia kallon pohjassa. Kuusi alueellista pistettä laskettiin yhteen kokonaispistemäärän (0–18) laskemiseksi, missä korkeammat pisteet osoittivat vakavampaa verenvuotoa. Rotilla, joiden SAH:n kokonaispistemäärä oli pienempi tai yhtä suuri kuin 8, katsottiin olevan lievä SAH, suljettiin pois myöhemmistä kokeista ja korvattiin vasta mallinnetuilla rotilla.

Lääkkeiden hallinto.Jotta lääkeainepitoisuuksia aivokudoksessa voitaisiin säädellä tarkemmin maksasta ja muista tekijöistä riippumatta, siRNA:t ja NQDI-1 annettiin intraserebroventrikulaarisella injektiolla (21). Nukutuksen jälkeen (induktio, 3 % isofluraania; ylläpito, 2 % isofluraania) rotat kiinnitettiin aivojen stereotaksiseen laitteeseen. Mikroinjektori kiinnitettiin bregmaan 1.{5}} takapuolelle, 1,5 oikealle ja 3,3 mm:n syvyyteen. ASK1 siRNA (luettelonumero 4390771; Thermo Fisher Scientific, Inc.) tai Scr siRNA -kontrolli (luettelonro 4390843; Thermo Fisher Scientific, Inc.) liuotettiin 5 µl:aan nukleaasivapaata steriiliä deionisoitua vettä pitoisuudessa 500 pmol ja annettu 48 tuntia ennen SAH:ta. ASK1 siRNA:n sekvenssit olivat seuraavat: Sense 5'-CGG CAGACAUUGUUAUCAAtt-3' ja antisense 5'-UUGAUA ACAAUGUCUGCCGtc-3'. Tässä tutkimuksessa käytettyjen pitoisuuksien määrittämiseen käytettiin samankaltaisessa tutkimuksessa raportoituja lääkepitoisuuksia ja -annoksia (22) sekä NQDI-1:n liukoisuutta. Kolme annosta NQDI-1:tä (1, 3 ja 10 µg/kg; Selleck Chemicals) tai vehikkeliliuosta kokonaistilavuudessa 5 µl/rotta injektoitiin 1 tunti SAH:n jälkeen. BMS-582949 (100 mg/kg; Selleck Chemicals), SP600125 (30 mg/kg; Selleck Chemicals) ja vehikkeliliuokset saattoivat ylittää veri-aivoesteen, ja ne annettiin intraperitoneaalisesti 1 tunti SAH:n jälkeen (23,24).

Lyhytaikainen neurologinen toiminta.Modifioituja Garcia-pisteitä ja säteen tasapainopisteitä käytettiin arvioimaan lyhytaikaista neurologista toimintaa 24 tuntia SAH:n jälkeen. Muokattu Garcia-pistemäärä jaettiin kuuteen kategoriaan seuraavasti: Vapaaehtoinen liike, vapaaehtoiset raajan liikkeet, etukäpälän ojennus, kiipeilykyky, somatosensoriset vasteet ja lonkerovasteet, joista jokainen pisteytettiin erikseen ja laskettiin yhteen kokonaispistemääräksi 3–18. (25). Korkeampien pisteiden katsottiin osoittavan parempaa neurologista toimintaa. Säteen tasapainoa varten rotat asetettiin säteen päälle 1 minuutiksi, ja pisteet vaihtelivat välillä 0-4 arvioitiin kävellyn matkan perusteella (26). Korkeampien pisteiden katsottiin osoittavan parempaa neurologista toimintaa.

Pitkäaikainen neurologinen toiminta.Rotarodin esisopeutumiskokeita suoritettiin rotilla käyttäen samaa alkunopeutta ja kiihtyvyyttä ennen SAH-mallinnusta. Rotat asetettiin Rotamex-pyörivän tankotesteriin (Columbus Instruments) Rotarod-testiä varten päivinä 7, 14 ja 21 SAH:n jälkeen (27). Ensin Rotarodin alkunopeus asetettiin 5 kierrokseen minuutissa ja kiihtyvyys 2 kierrokseen 5 sekunnissa. Rottien pukemisen jälkeen rottien putoamisviive kirjattiin. Sitten rottien annettiin levätä 1 tunti. Lopuksi rottien putoamislatenssi testattiin uudelleen alkunopeudella 5 kierrosta minuutissa ja kiihtyvyydellä 2 kierrosta 5 sekunnissa. Pidemmän putoamisviiveen katsottiin osoittavan parempaa motorista koordinaatiota rotalla. Viikolla 4 SAH-mallinnuksen jälkeen Morris-vesilabyrinttitestiä käytettiin rottien oppimismuistin ja avaruudellisen orientaation arvioimiseen (27). Uimisen oppimisharjoitus ja vedenpinnan alapuolella sijaitsevan alustan löytäminen suoritettiin päivästä 1 päivään 5 viikolla 4 (päivät 28-33 SAH:n jälkeen) ja uintirata, pakolatenssi ja uimamatka kirjattiin. Viimeisenä päivänä alusta poistettiin testausta varten, ja uintirata, uintimatka ja koettimen neljänneksen kesto tallennettiin 60 sekunnin ajan.

JOS värjäytyminen.Perfuusion jälkeen peräkkäin 4 °C suolaliuosta ja 4 °C:ta, 4 prosenttia paraformaldehydiä sydämestä veren poistamiseksi aivokudoksesta, saatiin ehjä aivokudos. Sakkaroosigradienttidehydratoinnin jälkeen aivokudos leikattiin sitten 10 µm:n osiin koronaasennossa ja säilytettiin -20 ˚C:ssa. IF-värjäystä käytettiin arvioimaan ASK1:n ja hermosolujen samanaikainen sijainti. Jäädytetyt kudosleikkeet blokattiin käyttämällä 5-prosenttista aasin seerumia (luettelonro G1217-5ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) 2 tunnin ajan huoneenlämmössä ja inkuboitiin yön yli 4 ˚C:ssa primääristen vasta-aineiden kanssa seuraavasti: Anti-ASK1 (hiiri; 1:200; luettelonro 67072-1-Ig; ProteinTech Group, Inc.), anti-NeuN (kani; 1:200; luettelonro 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc.) , anti-ionisoitu kalsiumia sitova adapterimolekyyli-1 (Iba-1; kani; 1:200; luettelonro 10904-1-AP; ProteinTech Group, Inc.) ja anti-gliafibrillaarinen hapan proteiini (GFAP; kana) 1:200; luettelonro ab4674; Abcam). Kudosleikkeitä inkuboitiin sitten 2 tuntia huoneenlämpötilassa vastaavien fluoresoivien sekundaaristen vasta-aineiden kanssa seuraavasti: Alexa Fluor® 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H plus L) (luettelonro 715-585-150; 1:500) ; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H plus L) (luettelonro 711-545-152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) ja Alexa Fluor 4888 AffiniPure Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H plus L) (luettelonro 703-545-155; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Myöhemmin ne värjättiin solutumien suhteen käyttämällä 2 µg/ml DAPI:ta (luettelonro G1012-100ML; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Leikkeet arvioitiin käyttämällä Olympus BX53 -fluoresenssimikroskooppia (Olympus Corporation) ja kuvat otettiin.

Dihydroetidium (DHE) värjäys.DHE-värjäys suoritettiin aivojen oksidatiivisen stressin arvioimiseksi (28). Jäädytettyjä aivokudosleikkeitä inkuboitiin 2 µmol/l DHE:n kanssa (Thermo Fisher Scientific, Inc.) 37 °C:ssa 30 minuuttia pimeässä. Sen jälkeen, kun solutumat oli värjätty käyttämällä 2 ug/ml DAPI:tä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, leikkeet arvioitiin käyttämällä Olympus BX53 -fluoresenssimikroskooppia. Yhteensä kuusi leikettä kustakin aivokudoksesta valittiin satunnaisesti ja kuusi aluetta kustakin osasta valittiin satunnaisesti kuvantamista varten. DHE-positiivisten solujen lukumäärä laskettiin käyttämällä ImageJ 1.4 -ohjelmistoa (National Institutes of Health), ja keskiarvo laskettiin ja otettiin lopullisiksi prosenttiosuuksiksi jokaiselle aivokudosleikkaukselle.

TUNEL-värjäys.TUNEL-värjäystä käytettiin apoptoottisten neuronien prosenttiosuuden arvioimiseen (29). Jäädytetyt kudosleikkeet blokattiin käyttämällä 5-prosenttista aasin seerumia 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa primaarisen anti-NeuN-vasta-aineen kanssa (kani; 1:200; luettelonro 26975-1-AP; ProteinTech Group, Inc. .). Kudosleikkeitä inkuboitiin sitten fluoresoivan sekundaarisen vasta-aineen Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H plus L) kanssa (luettelonro 711-545-152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) 2 tuntia huonelämpötilassa. TUNEL-värjäys suoritettiin käyttämällä One Step TUNEL Apoptosis Assay -pakkausta (luettelonro C1090; Beyotime Institute of Biotechnology) valmistajan protokollan mukaisesti. Lopuksi kudosleikkeet värjättiin soluytimien suhteen käyttämällä 2 ug/ml DAPI:tä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. TUNEL-laskentapaikkojen satunnainen valinta ja TUNEL-positiivisten neuronien laskeminen kullekin jaksolle suoritettiin käyttämällä edellä mainittua DHE-laskentamenetelmää.

Länsi blotting (WB).WB:tä käytettiin proteiinin ilmentymistasojen puolikvantifiointiin. Kun 4 °C:n suolaliuosta perfusoitiin sydämestä veren poistamiseksi aivokudoksesta, saatiin ehjä aivokudos. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että SAH-malli, joka on indusoitu vasemmanpuoleisella endovaskulaarisella punktiolla, johtaa jonkinasteiseen vinoutumiseen verenvuototapahtumiin ja voi olla suhteellisen vakava vasemman puolen aivokudoksen vaurioiden kannalta (30). Siksi vasemmanpuoleista aivokudosta käytettiin patologisen vaurion arvioimiseen SAH-mallinnuksen jälkeen. Aivokudosproteiinit uutettiin käyttämällä RIPA-lyysiliuosta (luettelonro P0013B; Beyotime Institute of Biotechnology) valmistajan protokollan mukaisesti. Näytteiden proteiinipitoisuus määritettiin BCA-määrityksellä (luettelonro P0012; Beyotime Institute of Biotechnology) ja säädettiin sen jälkeen arvoon 5 µg/µl lisäämällä eri määriä kahdesti tislattua vettä. 5 µl 5 µg/µl proteiininäytteitä lisättiin jokaiseen kaistaan ​​ja nämä proteiininäytteet erotettiin 10 prosentin geeleillä SDS-PAGE-elektroforeesilla ja siirrettiin PVDF-kalvoille. Kalvot estettiin 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa käyttämällä 5 % rasvatonta maitojauhetta (luettelonro P0216-300 g; Beyotime Institute of Biotechnology). Kalvoja inkuboitiin yön yli 4 ˚C:ssa primaaristen vasta-aineiden kanssa seuraavasti: Anti-p-ASK1 (Ser-83; 1:1, 000; luettelonro MA5-28020; Thermo Fisher Scientific, Inc. .), anti-ASK1 (1:1, 000; luettelonro 8662; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (1:1) ,000; luettelonro 9216; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-p38 MAPK (1:1, 000; luettelonro 8690; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-fosfostressi-aktivoitu proteiinikinaasi / Jun-aminoterminaalinen kinaasi (fosfo-SAPK/JNK) (Thr183/Tyr185; 1, 000; luettelonro 9255; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-SAPK/JNK (JNK; 1:1, 000; luettelonro 9252; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-4 hydroksynonaali (4-HNE; 1:1 ,000; luettelonro ab46545; Abcam), anti-hemioksigenaasi 1 (HO-1; 1:1, 000; luettelonro 82206; Cell Signaling Technology, Inc.), anti-Bcl-2 (1:1, 000; luettelonro 26593-1-AP; ProteinTech Group, Inc.), anti-Bax (1,1000; luettelonro 60267-1-Ig; ProteinTech Group, Inc.) ja anti-aktiini (1:2, 000; luettelonro 4970; Cell Signaling Technology, Inc.). Tätä seurasi inkubointi asianmukaisten piparjuuriperoksidaasilla konjugoitujen sekundaaristen vasta-aineiden kanssa 2 tunnin ajan huoneenlämmössä: Vuohen anti-hiiri-IgG-HRP (luettelonro sc-2005; 1:5, 000; Santa Cruz Biotechnology) , Inc.) tai vuohen anti-kani IgG-HRP (luettelonro sc-2004; 1:5 000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), ja tietyt juovat visualisoitiin käyttämällä ECL-sarjaa (luettelonro P0018AS; Beyotime Institute of Biotechnology) ja kuvattu UVP Che Studio PLUS -järjestelmällä (Analytik Jena GmbH). WB-vyöhykkeiden suhteellinen densitometrinen analyysi suoritettiin ImageJ 1.4 -ohjelmistolla (NIH) ja proteiinien ilmentymistasot normalisoitiin -aktiinia vastaan.

Kokeellinen suunnittelu

ASK1:n ilmentymismuutokset ja lokalisointi soluihin SAH:n jälkeen. Yhteensä 36 rottaa jaettiin satunnaisesti kuuteen ryhmään (n=6/ryhmä) seuraavasti: i) valeleikkaus (huijaus), ii) 3 h SAH:n jälkeen, iii) 6 h SAH:n jälkeen, iv. ) 12 h SAH:n jälkeen, v) 24 h SAH:n jälkeen ja vi) 72 h SAH:n jälkeen. WB:tä käytettiin arvioimaan muutoksia endogeenisen ASK1:n ja p-ASK1:n proteiinien ilmentymistasoissa. Yhteensä 4 muuta rottaa jaettiin näennäisryhmiin (n=2) ja SAH 24 h (n=2) ja IF-värjäystä käytettiin arvioimaan ASK1:n yhteislokalisaation.

ASK1-estäjän NQDI-1:n terapeuttiset vaikutukset lyhyen ja pitkän aikavälin neurologiseen toimintaan SAH:n jälkeen. Yhteensä 30 rottaa jaettiin 5 ryhmään (n=6/ryhmä) seuraavasti: i) Huijaus, ii) SAH plus vehikkeli, iii) SAH plus 1.0 µg /kg NQDI-1, iv) SAH plus 3.{12}} µg/kg NQDI-1 ja v) SAH plus 10.0 µg/kg NQDI-1. Modifioituja Garcia- ja säteen tasapainopisteitä käytettiin lyhytaikaisen neurologisen toiminnan arvioimiseen 24 tuntia SAH:n jälkeen. Lyhyen aikavälin neurologisen paranemisen laajuuden perusteella 3,0 µg/kg NQDI-1 arvioitiin sopivimmaksi annosryhmäksi ja tätä NQDI-1-annosta käytettiin myöhemmissä kokeissa. Yhteensä 30 rottaa jaettiin 3 ryhmään (n=10) seuraavasti: i) Huijaus, ii) SAH plus vehikkeli ja iii) SAH plus NQDI-1. Rotarod-kokeella arvioitiin pitkäaikaista neurologista toimintaa päivinä 7, 14 ja 21 SAH:n jälkeen, ja Morris-vesilabyrinttitesti tehtiin viikolla 4 SAH:n jälkeen pitkän aikavälin neurologisen toiminnan arvioimiseksi.

ASK1-estäjän NQDI-1:n terapeuttiset vaikutukset oksidatiiviseen stressiin ja apoptoosiin. Yhteensä 12 rottaa jaettiin 3 ryhmään (n=4/ryhmä) seuraavasti: i) Sham, ii) SAH plus vehikkeli ja iii) SAH plus NQDI-1. (THE)-värjäys suoritettiin oksidatiivisen stressin arvioimiseksi ja TUNEL-värjäystä käytettiin hermosolujen apoptoosin arvioimiseen 24 tuntia SAH:n jälkeen.

ASK1/p38- ja JNK-signalointireitin rooli NQDI-1:n terapeuttisissa vaikutuksissa. Yhteensä 48 rottaa jaettiin 8 ryhmään (n=6/ryhmä) seuraavasti: i) Vale, ii) SAH, iii) SAH plus vehikkeli, iv) SAH plus NQDI-1, v) SAH plus sekoitettu (Scr) lyhyt häiritsevä (si)RNA, vi) SAH plus ASK1 siRNA, vii) SAH plus BMS-582949 ja viii) SAH plus SP600125 ryhmät. ASK1 siRNA, p38-inhibiittori BMS-582949 ja JNK-inhibiittori SP600125 injektoitiin sen arvioimiseksi, osallistuivatko ASK1, p38 ja JNK NQDI-1:n hermoja suojaaviin vaikutuksiin.

Tilastollinen analyysi. Tiedot esitettiin keskiarvona ± standardipoikkeama ja WB:n kokeelliset tiedot saatiin 6 riippumattomassa toistossa, kun taas DHE-värjäys ja TUNEL-värjäys suoritettiin 4 itsenäisenä toistona. Tiedot analysoitiin käyttämällä SPSS-versiota 17 (SPSS, Inc.). Morris-vesilabyrinttitestin tiedot arvioitiin käyttämällä sekoitettua ANOVA:ta/kaksisuuntaista toistettujen mittausten ANOVAa, jota seurasi LSD post hoc -testi. Muiden kokeiden tietojen normaalijakauma testattiin käyttämällä Shapiro-Wilkin normaalijakaumatestiä, jota seurasi yksisuuntainen ANOVA ja Tukeyn post hoc -monivertailutesti. Kaaviot piirrettiin käyttämällä GraphPad Prism 7:ää (GraphPad Software, Inc.). P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

Tulokset

Kuolleisuus ja SAH:n vakavuus. Tässä tutkimuksessa käytettiin yhteensä 191 SD-rottaa, joista 8 rottaa suljettiin pois vain lievän SAH:n vuoksi (SAH-luokituspisteet pienempi tai yhtä suuri kuin 8). Kokeissa käytetyistä SD-rotista 34 rotta kuului valeryhmään ja 149 rotalle tehtiin SAH-mallinnus. Yksikään valeryhmässä oleva rotta ei kuollut; kuitenkin 23 rottaa kuoli SAH-mallinnuksen jälkeen (kuolleisuus 15,4 prosenttia) (taulukot SI-V). Verrattuna valeryhmään, subarachnoidaalisen tilan hyytymät sijaitsivat ensisijaisesti lähellä Willis-rengasta ja tyvivaltimon molemmilla puolilla SAH-mallinnuksen jälkeen (kuva 1A). SAH-luokituspisteet 24 tuntia SAH-mallinnuksen jälkeen eivät osoittaneet merkitsevää eroa verenvuodon vakavuudessa kaikkien ei-huijausryhmien välillä eikä merkitsevää eroa vale- ja ei-huijausryhmien välillä (kuva 1B).

ASK1:n proteiiniekspression muutokset ja lokalisaatio soluihin SAH:n jälkeen. ASK1:n proteiinin ilmentymistasot lisääntyivät ja saavuttivat huippunsa 24 tunnin kohdalla aivoissa SAH:n jälkeen (kuvat 1 C ja D). Kuitenkaan p-ASK1/ASK1:n proteiiniekspression suhde ei osoittanut merkittävää eroa (kuvio 1C ja E). ASK1:n lokalisoituminen soluihin NeuN-positiivisten neuronien, Iba-1-positiivisten mikroglioiden ja GFAP-positiivisten astrosyyttien kanssa osoitettiin sekä vale- että SAH-24 tunnin ryhmässä (kuva 1F-H).

ASK1-estäjä NQDI-1 parantaa lyhytaikaisia ​​neurologisia toimintoja 24 tuntia SAH:n jälkeen. NQDI-1 (1, 3 ja 10 µg/kg) injektoitiin intraserebroventrikulaarisesti 1 tunti SAH:n jälkeen. Rotilla, joille tehtiin SAH-mallinnus, oli huomattavasti alhaisemmat modifioidut Garcia- ja säteen tasapainopisteet 24 tuntia SAH-mallinnuksen jälkeen; kuitenkin kaikki kolme NQDI-1-annosta johtivat merkittävään osittaiseen parantumiseen lyhytaikaisessa neurologisessa toiminnassa (kuvat 2A ja B). Muunnetut Garcia-pisteet olivat merkittävästi korkeammat SAH plus NQDI-1 (30 µg/kg) ryhmässä verrattuna SAH plus NQDI-1 (10 µg/kg) -ryhmään; tilastollisesti merkitseviä eroja ei kuitenkaan osoitettu verrattuna SAH plus NQDI-1 (10.0 µg/kg) -ryhmään (kuvat 2A ja B), mikä viittasi siihen, että NQDI-1-pitoisuuden lisääminen edelleen eivät paranna lyhytaikaista neurologista toimintaa SAH:n jälkeen. Siksi NQDI-1:tä (3,0 µg/kg) pidettiin tehokkaana optimaalisena pitoisuutena ja sitä käytettiin myöhemmissä kokeissa.

ASK1-estäjä NQDI-1 parantaa pitkäaikaisia ​​neurologisia toimintoja SAH:n jälkeen. Käytettäessä Rotarod-testin aloitusnopeuksia 5 tai 10 rpm, putoamisviive pieneni merkittävästi SAH plus vehikkeliryhmässä valeryhmään verrattuna, kun taas putoamislatenssi piteni merkittävästi intraserebroventrikulaarisen NQDI-1-injektion jälkeen verrattuna SAH plus vehikkeliryhmään verrattuna. ryhmä (kuvat 2C ja D). Lisäksi Morris-vesilabyrinttitestin harjoitusvaiheen päivinä 1–5 viikolla 4 SAH:n jälkeen SAH plus vehikkeliryhmä osoitti merkittävästi pidemmän pakenemislatenssin ja uimamatkan valeryhmään verrattuna, kun taas NQDI-1-hoito osoitti merkittävä lasku verrattuna SAH plus vehikkeliryhmään (kuva 2E-G). Testausvaiheessa, jossa vedenalainen pyöreä alusta poistettiin, ei havaittu merkittäviä eroja uintinopeudessa kolmen ryhmän välillä (kuva 2H). Koetinneljänneksen kesto oli merkittävästi lyhyempi SAH plus vehikkeliryhmässä verrattuna valeryhmään ja NQDI-1-hoito pidensi merkittävästi tutkimusaikaa SAH plus vehikkeliryhmään verrattuna (kuva 2I).

ASK1-estäjä NQDI-1 vähentää oksidatiivista stressiä ja hermosolujen apoptoosia 24 tuntia SAH:n jälkeen. Oksidatiivisen stressin taso mitattiin DHE-värjäyksellä ja apoptoottisten hermosolujen osuus arvioitiin käyttämällä TUNEL-positiivisten neuronien prosenttiosuutta 24 tuntia SAH:n jälkeen. DHE-positiivisten solujen prosenttiosuus oli merkittävästi korkeampi SAH- ja vehikkeliryhmässä verrattuna valeryhmään, ja NQDI-1-hoito vähensi tätä merkittävästi verrattuna SAH- ja vehikkeliryhmään (kuvio 3A ja). TUNEL-positiivisten neuronien prosenttiosuus oli merkittävästi korkeampi SAH- ja vehikkeliryhmässä verrattuna valeryhmään. TUNEL-positiivisten hermosolujen prosenttiosuus kuitenkin väheni merkittävästi NQDI-1-hoidon jälkeen verrattuna SAH- ja vehikkeliryhmään (kuvat 3B ja D).

ASK1 siRNA, BMS-582949 ja SP600125 parantavat lyhytaikaisia ​​neurologisia toimintoja 24 tuntia SAH:n jälkeen. Verrattuna SAH plus Scr siRNA -ryhmään tai SAH plus vehikkeliryhmään, ASK1 siRNA:n, BMS-582949:n tai SP600125:n antaminen osoitti merkittävää parannusta muunnetussa Garciassa ja säteen tasapainossa (kuvat 4A ja B).

NQDI-1 heikentää oksidatiivista stressiä ja apoptoosia SAH:n jälkeen vähentämällä ASK1:n, p38:n ja JNK:n fosforylaatiota. ASK1-, p-p38-, p-JNK-, 4-HNE-, HO-1-, Bax- ja Bcl-2-proteiinien ilmentymistasot olivat merkittävästi korkeammat SAH:n jälkeen verrattuna valeryhmään; p-ASK1/ASK1-suhde ei kuitenkaan ollut merkitsevästi erilainen (kuvio 5A-M). Vehikkelin tai Scr-siRNA:n injektio ei aiheuttanut merkittäviä eroja proteiinin ilmentymistasoissa SAH-ryhmään verrattuna. Verrattuna SAH plus vehikkeliryhmään, hoito NQDI-1:llä aiheutti merkittävän laskun p-ASK1/ASK1-, p-p38-, p-JNK-, 4-HNE- ja Bax-proteiinien ilmentymistasoissa, kun taas HO:n proteiiniekspressiotasot -1 ja Bcl-2 lisääntyivät merkittävästi. Verrattuna SAH plus Scr siRNA -ryhmään, ASK1:n proteiinin ilmentymistasot laskivat merkittävästi ASK1 siRNA:n injektion jälkeen. Käsittely ASK1 siRNA:lla johti myös p-p38:n, p-JNK:n, 4-HNE:n ja Baxin proteiinin ilmentymistasojen merkittävään laskuun ja HO-1:n ja Bcl-2:n ilmentymisen merkittävään lisääntymiseen verrattuna SAH:n ja Scr:n siRNA:han. ryhmä.

p38-estäjä BMS-582949 vähentää p-p38:n proteiinin ilmentymistasoja, mutta ei vaikuta p-ASK1-, ASK1- tai p-JNK-proteiinin ilmentymistasoihin. Hoito p38-inhibiittorilla BMS-582949 osoitti p-p38-, 4-HNE- ja Bax-proteiinin ilmentymistasojen merkittävää laskua ja myös merkittävästi lisännyt HO-1:n ja Bcl-2:n proteiiniekspressiota verrattuna SAH- ja vehikkeliryhmään verrattuna; ASK1:n, p-ASK1/ASK1:n ja p-JNK:n proteiinin ilmentymistasot eivät kuitenkaan osoittaneet merkittäviä eroja (kuvio 6A-M). JNK-estäjä SP600125 alentaa p-JNK:n proteiinin ilmentymistasoa, mutta ei vaikuta p-ASK1-, ASK1- tai p-p38-proteiinin ilmentymistasoihin. Hoito JNK-estäjällä SP600125 aiheutti merkittävän laskun p-JNK:n, 4-HNE:n ja Baxin proteiinien ilmentymistasoissa ja lisäsi merkittävästi HO-1- ja Bcl-2-proteiinin ilmentymistasoja SAH- ja vehikkeliryhmään verrattuna; ASK1-, p-ASK1/ASK1- ja p-p38-proteiinin ilmentymistasot eivät kuitenkaan muuttuneet merkittävästi (kuvio 7A-M).

【Lisätietoja: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】