Kalmia Angustifolia -uutteen antioksidantti-, tulehdus- ja ikääntymistä estävä potentiaali ja joidenkin tärkeimpien yhdisteiden tunnistaminen, osa 1

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Abstrakti:Ihon ikääntyminen on ikääntymisprosessin näkyvin osatekijä, joka aiheuttaa suurta huolta monille ihmisille. Ericaceae-perheen kasveilla on yleensä antioksidanttisia ja anti-inflammatorisia ominaisuuksia, mikä tekee niistä mahdollisia ikääntymistä estäviä aktiivisia ainesosia. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida Kalmia angustifolia -uutteen turvallisuutta ja ikääntymistä ehkäisevää tehoa rekonstruoitujen ihonkorvikkeiden avulla. Turvallisuusarviointi suoritettiin käyttämällä 3-(4,5-dimetyylitiatsolyyli-2)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) -määritystä, kun taas teho oli määritetty arvioimalla antioksidantti- ja anti-inflammatorinen aktiivisuus ja analysoimalla itsekokoamismenetelmällä rekonstruoidut ihonkorvikkeet histologialla ja immunofluoresenssivärjäyksellä (elastiini, kollageeni-1, kollageeni-3, akvaporiini-3) . Solujen elinkelpoisuusmääritys osoitti uutteen turvallisuuden pitoisuudessa 200 ug/ml asti. Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) -määritys ja solupohjainen määritys, jossa käytettiin 2',7'-dikloorifluoreseiinidiasetaattia (DCFH-DA), paljasti vahvan antioksidanttiaktiivisuuden, jonka ORAC-arvo oli 16 μmol Trolox Equivalent/mg ja puoli- Suurin estävä konsentraatio (IC50) oli 0,37 ± 0,02 ug/ml, kun taas mielenkiintoinen anti-inflammatorinen aktiivisuus havaittiin NO-tuotannon estämisessä, jossa NO-tuotannon estoprosentti oli 49 ± 2 prosenttia pitoisuudessa 80 ug/ml. Uutteen eristäminen ja karakterisointi mahdollisti yhdisteiden tunnistamisen, jotka saattoivat olla vastuussa näistä biologisista vaikutuksista, ja kaksi niistä tunnistettiin ensimmäistä kertaa K.cistanche-varsiAngustifolia: avicularia ja epikatekiini-(2 -O-7, 4 -6)-ent-epikatekiini. Uutteella käsiteltyjen ihonkorvikkeiden histologiset analyysit osoittivat ihon paksuuden lisääntymistä verrokkeihin verrattuna. K. Angustifolia -uute tehosti elastiinin ja kollageenin ilmentymistä-1, jotka yleensä vähenevät ihon ikääntyessä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että K. Angustifolialla on lupaava antioksidanttitehokkuus ja ikääntymistä estävä potentiaali.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Avainsanat: ihonkorvikkeet; ihon ikääntyminen; luonnontuotteet; aktiiviset ainesosat; lampaat Laurel; antioksidanttiaktiivisuus; anti-inflammatorinen aktiivisuus; kudosteknologia

1. Esittely

Ihon ikääntyminen on luonnollinen fysiologinen prosessi, joka huolestuttaa monia ihmisiä. Se on ensimmäinen "näkyvä merkki ikääntymisestä ja ihon rappeutumisesta. Näin ollen ikääntymistä ehkäisevien kosmeettisten tuotteiden muotoilu on noussut tärkeäksi viime vuosina, koska halutaan rajoittaa tätä ikääntymisen ilmenemistä. Ihon ikääntymiselle on ominaista useita muutoksia biologisella tasolla, joihin kuuluu solujen lisääntymisen väheneminen, mikä johtaa epidermaalisen surkastumiseen, ja ihon komponenttien, kuten fibroblastien ja elastiini- ja kollageenikuitujen väheneminen, ja siten ihon paksuuden väheneminen vanhemmilla aikuisilla [1,2] Boreaalinen metsä on täynnä tutkimattomia luonnonvaroja, joilla on suuri potentiaali kosmeettisten aktiivisten ainesosien kehittämiseen Kalmia angustifolia, joka tunnetaan myös nimellä Sheep Laurel, on Ericaceae-heimon koppisiemeninen kasvi.cistanche tubulosa hyödyt ja sivuvaikutuksetTämä kasvi on kotoisin Itä-Pohjois-Amerikasta, mutta sitä tavataan pääasiassa Kanadan boreaalisissa metsissä [3]. Perinteisessä intiaanilääketieteessä K. Angustifoliaa käytettiin erilaisten tulehduksiin liittyvien terveysongelmien, kuten vatsakipujen, nyrjähdysten ja turvotuksen, hoitoon. viittaa siihen, että tällä kasvilla on anti-inflammatorisia ominaisuuksia [4]. Ericaceae-suvun eri kasveilla on myös anti-inflammatorisia ja antioksidanttisia ominaisuuksia, jotka tekevät niistä mielenkiintoisia kosmeettisia vaikuttavia aineita. K.angustifolian kemiallista koostumusta ei ole vielä hyvin dokumentoitu. Joissakin tutkimuksissa on tunnistettu myrkyllisiä yhdisteitä, kuten grayanotoksiineja, jotka ovat hermomyrkkyjä, jotka ovat myrkyllisiä ihmisille nieltynä, mutta harvoin tappavia, ja arbutiini (4-hydroksifenyyli-D-glukopyranosidi), tyrosinaasin estäjä, jota löytyy K. Angustifolian lehdistä. ja sitä käytetään depigmentointiaineena [5-8]. Näistä K. Angustifoliasta löydetyistä mahdollisesti myrkyllisistä yhdisteistä huolimatta muut tutkimukset ovat myös osoittaneet, että kasvista löytyy runsaasti flavonoideja, fenolihappoja, tanniineja ja terpeenejä [9-15]. Joillakin näistä yhdisteistä on mielenkiintoisia biologisia aktiivisuuksia ja ne voivat siksi antaa K. Angustifolialle lupaavan ikääntymistä estävän vaikutuksen, kuten muille kasveille.

Cistanche voi estää ikääntymistä

Vaikka olisikin tarvetta kehittää uusia ihokosmeettisia tuotteita, jotka auttavat ehkäisemään ihon ikääntymistä, uudet lait, jotka kieltävät tai rajoittavat eläinkokeita kosmetiikkateollisuudessa, vaikeuttavat sitä. Siksi tuotteen tehokkuuden testaamiseen tarvitaan muita vaihtoehtoja. In vitro -soluviljelmien tai ihonkorvikkeiden käyttö on hyvä vaihtoehto kosmeettisten ainesosien seulomiseen. Useat mallit ovat Euroopan vaihtoehtoisten menetelmien validointikeskuksen (ECVAM, Ispra, Italia) hyväksymiä, ja niitä myydään kaupallisesti kosmeettisille yrityksille, jotta ne voivat suorittaa turvallisuustestejä ja välttää eläinten käytön aiheuttaman tarpeettoman kärsimyksen [16,17] . Useimmissa kaupallisesti saatavilla olevissa malleissa on kuitenkin vain erilaistunut orvaskesi, ja niistä puuttuu vuorovaikutus keratinosyyttien ja fibroblastien välillä [16]. Uusia täyspaksuisia malleja on ilmaantunut muutaman viime vuoden aikana ja ne ovat mahdollistaneet muun muassa ikääntymisreittien ja ikääntymistä estävien yhdisteiden tutkimuksen, tehden niistä hyödyllisiä työkaluja eläinten käytön korvaamiseen kosmetiikkaalalla [18,19].cistanche tubulosa -uuteTämän tutkimuksen tavoitteena oli ensin arvioida K. Angustifolia -uutteen biologista aktiivisuutta viljellyillä solukerroksilla ja sitten arvioida tämän uutteen ikääntymistä estävä potentiaali käyttämällä ihonkorvikkeita, jotka on rekonstruoitu itsekokoamismenetelmällä [20,21]. . Tämän ihonkorvikemallin vahvuus on, että siinä ei ole eksogeenisiä materiaaleja ja se perustuu askorbiinihapon kykyyn edistää ihon fibroblastien solunulkoisen matriisin tuotantoa, mikä tekee mallista täysin ihmisen.cistanche tubulosa arvostelutTämä tutkimus esittelee uuden vaikuttavan aineen, jota voitaisiin käyttää dermokosmeettisissa tuotteissa ja ehdottaa in vitro -mallien käyttöä vaihtoehtona kosmeettisessa tutkimuksessa.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Kasvimateriaalin ja uutteen valmistus

K.angustifolia korjattiin 2015. toukokuuta Lac-St-Jeanin alueelta Quebecissä, Kanadassa. M. Patrick Nadeau tunnisti kasvin ja voucher-näyte (nro QFA0617265) talletettiin Louis Marie -herbariumiin Laval Universityssa, Ouébecissa, Kanadassa. K.angustifolian ilmaosat (2,1 kg) jauhettiin Fritsch Pulverisette 25 Cutting Mill -laitteella (Fritsch, Laval, QC, Kanada) ja uutettiin palautusjäähdyttäen vedettömällä etanolilla (1,5 l, kolme kertaa) ja EtOH-H203:1( 1,5 l, kaksi kertaa). Ensimmäisten uuttojen jälkeen saadut uutteet (EtOH:ssa ja EtOH-H, O) suodatettiin ja yhdistettiin. EtOH:n tyhjössä haihduttamisen jälkeen vesifaasi jaettiin dikloorimetaanilla (DCM, CHCl; 300 ml, viisi kertaa) ja etyyliasetaatilla (EtOAc; 300 ml, viisi kertaa). EtOAc-faasi haihdutettiin alennetussa paineessa kuiviin, jolloin saatiin K.angustifolia-uutetta (222,6 g, 10,6 %). Päivää ennen käsittelyjä uute, jauhemuodossa, liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO; Sigma, Oakville, ON, Kanada) kantaliuoksen saamiseksi ja säilytettiin sitten -20 asteessa, kunnes sitä tarvittiin. Halutut K.angustifolia-pitoisuudet saatiin laimentamalla kantaliuos (12,5 tai 25 mg/ml) suoraan viljelyalustaan ​​koepäivänä. DMSO:n lopullinen pitoisuus oli 0,2 prosenttia (ofo) liuottimen myrkyllisyyden välttämiseksi.

2.2.K. Angustifolia -uutteen tärkeimpien yhdisteiden eristäminen

Aiemmin kuvatusta EtOAc-uutteesta 30 g erotettiin kromatografialla Diaion-kolonnissa (Mitsubishi Chemicals, Charlotte, NC, USA) käyttämällä eluenttina MeOH/H2O:ta gradienttiolosuhteissa (40 prosenttia). , 50 prosenttia, 60 prosenttia, 70 prosenttia ja 100 prosenttia), jolloin saadaan neljä rikastettua fraktiota (AD). Fraktio B (2 g) altistettiin silikageelipylvääseen (200 g) ja eluoitiin MeOH-DCM-gradienttiolosuhteilla 5 prosentista 15 prosenttiin, jolloin saatiin neljä fraktiota (B1-B4). Fraktio C (6 g) altistettiin myös silikageelipylvääseen (300 g) ja eluoitiin MeOH-DCM-gradienttiolosuhteilla 5 prosentista 25 prosenttiin, jolloin saatiin seitsemän fraktiota (C1-C7). Fraktio C3 (500 mg) puhdistettiin käänteisfaasikromatografialla C18-kolonnissa (120 g, FLH-R33230B-IS120 SiliaSepTM C18, Silicycle, Quebec, QC, Kanada) käyttämällä 0,1 % muurahaishappoa H, O-MeOH:ssa 40 prosentista 60 prosenttiin. Saatiin neljä alafraktiota: C3A-C3D, jossa oli C3B, ja C3C erittäin puhtaalla, sisältäen pääyhdisteitä. Fraktio C4 (2 g) puhdistettiin myös käänteisfaasikromatografialla C18-kolonnissa käyttäen 0,1 % muurahaishappoa H20-MeOH:ssa 30 % - 45 %. Erotuksesta saatiin kolme alafraktiota: C4A-C4C, joissa C4A ja C4C olivat erittäin puhtaita ja jotka sisälsivät kukin yhden yhdisteen. Fraktio D (8,7 g) altistettiin silikageelipylväille (2 x 200 g) ja eluoitiin CHCl3-MeOH-gradienttiolosuhteilla (15:1; 10:1; 5:1), jolloin saatiin kahdeksan fraktiota (D). 1-D8). Fraktiot D1-D4 esittivät kukin pääyhdisteen.

2.3. NMR- ja GC-MS-analyysi

Ydinmagneettisen resonanssin (NMR) spektrit tallennettiin Bruker Avance 400 -spektrometrillä (Bruker, Milton, ON, Kanada) taajuudella 400 MHz'H-ytimille ja 100 MHz:llä 13C-ytimille käyttäen deuteroitua kloroformia (CDCl3) tai deuteroitua metanolia (CH3OD) liuottimena. Kemialliset siirtymät ilmoitetaan ppm:nä suhteessa liuottimen jäännöspiikkiin. Korkean resoluution massaspektrometria (HRMS) tallennettiin Agilent 6224 MS-TOF -massaspektrometrillä (Agilent, Saint-Laurent, QC, Kanada), joka oli varustettu sähkösumutuslähteellä.

2.4 Biopsiat ja solujen erottaminen

Primaariset keratinosyytit ja fibroblastit saatiin rintojen pienennysleikkausten biopsioista. Luovuttaja oli 18–52-vuotiaita valkoihoisia naisia. Keratinosyytit ja fibroblastit uutettiin biopsioista käyttämällä aiemmin kuvattua eristysmenetelmää [22,23]. Biopsioita inkuboitiin termolysiinissä 4 asteessa 16 tuntia epidermiksen erottamiseksi verinahasta. Tämän jälkeen keratinosyytit eristettiin epidermiksestä käyttämällä trypsiiniä 30 minuutin ajan, kun taas fibroblastit eristettiin dermiksestä käyttämällä kollagenaasia 4 tunnin ajan. Sitten soluja viljeltiin haluttuun siirtoon asti. Keratinosyyttejä käytettiin siirrossa 1 ja fibroblasteja siirrossa 4.

2.5. Soluviljely

Primaariset fibroblastit (passige 4) kylvettiin tiheydellä 4 × 103 solua/cm² ja viljeltiin Dulbecco's Modified Eagle Mediumissa (DMEM), jota oli täydennetty 10 prosentilla FB Essence -seerumilla (FBI; Seradigm, Salt Lake City). , UT, USA), 100 UI/ml penisilliini G:tä (Sigma, Oakville, ON, Kanada) ja 25 ug/ml gentamysiiniä (Gemini, West Sacramento, CA, USA). Primaariset keratinosyytit (passie 1) kylvettiin tiheydellä 4 × 103 solua/cm² säteilytettyjen hiiren 3T3 fibroblastien syöttökerrokselle ja viljeltiin DMEM:n ja Hamin F12:n yhdistelmässä suhteessa 3:1 (DMEMH), jota oli täydennetty 5 prosentilla sikiön kloonilla. Ⅱ seerumi (Hyclone, Scarborough, ON, Kanada), 5 ug/ml insuliinia (Sigma, St. Louis, MO, USA), 0,4 ug/ml hydrokortisonia (Galen-ova, Saint-Hyacinthe, QC, Kanada), 0,212 ug /ml isoproterenolihydrokloridia (Sandoz Canada, Boucherville, QC, Kanada), 10 ng/ml ihmisen epidermaalista kasvutekijää (EGF; Austral Biological, San Ramon, CA, USA), 100 UI/ml penisilliini G (Sigma, Oakville, ON, Kanada) ) ja 25 ug/ml gentamysiiniä (Gemini, West Sacramento, CA, USA). Soluviljelmiä inkuboitiin 37 °C:ssa 8-prosenttisessa hiilidioksidi(CO2)-ilmakehässä. Soluviljelyalustat vaihdettiin joka toinen päivä, yhteensä kolme kertaa viikossa.

2.6. Sytotoksisuusmääritys

K.angustifolia-uutteen toksisuus arvioitiin primaarisilla keratinosyyteillä käyttämällä {{0}}(4,5-dimetyylitiatsolyyli-2)-2,{{5} }difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) -määritys. MTT-määritys on kolorimetrinen määritys, joka perustuu keltaisen tetratsoliumsuolan (MTT) entsymaattiseen pelkistykseen purppuranpunaisiksi formatsaanikiteiksi. Tätä entsymaattista reaktiota katalysoi mitokondrioiden sukkinaattidehydrogenaasi metabolisesti aktiivisissa soluissa. Siten sitä käytetään solujen elinkelpoisuuden arvioimiseen solujen metabolisen aktiivisuuden perusteella. Lyhyesti sanottuna päivänä 0 terveiltä luovuttajilta peräisin olevat keratinosyytit P3:ssa maljattiin tiheydellä 5 × 103 solua/kuoppa 96-kuoppalevylle säteilytettyjen hiiren 3T3-fibroblastien syöttökerroksessa. Päivänä 2 hoito lisättiin. Päivänä 4 MTT-väriainetta (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma, St. Louis, MO, USA) lisättiin levylle pitoisuutena 0,5 mg/ml steriilissä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 1 X. Levyä inkuboitiin sitten 3 tuntia (37 astetta, 8 % CO) ja formatsaani uutettiin tuoreella isopropanolin ja suolahapon (HCl) liuoksella. Absorbanssi luettiin aallonpituudella 570 nm käyttämällä mikrolevylukijaa (SpectraMax Plus 384 Microplate Reader, Molecular Devices, San José, CA, USA). 2.7. Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) -määritys

K.angustifolia-uutteen antioksidanttisten ominaisuuksien arvioimiseksi suoritettiin Ou et ai. kuvaamalla tavalla Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) -määritys. joillain muutoksilla [24]. Lyhyesti sanottuna määritys suoritettiin 384-kuoppalevyllä Fluoroskan Ascent FLTM -levylukijalla (Labsystems, Milford, MA, USA). Eri pitoisuudet Trolox(6-hydroksi-2,5,7,8-tetrametyylikromaani-2-karboksyylihappo; E-vitamiinin analogi) valmistettiin standardikäyrän muodostamiseksi järjestyksessä vertailla testinäytteitä tähän positiiviseen kontrolliin. Koe suoritettiin lämpötilassa 37,5 ja puoli 7,4 nollanäyte rinnakkain.cistanche UKFluoreseiinin fluoresenssi rekisteröitiin 60 sekunnin välein fluorometrillä sen jälkeen, kun oli lisätty 2,2'-atsobis(2-amidinopropaani)dihydrokloridia. Fluoresenssi mitattiin viritysaallonpituudella 485 nm ja emissioaallonpituudella 538 nm. Tulokset laskettiin käyttämällä nollakokeesta ja näytekäyrästä saatujen fluoreseiinin hajoamisen alla olevien alueiden välisiä eroja. ORAC-arvojen tulokset ilmaistiin mikromooleina Trolox-ekvivalenttia (TE) milligrammaa kohti (μmol TE/mg) tai mikromooleina TE:tä mikromoolia kohti (umol TE/mol).

2.8. Antioksidanttiaktiivisuus arvioitu käyttämällä solupohjaista määritystä

Antioksidanttiaktiivisuus arvioitiin solupohjaisella määrityksellä, jossa käytettiin 2',7/-dikloorifluoreseiinidiasetaattia (DCFH-DA), kuten Girard-Lalancette et ai. ovat kuvanneet tietyin muutoksin [25]. Lyhyesti sanottuna ihmisen ihon WS1-fibroblasteja (ATCC⑧ CRL-1502, Manassas, VA, USA) inkuboitiin 60 minuuttia 100 μl:n kanssa 5 μM DCFH-DA:ta Hanksin tasapainotetussa suolaliuoksessa (HBSS, HyClone, Marlborough, MA, USA) . Sitten uutteen antioksidanttiaktiivisuuden arvioimiseksi soluja inkuboitiin 60 minuuttia K.angustifolia-uutteen ja positiivisten kontrollien (kversetiini ja Trolox) kasvavilla pitoisuuksilla. Oksidatiivista stressiä varten lisättiin 100 µl 400 µM tertbutyylihydroperoksidia (t-BuOOH), jotta kuoppiin saatiin 200 µM t-BuOOH:n lopullinen pitoisuus. Fluoresenssi mitattiin sitten välittömästi ja 90 minuutin kuluttua käyttämällä automaattista Fluoroskan Ascent FLTM -levylukijaa (Labsystems, Milford, MA, USA). Fluoresenssi arvioitiin viritysaallonpituudella 485 nm ja emissioaallonpituudella 538 nm. Antioksidanttiaktiivisuus ilmaistiin DCFH:n hapettumisen eston prosentteina.

2.9. Tulehdusta ehkäisevä aktiivisuus arvioitu nitriitin kvantifioinnin avulla

Anti-inflammatorinen aktiivisuus arvioitiin arvioimalla K.angustifolia-uutteen aiheuttamaa typpioksidin (NO) tuotannon estoa, kuten ovat kuvanneet Legault et ai. [26]. Lyhyesti sanottuna hiiren makrofageja RAW 264.7 (ATCC⑧ TIB-71, Manassas, VA, USA) inkuboitiin K. Angustifolia -uutteen kasvavien pitoisuuksien kanssa ja stimuloitiin sitten 100 ng/ml lipopolysakkaridilla (LPS). Positiivista kontrollia, Nw-nitro-L-arginiinimetyyliesterihydrokloridia (L-NAME), käytettiin myös kahdessa eri pitoisuudessa ∶ 250 µM (67 ug/ml) ja 1 mM (270 ug/ml). Soluttomat supernatantit kerättiin 24 tuntia LPS-stimulaation jälkeen, ja NO:n pitoisuus arvioitiin välittömästi käyttämällä Griessin reaktiota. Absorbanssi luettiin aallonpituudella 540 nm käyttämällä Multiskan-levylukijaa (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Nitriitin läsnäolo määritettiin käyttämällä NaNO-standardikäyrää. Inaktivoituja soluja (altistettuna yksinään elatusaineelle) käytettiin negatiivisena kontrollina ja aktivoituja soluja positiivisena kontrollina.

2.10.Ihonkorvikkeiden tuotanto

Terveet ihonkorvikkeet valmistettiin itsekokoamismenetelmällä, osittain modifioituna käyttämällä 6-kuoppalevyjä [20,21]. Lyhyesti sanottuna terveiltä luovuttajilta peräisin olevia fibroblasteja P5:ssä kylvettiin tiheydellä 1,5 × 105 solua/kuoppa ja viljeltiin 26 päivää DMEM:ssä, johon oli lisätty 50 ug/ml (plus)-natrium-L-askorbaattia (Sigma, St. Louis, MO, USA) kunnes ne muodostivat käsiteltäviä levyjä. Sitten kaksi fibroblastilevyä irrotettiin ja asetettiin päällekkäin ihoekvivalentin muodostamiseksi. Ihoekvivalentteja inkuboitiin 37 asteessa 8-prosenttisessa CO:n ilmakehässä vielä kaksi päivää, jotta arkki fuusioitui ja näin muodostui uusi ihon korvikekerros. Tämän jakson jälkeen terveiltä luovuttajilta peräisin olevat keratinosyytit P2:lla kylvettiin ihoekvivalenttiin 1 × 10 asteen soluja/ekvivalentti ihon korvikkeiden epidermaalisen kerroksen muodostamiseksi ja viljeltiin seitsemän päivää DMEMH:ssa, johon oli lisätty 50 ug/ml (plus) -natrium-L-askorbaatti (Sigma, St. Louis, MO, USA) keratinosyyttien lisääntymisen mahdollistamiseksi. Sitten ihon korvikkeet nostettiin ilma-neste-rajapinnalle edistämään solujen erilaistumista. Ilman ja nesteen rajapinnassa ihon korvikkeita viljeltiin väliaineella, josta puuttui EGF, jotta saatiin kerrostunut epiteeli, joka edustaa in vivo ihoa. Neljätoista päivää ilma-neste-rajapinnalle nostamisen jälkeen ihon korvikkeita käsiteltiin kolme kertaa viikossa yhden viikon ajan uutteen kantaliuoksella, joka oli laimennettu viljelyalustaan ​​(K. Angustifolia -uutteen lopullinen pitoisuus 25 ug/ml). Yhteensä 56 päivän viljelyn jälkeen otettiin ihonkorvikebiopsiat ja analysoitiin histologialla ja immunofluoresenssivärjäyksellä.

2.11. Histologiset analyysit

Ihonkorvikebiopsiat kustakin tilasta kiinnitettiin HistoChoice-liuokseen (Amresco, Solon, OH, USA) ja upotettiin parafiinivahaan. Sitten leikattiin 5 μm paksut osat ja värjättiin Massonin Trichromella käyttämällä Weigertin hematoksyliini-, fuchsin-ponceau- ja aniliinisinisiä väriaineita. Dermis ja elävä orvaskesi paksuus mitattiin ImageJ-ohjelmistolla (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA). Paksuusmittauksia varten analysoitiin kolme erilaista solupopulaatiota, joista jokaisesta otettiin kaksi edustavaa kuvaa kutakin tilaa kohti ja tehtiin 10 mittausta per kuva yhteensä 60 mittausta kohden.

2.12. Immunofluoresenssivärjäys

Ihonkorvikebiopsiat kustakin sairaudesta upotettiin Tissue-Tek OCT Compoundiin (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA), jäädytettiin nestetypessä ja pidettiin sitten -80 asteessa, kunnes niitä tarvittiin. Positiivisina kontrolleina käytettiin pakastettuja leikkeitä normaalista ihmisen ihosta. Epäsuora immunofluoresenssivärjäys suoritettiin asetoniin kiinnitetyille 6 um paksuille kryosektioille. Ensisijaiset käytetyt vasta-aineet olivat: kanin polyklonaalinen anti-elastiini (gG) (laimennus 1:800, Abcam, Cambridge, MA, USA), kanin polyklonaalinen anti-kollageeni-1 (IgG) (laimennus 1:300, Cedarlane, Burlington, ON, Kanada), kanin polyklonaalinen anti-kollageeni-3 (IgG) (laimennus 1:200, Cedarlane, Burlington, ON, Kanada) ja kanin polyklonaalinen anti-akvaporiini-3(IgG) (laimennus 1:500, Abcam, Cambridge, MA, USA). Toissijainen vasta-aine oli aasin anti-kanin IgG (H plus L)Alexa 488 (laimennus 1:1600, Life Technologies, Eugene, OR, USA). Sekundaarisen vasta-aineen jälkeen solutumat leimattiin kiinnitysväliaineella DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA). Kunkin proteiinin fluoresenssin intensiteetin puolikvantifioimiseksi immunofluoresenssivärjäyksen pikseliintensiteetti mitattiin käyttämällä ImageJ-ohjelmistoa (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA). Lyhyesti sanottuna tutkitun proteiinin koko ihokerros (dermis tai elävä orvaskesi) analysoitiin mittaamalla kunkin alueen keskimääräinen harmaaarvo. Käsiteltyjen ihonkorvikkeiden fluoresenssin intensiteettiä verrattiin kontrolli-ihonkorvikkeiden fluoresenssin intensiteettiin, jotta voidaan arvioida hoitojen yhteydessä havaittu muutos proteiinin ilmentymisessä.

2.13. Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistiin keskiarvoina ± standardipoikkeama. MTI-määrityksen, antioksidanttisolupohjaisen määrityksen ja tulehdusta ehkäisevän vaikutuksen tilastollinen analyysi suoritettiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), jota seurasi Dunnettin post hoc -testi (p-arvo).<0.05 compared="" to="" control="" at="" 0="" μg/ml）="" or="" a="" bonferroni's="" post="" hoc="" test=""><0.05 compared="" to="" controls).="" thickness="" measurements="" were="" analyzed="" with="" a="" t-test.="" results="" were="" considered="" significant="" when=""><0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" with="" r="" software="" (v3.5.2,="" rcmdr="" v2.5-1,="" r-core="" team="" 2018,="" r="" foundation,="" vienna,="">

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Antioxidants 2021, 10, 1373. https://doi.org/10.3390/antiox10091373 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants