Cistanche Deserticolasta peräisin olevien fenyylietanoidien antioksidanttiset vaikutukset

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Quanbo Xiong / Shigetoshi Kadota", Tadato Tani, 6 ja Tsuneo Namba"

Asetoni-H2O (9:1) -uute Cistanche deserticolan varresta osoitti voimakasta vapaita radikaaleja poistavaa aktiivisuutta. Tästä uutteesta eristettiin yhdeksän pääasiallista fenyylietanoidiyhdistettä. Ne tunnistettiin NMR:llä akteosidiksi, isoakteosidiksi, l^asetyylilakteosidiksi, tubulosidi B:ksi, ekinakosidiksi, tubulosidi A:ksi, syringalidi A 3z-a-ramnopyranosidiksi, cistanosidiksi A ja cistanosidiksi F. Kaikki nämä yhdisteet osoittivat voimakkaampia vapaita radikaaleja poistavia aktiivisuuksia. -tokoferoli 1,1 -difenyyliI-2-pikrylhydratsy 1 (DPPH) -radikaalissa ja ksantiini/ksantiinioksidaasin (XOD) synnyttämässä superoksidianioniradikaalissa (Oj). Yhdeksästä yhdisteestä isoakteosidi ja tubulosidi B, joiden kofeoyyliosa on glukoosin d'-asemassa, osoittivat estävää vaikutusta XOD:hen. Tutkimme edelleen näiden fenyylietanoidien vaikutuksia lipidien peroksidaatioon rotan maksan mikrosomeissa entsymaattisten ja ei-entsymaattisten menetelmien indusoimana. Kuten odotettiin, jokainen niistä esti merkittävää sekä askorbiinihappo/Fe2 plus että ADP/NADPH/Fe3 plus indusoitunutta lipidiperoksidaatiota rotan maksan mikrosomeissa, jotka olivat tehokkaampia kuin a-tokoferoli tai kofeiinihappo. Antioksidatiivisen vaikutuksen havaittiin voimistuvan molekyylissä olevien fenolisten hydroksyyliryhmien lukumäärän lisääntymisen vuoksi.

Avainsanat: Cistanche deserticola; fenyylietanoidit;antioksidantti; DPPH (1,1 -difenyyli-2-pikryylihydratsyyli)radikaali; superoksidianioniradikaali; lipidien peroksidaatio

Cistanche deserticolan varsi

Cistanche spp. (Cistanche Herba, Orobanchaceae) on perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä käytetty tonic, jota käytetään munuaisten vajaatoimintaan, jolle on ominaista impotenssi, kylmyyden tunne lanteissa ja polvissa, naisten hedelmättömyys ja ummetus, joka johtuu suolen kuivuudesta seniilissä.Näistä kasveista on eristetty useita ainesosia, mukaan lukien fenyylietmoideja (jota joskus kutsutaan fenyylipropanoideiksi),2) iridoideja3* ja polysakkarideja4). Sato et al5} raportoivat, että jotkin tämän raakalääkkeen fenyylietanoidit osoittivat suojaavan vaikutuksen sekä seksuaalisen että oppimiskäyttäytymisen heikkenemistä roikkuvilla stressaantuneilla hiirillä. Fenyylietanoidit ovat näiden kasvien tärkeimmät ainesosat, ja niiden katsotaan myötävaikuttavan tämän lääkkeen eri vaikutuksiin.6)

Fenyylietanoideja on laajalti levinnyt kasvikuntaan, ja joillakin on havaittu olevan anoksiaa estävä, 7) kasvaimia estävä vaikutus, 8) entsyymien esto, 9* tulehdusta estävä, 10) antinefriitti, 1 n antimikrobinen ja immunomodulaatio.12) Tutkimuksia joidenkin Pedicularis-lajin fenyylietanoidien antioksidanttisesta vaikutuksesta raportoitiin myös,13 -15), mutta yhtään raporttia ei löytynyt Cistanche-lajeista peräisin olevien fenyylietanoidien antioksidanttisesta vaikutuksesta.

On hyvin tiedossa, että vapaat radikaalit osallistuvat kriittisesti erilaisiin patogeneesiin, kuten syöpään, sydän- ja verisuonisairauksiin, niveltulehduksiin, tulehduksiin sekä ikääntymiseen liittyviin rappeuttavia prosesseja.16™18) Seulonnassamme luonnonvaroista peräisin olevien ikääntymistä estävien aineiden suhteen , havaitsimme, että Cistanche deserticolan varren CHC13- (C), EtOAc (E), asetoni (A), asetoni-H2O (9:1) (AH) ja vesi (H) -uutte osoitti tehokkaan DPPH:n radikaaleja poistava aktiivisuus (kuvio 1), joista vahvin oli asetoni-H2.(9:1) -uute (AH). Asetoni-H2O (9:1) -uute sisälsi suuren määrän fenyylietanoideja, jotka luultavasti olivat aktiivisia vapaita radikaaleja poistavien vaikutusten ainesosia. Eristimme tästä uutteesta tärkeimmät fenyylietanoidit ja tutkimme niiden hapettumisenestovaikutuksia poistamalla ne DPPH-radikaalin ja ksantiini/XOD:n tuottaman superoksidianioniradikaalin sekä niiden eston askorbiinihapon/Fe2 plus:n ja ADP/NADPH/Fe3 plus:n aiheuttamaa lipidiperoksidaatiota rotan maksassa. mikrosomeja.

Cistanche deserticola

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Reagenssit Polyamidi C-200 (75一150/zm) ja silikageeli (Wakogel C-200, 75-150^m) jauhe pylväskromatografiaa varten, DPPH (1,1 -difenyyli{{ 8}}pikryylihydratsyyli), ksantiini, XOD (ksantiinioksidaasi), NBT (nitroblue tetrazolium), ADP, g-NADPH, kahvihappo ja a-tokoferoli ostettiin Wako Pure Chemicalsilta, Osaka, Japani. Malonaldehydibis(dimetyyliasetaali) oli Tokyo Kaseista, Tokiosta, Japanista. BSA (naudan seerumin albumiini) ja allopurinoli olivat sigma, St. Louis, USA Muut kemikaalit olivat analyyttistä laatua.

Instrumentit UV-absorbanssi mitattiin aShimadzu UV-2200 -tallennusspektrofotometri, NMR-spektrit suoritettiin JEOL GX-400- tai JEOL JNM-LA 400WB FT NMR -järjestelmällä.

Kasvimateriaalit Kaupallinen raakalääke (valmistettu Nei Monggolissa, ostettu Bozhoun raakalääkemarkkinoilta, Anhuin maakunnassa, Kiinassa, 1995; kupongin malli, TMPW nro 15479, talletettu Materia Medican museoon, etnomääketieteen analyyttinen tutkimuskeskus, tutkimus Institute for Wakan-Yaku, Toyaman lääketieteellinen ja farmaseuttinen yliopisto) tunnistettiin Cistanche deserticola YC Ma:n varreksi vertaamalla sen morfologisia ja anatomisia ominaisuuksia autenttiseen näytteeseen, jonka toimitti professori Dawen Shi, farmakognosian laitos, Shanghai Medical University, Kiina.

Uutto ja eristäminen Jauhettu raakalääkeaine (5,87 kg) uutettiin peräkkäin CHC13:lla (12, 9 1x2) ja EtOAc:llä (9 1 x 3) huoneenlämpötilassa ja refluksoitiin asetonin (9 1) ​​kanssa. x 3), asetoni-玦0 (9:1,91 x 3) ja H2O (75 1x4), jolloin saadaan uutteet CHC13:sta (C) (28,7 g), EtOAc:sta (E) ( 13,4 g), asetoni (A) (95 g), asetoni-H20 (9:1) (AH) (175 g) ja H20 (H) (2,51 kg), vastaavasti. Osa lOOg asetoni-H2O (9:1) -uutetta altistettiin polyamidi C-200 (4{{50}}0 g) pylvääseen ja eluoitiin H2O:lla ({{41) }}) ja sitten MeOH (5 1). MeOH-eluentti (20 g) ladattiin silikageelikolonniin (600 g) ja eluoitiin CHCl3-MeOH-H20:lla (8:3:0,3) (5 1), jolloin saatiin 10 fraktiota. Kukin fraktio alistettiin Sephadex LH{54}} -pylvääseen ja eluoitiin erilaisilla MeOH-H20-suhteilla (0-50 prosenttia); yhdeksän tärkeintä fenyylietanolia 1 (607 mg), 2 (286 mg), 3 (43 mg), 4 (187 mg), 5 (1,1 g), 6 (100 mg), 7 (208 mg), 8 (168 mg) saatiin 9 (75 mg).

Eläimet Urostyyppi: Käytettiin Wistar-rottia (8 viikkoa vanhoja, 230 ± 250 g). Eläimet ostettiin Shizuoka Laboratory Animal Centeristä ja niille syötettiin laboratoriopellettiruokaa (Clea Japan) ja vettä annettiin ad libitum.

Rotan maksan mikrosomaalisen suspension valmistaminen Rotan maksan mikrosomaalinen fraktio valmistettiin Kison et ai. 19) menetelmällä, mutta ilman fenobarbitaalin esikäsittelyä. Kun eläimet olivat paastonneet 24 tuntia, maksat perfusoitiin jääkylmällä 0,9-prosenttisella NaCl-liuoksella in situ, leikattiin sitten ohuiksi paloiksi ja homogenoitiin kylmässä 1,15-prosenttisessa KC1-liuoksessa (1.{{9}). } ml/g maksan märkäpainoa). Homogenaatti laimennettiin neljä kertaa 1,15-prosenttisella KC1-liuoksella ja sentrifugoitiin 8000 g:ssä 20 minuuttia 4 asteessa. Supernatanttifraktio kerättiin sitten ja sitä ultrasentrifugoitiin 105 000 g:ssä 60 minuuttia. Saatu pelletti suspendoitiin uudelleen samaan tilavuuteen 1,15-prosenttista KC1-liuosta. Proteiinipitoisuus määritettiin Lowryn et:n menetelmällä käyttämällä albumiinia standardina.

Näytteen valmistus Testatut näytteet liuotettiin veteen tai etanoliin ja laimennettiin vedellä eri pitoisuuksiin. Etanolin lopulliset pitoisuudet olivat alle 1 prosentin kaikissa määritysjärjestelmissä paitsi DPPH-radikaalinpoistomäärityksessä. Etanoli loppupitoisuudessa alle 1 prosentin ei osoittanut vaikutusta näihin määritysjärjestelmiin.

DPPH-radikaalien poistovaikutus Huuhteluvaikutus vastasi DPPH-radikaalin sammutuksen voimakkuutta, kuten Hatano et al. ovat kuvanneet.21) Viisisataa /A 60 卩m DPPH:ta EtOH:ssa lisättiin 500 /zl:aan näyteliuosta ja annettiin reagoida 30 minuuttia huoneenlämmössä, sitten optinen tiheys mitattiin 520 nm:ssä. Nollakokeessa käytettiin EtOH:ta DPPH-liuoksen sijasta ja kontrollissa H2O:ta näyteliuoksen sijasta. IC50-arvot laskettiin regressioviivoista, joissa abskissa edusti testatun yhdisteen pitoisuutta ja ordinaatta DPPH-radikaalin keskimääräistä prosentuaalista vähennystä neljästä erillisestä testistä.

Vaikutukset superoksidianioniradikaalien muodostumiseen Superoksidianionien tuotanto ksantiini/XOD-järjestelmässä määritettiin käyttämällä puolikokoista Imanarin et al. menetelmää.22) Seos, joka koostui 900/zl 0.05 m Na2CO3 (pH 10,2), 50 ug kutakin 3 mM ksantiinia, 3 mM EDTA, 1,5 mg/ml BSA, 0,75 mM NBT ja testattu näyte lisättiin 50 ui 0,1 mg/ml XOD:n aloittamiseksi. reaktio. 30 minuutin inkuboinnin jälkeen reaktio pysäytettiin 50 ul:lla 6 mM CuCl2:a ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 560 nm. Kontrolliliuos valmistettiin samalla tavalla, mutta näyteliuoksen sijasta käytettiin 50 ug/l H2O:ta. Nollaliuoksessa käytettiin 50/l H2O:ta XOD-liuoksen sijasta. IC50-arvot laskettiin regressioviivoista, joissa abskissa edusti testatun yhdisteen logaritmista konsentraatiota ja ordinaatta NBT:n vähenemisen neljän prosentin keskimääräistä estoa riippuvaisissa kokeissa.

Estävät vaikutukset XOD:n aktiivisuuteen Inhiboivat vaikutukset XOD:n aktiivisuuteen arvioitiin Hatano et al.:n* menetelmällä joillakin muutoksilla. Seos, joka koostuu 600/11 puskuria (0,1 m fosfaattiliuosta, pH 7,5), 50 以 XOD-liuosta (0,068 U/ml puskurissa) ja 50 卩 1 näyteliuosta esi-inkuboitiin 10 minuuttia 25 asteessa. Sitten seokseen lisättiin 300 pl ksantiiniliuosta (0,1 mM puskurissa) ja saatua liuosta inkuboitiin 30 minuuttia 25 °C:ssa. Entsyymireaktio lopetettiin lisäämällä 1 n HCl:tä (100/zl), ja reaktioseoksen absorbanssi mitattiin aallonpituudella 295 nm. Seokseen muodostuneen virtsahapon pitoisuus laskettiin absorbanssista sen jälkeen, kun oli vähennetty edellä kuvatulla tavalla valmistetun nollaliuoksen absorbanssi, paitsi että XOD-liuos korvattiin 50/zl:lla puskuria. XOD:ta estävät vaikutukset ilmaistiin virtsahapon muodostumisen prosentuaalisena inhibitiona (prosenttina) verrattuna kontrolliin, jossa käytettiin vettä näyteliuoksen sijasta. Positiivisena kontrollina käytettiin hyvin tunnettua XOD-estäjää, allopurinolia.

Inhiboivat vaikutukset lipidien peroksidaatioon rotan maksan mikrosomeissa Lipidiperoksidaatio rotan maksan mikrosomeissa, joita ei-entsymaattisesti indusoi askorbiini/Fe2 plus ja entsymaattisesti indusoi ADP/NADPH/Fe3 plus, mitattiin Kison et al.19) menetelmällä joissakin muutoksissa. .

a) Askorbiinihappo/Fe2 plus indusoitu lipidiperoksidaatio rotan maksan mikrosomeissa: Reaktioseos koostui 390/11 100 mM KC1/45 mM Tris-HCl:sta (pH 8,0), 50 pl. mikrosomaalista fraktiota 1,15-prosenttisessa KCl:ssä (20 mg proteiinia/ml) ja 50 ul:ssa näyteliuosta. Kun oli lisätty 10/11 10 mM askorbiinihappoa/0,5 mM FeS04:ää ja inkuboitiin sitten 37 asteessa 20 minuuttia, reaktioseos jäähdytettiin jäissä reaktion pysäyttämiseksi. Lipidiperoksidaatio mitattiin tiobarbituurihappomenetelmällä24) ja ilmaistiin MDA:n (malondialdehydin) tuotantona. Että

b) ADP/NADPH/Fe3 plus indusoitu lipidiperoksidaatio rotan maksan mikrosomeissa: Reaktioseos sisälsi 29 0° 100 mM KC1/45him Tris-HCl (pH 8,0), 50/il mikrosomisuspensiota 1,15 prosentissa KC1 (20 mg proteiinia/ml) ja 50 μ näytettä vedessä. Viisikymmentä juuri valmistettua 20 mM ADP:tä, 50/l 1 mM NADPH:ta ja 10 ui 2 mM FeCl3:a lisättiin ja inkuboitiin sitten 37 asteessa 30 minuuttia. Lipidiperoksidaatio mitattiin ja IC50 laskettiin yllä olevalla menetelmällä.

cistanchen edut: suojaa maksaa

TULOKSET

Rakenteen määritys Vertaamalla suoraan niiden ^H-NMR- ja13C-NMR-tietoja kirjallisuuteen,2* yhdeksän fenyylietanoidia tunnistettiin 2-asetyylilakteosidiksi (1), cistanosidiksi A (2), tubulosidiksi A (3), ekinakosidiksi ( 4), akteosidi (5), syringalidi A 3'-a-ramnopyranosidi (6), tubulosidi B (7), isoakteosidi (8) ja cistanosidi F (9), vastaavasti (kuvio 2). Kuitenkin akteosidille, joka on edustava fenyylietanoidien yhdiste, C-3 ja C-4 13C-NMR-signaalien määritykset aglykoniosassa, C-3, C-4 , C-5 ja C-6 kahviosissa aiemmissa raporteissa25) olivat hämmentäviä. 2D-NMR-menetelmällä, kuten HMBC ja HMQC, määritimme yksiselitteisesti akteosidin 13C-NMR-tiedot aglykoniosana Cl: 131,49, C-2: 117,14, C-3: 146,07, C{ {41}}: 144,62, C-5: 116,34, C-6: 121,29, Ca: 72,33, C# 36,54; kofeoyyliosa Cl: 127,63, C-2: 115,26, C-3: 146,79, C-4: 149,78, C-5: 116,55, C-6: 123,24 , Ca: 168,33, Cg: 114,68, Cy: 148,04; glukoosiosa C-l': 104,16, C-2': 75,97, C-3': 81,66, C4: 70,39, C-5': 76,16, C-6' : 62,35; ja ramnoosiosa: Cl: 102,99, C-2: 72,22, C-3: 72,05, C-4: 73,79, C-5: 70,58, C-6 : 18.46.

Näiden yhdeksän fenyylietanoidin rakenne-aktiivisuussuhteita tutkittiin niiden DPPH-radikaalin ja ksantiini/XOD:n synnyttämien superoksidianionien radikaaleja poistavien aktiivisuuksien, askorbiinihapon/Fe2 plus:n ja ADP/NADPH/Fe3 plus:n aiheuttaman lipidiperoksidaation perusteella rotan maksan mikrosomeissa. Positiivisina kontrolliaineina käytettiin kofeiinihappoa ja a-tokoferolia, jotka ovat tunnettuja vapaiden radikaalien sieppaajia ja antioksidantteja.

DPPH Radical Scavenging Activity All of the nine phenylethanoids showed stronger DPPH radical scav-enging activity than either a-tocopherol or caffeic acid, except that cistanoside A (2), syringalide A 3'-a-rhamno- pyranoside (6) and cistanoside F (9) showed weaker activity than caffeic acid (Fig. 3). The activity order was tubuloside B ⑺(IC50 = 2.99 ^m) > echinacoside ⑷ (IC50 = 3.29 fiM)M 2z-acetylacteoside ⑴(IC50 = 3.30 /im) M tubuloside A (3) (IC50 = 3.34/im) acteoside (5) (IC50 = 3.36 〃m)> isoacteoside (8) (IC50 = 3.49 ^m) >caffeic acid (IC50 = 4.79 /2M)> cistanoside A (2) (IC5O = 4.87 /im)>syringalidi A S'-a-ramnopyranosidi (6) (IC5O=5.52 /zm) > cistanosidi F (9) (IC50=6.29 /im) > a-tokoferoli (IC{{10) }}.2//m). Tubulosidi B ⑺, ekinakosidi (4), 2/-asetyyliasetosidi (1), tubulosidi A (3), akteosidi (5) ja isoakteosidi (8) (IC5O=2.99一3,49 /im), joista kukin jonka molekyylissä on neljä fenolista hydroksyyliryhmää, joka osoitti samalla tavoin voimakkaampaa aktiivisuutta kuin cistanosidi A (2), jonka aglykoniosan 3-OH oli metyloitunut. Syringalidi A 3z-a-ramnopyranosidi (6), jolla on vain yksi OH-ryhmä aglykoniosassa, osoitti suhteellisen heikkoa aktiivisuutta. Cistanosidi F (9), jossa on vain kaksi hydroksyyliryhmää, jotka sijaitsevat kofeoyyliosassa, mutta jossa ei ole fenyylietanoli-aglykonia, osoitti heikointa aktiivisuutta.

Effects on Superoxide Anion Radical Generation All the tested compounds exhibited a stronger inhibitory activity than a-tocopherol but weaker than caffeic acid on the generation of superoxide anion radical (Fig. 4). The activity order was caffeic acid (IC5()= 1.82jUM)>2'- acetylacteoside (1) (IC50 = 2.25 /im) tubuloside B ⑺ (IC50 = 2.34jUM) >echinacoside (4) (IC50 = 2.74juM)^ isoacteoside (8) (IC50 = 2.88 /zm) acteoside (5) (IC50 = 2.89 f/M) >cistanoside F (9) (IC5o = 3.13 rm) tubuloside A (3) (IC50 = 3.17 jUM)syringalide A 3'-a-rhamnopyrano- side (6) (IC50 = 3.20^m)>cistanosidi A (2) (IC5O=3,69 jUm) > a-tokoferoli (IC50 > 10 〃m).

XOD-aktiivisuutta estävät vaikutukset Vain isoakteosidilla (8) ja tubulosidi B:llä (7), joiden kofeoyyliosa on glukoosin 6z-asemassa, oli estäviä vaikutuksia XOD:n ja muiden fenyylietanoidien aktiivisuuteen, joissa on kofeoyyliosa ^- glukoosin asema, ei osoittanut mitään vaikutuksia testatuilla pitoisuuksilla (25 ± 200 m) (taulukko 1). eristi yhdeksän pääasiallista fenyylietanoidiyhdistettä tästä uutteesta ja määritti niiden rakenteet NMR:llä. järjestelmä tubulosidi B:nä (7)M2'-asetyylilakteosidi (1) iso-akteosidi (8) ekinakosidi (4) tubulosidi A (3) M akteopuoli (5) > syringalidi A 3'-a-ramnopyranosidi (6) > cistanosidi A (2) > cistanosidi F (9); ADP/NADPH/Fe3 plus -järjestelmässä tubulosidi B (7)2,-asetyylilakteosidi (^^iso-akteosidi (8) akteosidi (5) > tubulosidi A (3) > echinaco-puoli (4) > syringalidi A 3z-a-ramnopyranosidi (6) > cistanosidi A (2) > cistanosidi F (9). Molemmat järjestykset olivat samanlaisia ​​kuin yllä olevissa vapaiden radikaalien poistotestissä, erityisesti DPPH-radikaalinpoistotestissä. Silti fenolisten hydroksyyliryhmien lukumäärä molekyylissä Sillä oli tärkein rooli lipidien peroksidaation estämisessä rotan maksan mikrosomeissa.

cistanchen vaikutukset

KESKUSTELU

Testasimme Cistanche deserticolan varren eri liuotinuutteiden vapaita radikaaleja poistavia aktiivisuuksia DPPH-radikaalilla ja havaitsimme, että asetoni-H2O (9:1) -uutte osoitti voimakkainta aktiivisuutta. Löytääksemme vapaita radikaaleja poistavan aktiivisuuden aktiiviset aineosat eristimme tästä uutteesta yhdeksän pääasiallista fenyylietanoidiyhdistettä ja määritimme niiden rakenteet NMR:llä.

Näiden fenyylietanoidien antioksidatiiviset vaikutukset arvioitiin niiden vapaita radikaaleja sieppaavan aktiivisuuden ja anti-lipidiperoksidaatioaktiivisuuden perusteella. Laajalti tunnettua a-tokoferolia käytettiin positiivisena kontrolliaineena. Kutena-tokoferolin lipofiilisyys voi vaikuttaa sen aktiivisuuksiin esillä olevissa määritysjärjestelmissä paitsi DPPH-radikaaleja poistavassa määrityksessä, otimme kofeiinihapon toiseksi positiiviseksi kontrolliaineeksi.

Ensin suoritimme testejä vapaiden radikaalien poistamisesta. Kaikilla 9 testatulla fenyylietanoidilla oli epäilemättä voimakkaampi DPPH-radikaaleja ja superoksidianioniradikaaleja poistava aktiivisuus kuin a-tokoferoli, mutta jotkut olivat vahvempia ja toiset heikompia kuin kofeiinihappo. Radikaalien poistoaktiivisuus lisääntyi fenolisten hydroksyyliryhmien lukumäärän lisääntyessä. DPPH-radikaalien ja superoksidianionien poistoaktiivisuuksien epätäydellisen rinnakkaisuuden uskottiin johtuvan radikaalilajien välisistä erilaisista ominaisuuksista ja joistakin muista näihin kahteen reaktiojärjestelmään liittyvistä tekijöistä,21,26) sillä DPPH-radikaali on kemiallisesti indusoitunut radikaali, joka reagoi radikaalien sieppaajien kanssa yksinkertaisella kemiallisella tavalla, kun taas superoksidianioniradikaali syntyy ksantiini/XOD:n avulla, entsyymireaktiossa.

Jos fenyylietanoidit estävät ksantiini/XOD:n tuottamaa superoksidianioniradikaalia, eston voidaan katsoa johtuvan niiden superoksidianioniradikaaleja sieppaavasta aktiivisuudesta tai (ja) niiden entsyymin XOD,23 estämisestä, joten suoritimme niiden testin. ksantiinioksidaasia estävät vaikutukset. On mielenkiintoista, että selektiivisesti vain isoakteosidi (8) ja tubulosidi B (7), joiden kofeoyyliosa on glukoosin 6/-asemassa, osoittivat estoa. Ne osoittivat vaikutusta pitoisuudessa 25-200 jtiM 3,4xlO^3U/ml (10 jug/ml) XOD:ta, vaikka aktiivisuus oli heikompi kuin allopurinoli; muut yhdisteet, joiden kofeoyyliosa on glukoosin"-asemassa, eivät osoittaneet estävää vaikutusta. Tämä tulos antoi ensimmäisen raportin fenyylietanoidien estävästä vaikutuksesta XOD-entsyymiin. Chan et al21) raportoivat, että kofeiinihapolla ja joillakin sen analogeilla oli estäviä vaikutuksia XOD-aktiivisuuteen, mutta emme löytäneet kofeiinihapon tällaista vaikutusta nykyisissä reaktio-olosuhteissa. Tässä testissä XOD-konsentraatio oli samanlainen kuin superoksidianioniradikaalin muodostumiseen vaikutuksen testissä (4,3 /zg/ml), mutta yhdisteiden pitoisuus oli paljon korkeampi kuin jälkimmäisessä. Siksi näiden fenyylietanoidien aiheuttama Oj-sukupolven esto johtuu niiden radikaaleja poistavasta aktiivisuudesta, mutta ei niiden XOD-entsyymiä estävästä aktiivisuudesta.

Se, että vapaa radikaaliketjureaktio lopulta johtaa lipidiperoksidaatioon, tiedetään hyvin.28,29) Siksi tutkimme näiden fenyylietanoidiyhdisteiden vaikutuksia lipidiperoksidaatioon rotan maksan mikrosomeissa, jotka on indusoitu entsymaattisen järjestelmän ADP/NADPH/Fe3 plus avulla ja joita ei-entsymaattinen järjestelmä askorbiinihappo/Fe2 plus. Kaikki nämä yhdisteet osoittivat voimakkaampia anti-lipidiperoksidaatiovaikutuksia kuin kahvihappo ja a-tokoferoli molemmissa systeemeissä. On yleisesti hyväksyttyä, että molempia järjestelmiä katalysoivat rauta-ionit, joko Fe2 plus tai Fe3 plus, jotka liittyvät lipidiperoksyyliradikaaleihin,30,31) ja että hydroksyyliradikaalilla OH on tärkein rooli lipidien peroksidaatiossa,32 _34) vaikka OH:n alkaminen on kyseenalaistettu joissakin raporteissa.35祁6) Toisaalta superoksidianioniradikaali OJ, joka on e_-hyökkäyksen päätuote radikaaliketjussa O2:een, on melko huonosti reaktiivinen radikaali eikä aiheuta itse lipidiperoksidaatiota. Vaikka näillä fenyylietanoideilla oli heikompi puhdistusaktiivisuus superoksidianioniradikaaleja vastaan ​​kuin kofeiinihappo, niillä oli paljon voimakkaampi anti-lipidiperoksidaatiovaikutus kuin jälkimmäisellä. Siksi uskomme, että ne, kuten jotkut muut aromaattiset, ketjua katkaisevat polyfenolit, voivat estää edellä mainittua lipidien peroksidaatiota rotan maksan mikrosomeissa kelatoimalla Fe2 plus- tai Fe3 plus -ioneja ja myös poistamalla superoksidiradikaalin Oj radikaaliketjureaktion hajottamiseksi. .37,38) Lisäksi ne voivat myös pyyhkiä myrkyllisempiä radikaaleja, kuten hydroksyyliradikaaleja ja lipidiperoksyyliradikaaleja keskeyttääkseen suoraan lipidien peroksidoinnin tehokkaammalla teholla kuin kahvihappo.38,39)

Li et ai. tutki joitain fenyylietanoidiglykosideja, mukaan lukien akteosidi (verbaskosidi) (5), isoakteosidi (isoverbaskosidi) (1) ja ekinakosidi (4) Pedicularisista niiden linolihapon itsehapettumisen estämiseksi miselleissä, ei-biologisessa järjestelmässä,13 niiden suojaamisesta oksidatiivista hemolyysiä vastaan ​​in vitro,14''1 ja myös niiden puhdistamisvaikutuksista NBT/PMS/NADH:n synnyttämiin superoksidiin ja askorbiinihapon/Fe2 plus:n indusoiman lipidiperoksidaation estämiseen hiiren maksan mikrosomeissa.15) Samanlainen aktiivisuus. -rakenteen suhde havaittiin Li et al. ja tuloksemme. Toisin sanoen fenyylietanoidien aktiivisuus estää lipidien peroksidaatiota riippuu pääasiassa fenolisten hydroksyyliryhmien lukumäärästä ja steerisestä sijainnista.15) Stereokemiansa perusteella kofeoyyliosan fenoliset hydroksyyliryhmät akteosidissa (5), tubulosidi A () 3) ja ekinakosidi (4), joissa kofeoyyli on glukoosin 4z-asemassa, muodostavat helpommin vetysidoksen ramnosyylin hydroksyyliryhmien kanssa kuin isoakteosidin (8) ja tubulosidi B:n (7) kanssa. kofeoyyli on glukoosin 6'-asemassa. Siten jälkimmäinen varasi enemmän vapaita fenolisia hydroksyyliryhmiä kuin edellinen ja sen vuoksi osoitti voimakkaampaa anti-lipidiperoksidaatioaktiivisuutta. Huomasimme myös, että näiden fenyylietanoidien 2z-asetylaatio, vaikkakin hieman, tehosti niiden antioksidanttivaikutuksia. Esimerkiksi akteosidi (5) ja isoakteosidi (8), kun 2'-asetyloitiin 2/-asetyylilakteosidiksi (1) ja tubulosidi B (7), vastaavasti osoittivat voimakkaampia aktiivisuuksia kaikissa neljässä määritysjärjestelmässä. Stereokemian ja 2'-asetyloinnin paremmuuden vuoksi tubulosidi B (7) osoitti vahvinta antioksidanttiaktiivisuutta testatuista näytteistä. Ehkä johtuen kolmannen sokeriosan substituutiosta 6'-asemassa, tämä korrelaatio ei sopinut hyvin tubulosidi A:n (3) tai ekinakosidin (4) tapauksessa; kuitenkin ADP/NADPH/Fe3 plus -järjestelmässä tubulosidi A ⑶ osoitti edelleen voimakkaampaa anti-lipidiperoksidaatioaktiivisuutta kuin ekinakosidilla (4).

Lisäksi DPPH-radikaaleja poistavan aktiivisuuden järjestys osoitti parempaa samansuuntaisuutta anti-lipidiperoksidaation kanssa kuin superoksidianionin radikaaleja poistavan aktiivisuuden järjestys. Tämä osoitti jälleen, että DPPH-radikaalien poistomääritys on kätevä ja luotettava menetelmä antioksidanttimääritykseen,26), vaikka DPPH-radikaali on kemiallisesti indusoitunut radikaali, kun taas superoksidianioniradikaali voi olla biologisesti endogeeninen radikaali.

Yhteenvetona voidaan todeta, että kaikilla yhdeksällä fenyylietanoidilla oli merkittäviä vapaita radikaaleja poistavia vaikutuksia ja anti-lipidiperoksidaatiovaikutuksia tässä tutkimuksessa. Antioksidatiivista vaikutusta tehosti fenolisten hydroksyyliryhmien lukumäärän kasvu molekyylissä. Kuten voidaan kuvitella, näiden fenyylietanoidien tässä todistetuilla antioksidanttisilla vaikutuksilla voi olla tärkeä rooli Cistanchis Herba -lääkkeen vaikutuksissa ja ne voivat osittain selittää joidenkin fenyylietanoidien vaikutusmekanismeja kasvaimia,8* tulehdusta10) ja nefriittiä vastaan, 1 n, jossa vapaat radikaalit ovat vakavasti mukana.

Cistsanche Echinacoside: Antioksidantti

VIITTEET

1) Namba T., "The Encyclopedia of Wakan-Yaku (perinteiset kiinalais-japanilaiset lääkkeet) värikuvilla, 5, osa II, Hoikusha, Tokio, 1994, s. 16-17.

2) a) Kobayashi H., Karasawa H., Miyase T., Fukushima S., Chem. Pham. Bull, 32, 3009-3014 (1984); b) Idem, ibid., 32, 3880-3885 (1984); c) Idem, ibid., 33, 1452-1457 (1985); d) Karasawa H., Kobayashi H., Takizawa N., Miyase T., Fukushima S., Yakugaku Zasshi, 106, 562-566 (1986); e) Idem, ibid., 106, 721-724 (1986); /) Kobayashi H., Oguchi H., Takizawa N., Miyase T., Ueno A., Usmanghani K., Ahmad M., Chem. Pharm. Bull., 35, 3309-3314 (1987); g) Yoshizawa F., Deyama T., Takizawa N., Usmanghani K., Ahmad M., ibid., 38, 1927-1930 (1990).

3) a) Kobayashi H, Komatsu J., Yakugaku Zasshi, 103, 508一511 (1983); b): Kobayashi H., Karasawa H., Miyase T., Fukushima S., Chem. Pharm. Bull., 32, 1729-1734 (1984); c) Sama, ibid., 33, 3645-3650 (1985).

4) Naran R., Ebringerova A., Hromadkova Z., Patoprsty V., Phytochemistry, 40, 709-715 (1995).

5) Sato T., Kozima S., Kobayashi K., Kobayashi H., Yakugaku Zasshi. 105, 1131-1144 (1985).

6) Jin XL, Zhang QR, Kiina J. Chinese Materia Medica, 19, 695-697 (1994).

7) Yamahara J., Kitani T., Kobayashi H., Kawahara Y., Yakugaku Zasshi, 110, 932-935 (1990).

8) a) Pettit G. R・, Numata A., Takemura T., Ode RH, Narula A, S., Schmidt JM, Cragg GM, Pase CP, J. Nat. Prod., 53, 456 - 58 (1990); b) Saracoglu I., Inoue M., Calis I., Ogihara Y., Biol. Pharm, Bull., 18, 1396-1400 (1995).

9) Andary C., '4Caffeic Acid Glycoside Esters and Pharmacology/ toim. Scalbert A., Polyphenolic Phenomena, INRA Editions, Paris, 1993, s. 237-245.

10) Murai M., Tamayama Y., Nishibe S., Planta Med.. 61, 479-80 (1995).

11) Hayashi K., Nagamatsu T., Ito M., Hattori T., Suzuki Y., Jpn. J. Pharmacol., 66, 47, 52 (1994).

12) a) Molnar J., Gunics G., Mucsi I., Koltai M., Petri L, Shoyama Y., Matsumoto M., Nishioka L, Acta Microbiol. Hung.. 36, 425-32 (1989); b) Sasaki H., Nishimura T., Morota T., Chin M., Mitsuhashi H" Komatsu Y., Maruyama H., Tu GR, He W., Xiong YL, Planta Med., 55, 4582462 (1989).

13) Li J., Wang PF, Zheng RL, Liu ZM, Jia 乙 J., Planta Med., 59, 315-317 (1993).

14) Zheng RL, Wang PF, Li J., Liu Z. M., Jia ZJ, Chem. Phys. Lipidit. 65, 151 - 154 (1993).

15) Li J., Zheng RL, Liu 乙 M., Jia 乙 J., Acta Pharmacol. Sinica, 13, 427T30 (1992).

16) Barber DA, Harris SR, American Pharmacy. 34, 26, 35 (1993).

17) Elstner EF, Klin Wochenschr, 69, 949-956 (1991).

18) Martin GR, Danner DB, Holbrook NJ, Ann. Rev. Med., 44, 419-29 (1993).

19) Kiso Y., Tohkino H., Hattori M., Sakamoto T., Namba T., Planta Med.. 50, 298-302 (1984).

20) Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ, J. Biol. Chem.. 193, 265 - 275 (1951).

21) Hatano T., Edamatsu R., Hiramatsu M., Mori A., Fujita Y., Yasuhara T" Okuda T., Chem. Pharm. Bull., 37, 2016-2021 (1989).

22) Imanari T., Hirota M., Miyazaki M., Igaku No Ayumi, 101, 496-497 (1977).

23) Hatano T., Yasuhara T., Yoshihara R., Agata L, Noro T., Okuda T., Chem. Pharm. Bull., 38, 1224-1229 (1990).

24) Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K., Anal. Biochem., 95, 351-358 (1979).

25) a) Lahloub M, F., Zaghloul AM, El-Khayat SA, Afifi MS, Sticher O., Planta Med.. 57, 481-85 (1991); b) Nishimura H., Sasaki H., Inagaki N., Chin M. (Zhen 乙 X.), Mitsuhashi H., Phytochemistry. 30, 965 - 969 (1991); c) Budzianowski J., Skrzypczak L., ibid,, 38, 997-1001 (1995),

26) Marsden SB, Nature (Lontoo), 181, 1199-1200 (1958).

27) Chan WS, Wen PC, Chiang HC, Anticancer Res., 15, 703, 708, (1995).

28) Janero DR, Burghardt B., Biochem, Pharmacol.. 37, 3335-3342 (1988).

29) Buettner GR, Arch. Biochem. Biophys., 300, 535-543 (1993).

30) Herbert V., Shaw S., Jayatilleke E., Stopler-Kasdan T., Stem Cells, 12, 289-303 (1994).

31) Aust SD, Miller DM, Samokyszyn VM, Methods Enzymol., 186, 457-463 (1990).

32) Kubota S., Ikegami Y., Kurokawa T., Sasaki R., Sugioka K., Nakano M., Biochem. Biophys. Res, Commun., 108, 1025 - 1031 (1982).

33) Yagi K., Ishida N., Komura S., Ohishi N., Kusai M., Kohno M., Biochem. Biophys. Res. Commun., 183, 945, 951 (1992).

34) Hockenbery DM, Oltvai ZN, Yin XM, Milliman CL, Korsmeyer SJ, Cell. 75, 241-251 (1993).

35) Bucher JR, Tien M., Aust AD, Biochem. Biophys. Res, Commun., Ill, 777-784 (1983).

36) Yoshida T., Otake H., Aramaki Y., Hara T., Tsuchiya S., Hamada A., Utsumi H., Biol. Pharm. Bull.. 19, 779-782 (1996).

37) Afanas5 EVIB, Dorozhko A. L., Brodskii AV, Kostyuk VA, Potapovitch L A., Biochem. Pharmacol., 38, 1763-1769 (1989).

38) Robak J., Gryglewski RJ, Biochem. Pharmacol.. 37, 837 - 841 (1988).

39) Chimi H., Morel I., Lescoat G., Pasdeloup N・, Cillard P., Cillard J., Toxicology in Vitro, 9, 695 一702 (1995)