Kazakstanin tasavallassa kasvavan Cistanche Salsa Stolonsin antinosiseptiivinen aktiivisuus

Kasvimateriaali

Cistanche salsa(CAMey.) Beck, Orobanchaceae,stolonit kerättiin Moinkumin autiomaassa, Bakanasin kylässä, heinäkuussa 2014 Almatyssa. Kasvimateriaalin tunnisti tohtori G. Sitpayeva Kazakstanin tasavallan opetus- ja tiedeministeriön kasvitieteen ja fytointroduction-instituutista, jonne se talletettiin numerolla 01-04/306.

Kemiallinen analyysi

StoloniaC. salsa(2 g) saatettiin mikroaaltouuttoon. Aluksi materiaali jauhettiin 0.001–2.000 mm:ksi ja asetettiin sitten hermeettiseen astiaan uutettavaksi 10 minuutiksi 100–1100 asteessa 80-prosenttisella etanolilla ( suhde 1:10). Hydroetanoliuute (CSHE) analysoitiin HPLC-MS:llä. Raakauute liuotettiin metanoliin (9,6 mg/ml) ja suodatettiin 0,45 um:n läpi.mm Teflonkalvo ennen analyysiä. Nestekromatografi HP 1100 -sarjan malli (yritys Agilent Technologies, Inc., CA, USA), joka on varustettu virtaavalla tyhjiökaasunpoistolaitteella, nelikanavaisella matalapainegradienttipumpulla ja automaattisellainjektori. Fenoliyhdisteet erotettiin kromatografisesti kolonnilla Zorbax Eclipse XDB-C18, 2.1× 50 mm, täytetty oktadekyylisilyylisilikageelipolymeerillä (1.8μ). Kromatografinen analyysi suoritettiin liikkuvan faasin virtauksella 0,2ml/min, eluentin käyttöpaine 175–200 kPa, kolonniuunin lämpötila 30 astetta, näytteen tilavuus 2 ml, gradienttieluentin syöttötapa: 0–36 min 10 prosenttia A – 90 prosenttia B; 36 min – 100 % B (eluentti A: metanoli, eluentti B: 0,2 % muurahaishappoliuos). Havaitseminen suoritettiin UV-säteilyllä aallonpituuksilla 254, 334, 350, 410, 450 ja 550nm. Saatujen retentioaikojen, UV- ja massaspektrien vertailua vertailuyhdisteiden vastaaviin käytettiin kemiallisten yhdisteiden tunnistamiseen uutteessa. Kvantitatiivinen analyysi suoritettiin käyttämällä standardia verbaskosidiaja ekinakosidi analysoitiin samoissa kromatografisissa olosuhteissa. Niiden kalibrointikäyrät mahdollistivat toistensa fenyylipropanoidien määrän laskemisenglykosidi tämän kasvin etanoliuutteessa. Menetelmää ei vahvistettu.

Eläimet

Sveitsin Webster-hiiret (20-25g, kaksi kuukautta vanha) käytettiin tässä tutkimuksessa (lahjoittaja Instituto Vital Brazil, Niterói, RJ, Brasilia). Eläimiä pidettiin normaaleissa olosuhteissa (valo-pimeä sykli 12 h, 22 ± 2 astetta ja 70-80 % kosteus. Ruoka ja vesiad libitum). Eläimet saivat vain vettä, jotta ruoka ei häirinnyt aineen imeytymistä 12h ennen kokeiden alkamista. Sopeutuminen laboratorio-olosuhteisiin tapahtui vähintään 1 h ennen jokaista testiä. Kaikki protokollat ​​suoritettiin eläinten kokeellisen kivun tutkimisen eettisiä standardeja koskevien ohjeiden mukaisesti, ja niissä noudatettiin kansallisen valvontaneuvoston hyväksymiä periaatteita ja ohjeita.Animal Experimentation (CONCEA), hyväksymäBiomedical Science Institute/UFRJ, Ethical Committee for Animal Research, ja sai numeron DFBCICB015-04/16. Kaikki kokeelliset protokollat ​​suoritettiin valovaiheen aikana. Eläinten lukumäärä ryhmää kohti pidettiin minimissä ja CONCEAn sääntöjen mukaisesti. Jokaisen kokeen lopussa hiiret tapettiin ketamiini/ksylatsiinin yliannostuksella.

Hoidot

Tässä tutkimuksessa CSHE arvioitiin arvoilla 10, 30 ja 100 mg/kg. Uute liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO, Fisher Biotech) kantaliuoksen valmistamiseksi 100 °C:ssa. mg/ml. PBS:ää käytettiin laimentimena eri annosten valmistukseen. Liuokset, jotka sisältävät 10, 30 ja 100mg/kg:n hydroetanoliuutettaC. salsaolivat valmiita. Käytetyt standardilääkkeet olivat morfiini 2,5mg/kg (Merck, laimennettu fosfaattipuskurisuolaliuokseen (PBS)), asetyylisalisyylihappo 200mg/kg (Sigma Aldrich, liuotettu 5M natriumhydroksidia(NaOH) 0,9 prosentin suolaliuoksessa) ja kapsatsepiini 10 nMol tassua kohti. Negatiiviselle kontrolliryhmälle annettiin suolaliuosta plus DMSO:ta (samassa pitoisuudessa kuin suurimmassa uuttekäsittelyssä). Kaikki hoidot (testattu uute ja standardit) annettiin suun kautta. Ainoa poikkeus oli kapsatsepiini, joka annettiin intraplantaarisella injektiolla.

Formaliinin aiheuttama akuutti kipu

2,5-prosenttista formaliinia (37-prosenttista formaldehydiä) ruiskutettiin (20ul) hiiren oikean takakäpälän plantaarialueella 60min käsittelyn jälkeen (hydroetanoliuuteC. salsatai asetyylisalisyylihappoa 200 mg/kg tai morfiinia 2,5 mg/kg) (Matheus et al., 2005). Eläimet asetettiin yksitellen läpinäkyvään lasikammioon ja sekunteina se aika, jonka ne käyttivät tassuaan nuolemiseen formaliini-injektion jälkeen, kirjattiin ja analysoitiin kahdella eri jaksolla, varhaisen vaiheen neurogeenisen kivun (0–5 minuuttia injektion jälkeen) ja myöhäisen vaiheen tulehduskipu (15–30 min injektion jälkeen).

Kapsaisiinin aiheuttama nosiseptio

Tämä testi perustui Sakurada et ai. joillakin modifikaatioilla (Sakurada et ai., 1992). Kapsaisiini (20 ul) C18H27EI3(Galena, Campinas, SP) injektoitiin hiiren oikean takakäpälän plantaarialueelle (1,6 ug/käpälä) tunnin kuluttua käsittelystä (hydroetanoliuuteC. salsatai kapsatsepiini 10 nMol/tassu). Eläimet asetettiin yksitellen lasikammioon ja tassun nuolemisen kesto(t) kirjattiin välillä 0-5minuuttia kapsaisiini-injektion jälkeen ja sitten analysoidaan.

Glutamaatin aiheuttama nosiseptio

Beirithin et ai. kuvaamassa menetelmässä. (2002), glutamaattiliuos PBS:ssä (20 ul) (l-glutamiinihappoa, Sigma-Aldrich, 3,7 ng/käpälä) injektoitiin hiiren oikean takakäpälän plantaarialueelle tunnin kuluttua käsittelystä (hydroetanoliuuteC. salsatai morfiinia 2,5 mg/kg). Eläimet asetettiin yksitellen lasikammioon ja käpälän nuolemisen kesto (sekunteina) kirjattiin välillä 0 - 15 minuuttia glutamaatti-injektion jälkeen ja analysoitiin sitten.

Tilastollinen analyysi

Kemialliset tiedot esitetään viiden kokeen keskiarvona ± SD. Kaikki farmakologiset koeryhmät koostuivat vähintään kuudesta hiirestä. Yksisuuntaisen varianssin analyysi (ANOVA), jota seurasi Dunnettin testi, mahdollisti tilastollisen merkitsevyyden visualisoinnin ryhmien välillä GraphPad Prism 5.0 -ohjelmistolla.parvoja pidettiin merkittävinä, kun ne olivat alle 0.05 (p < 0.05).

Keskustelu

Yhteensä kymmenen fenyylipropanoidiglukosidia tunnistettiinC. salsa(kasvaa Kazakstanissa) hydroetanoliuute. Ekinakosidi (10,98 mg/g), akteosidi (9,44 mg/g) ja tubulosidi B (7,94 mg/g) olivat tärkeimmät tunnistetut yhdisteet. Saadut tiedot korreloivat saatavilla olevan kirjallisuuden kanssa lajeistaCistanchekasvaa Aasian eri alueilla (Zhou et al., 2014, Xie et al., 2005, Jiang et al., 2009). Ekinakosidi ja akteosidi ovat tärkeimmät komponentit, jotka muodostavat perustan virallisten lajien standardoinnilleC. deserticolajaC. tubulosa, joka on lueteltu Kiinan farmakopeassa vuonna 2005. Ehdotamme, että näitä yhdisteitä voitaisiin käyttää myösC. salsastoloneja Kazakstanista, koska ne ovat tärkeimmät tutkitussa hydroetanoliuutteessa.

Tämän tutkimuksen farmakologisten tulosten perusteella voidaan olettaa, että CSHE on tehokas aine neurogeenista kipua ja tulehdusta vastaan, kuten formaliinitestissä havaittiin. Parhaan tietomme mukaanC. salsaei ole koskaan testattu sen antinosiseptiivisten vaikutusten suhteen. Tutkimus vuodelta 2002C. deserticola(Lin ym., 2002) on osoittanut, että tällä kasvilla oli antinosiseptiivisiä ja anti-inflammatorisia vaikutuksia, kun sitä testattiin sellaisilla malleilla kuin täydellinen vääntely, formaliini ja tassun turvotus. Vaikka aktiivisten uutteiden pääaineosia ei yritetty tutkia, he pitivät butanoliuutetta ja vesikerrosta aktiivisina. Ei ole yllättävää, että nämä liuottimet ovat polaarisuusasteikolla, joka vastaa fenyylipropanoidiaglykosideja löytyyC. salsa. Lisäksi Lin ja työtoverit totesivat, että antinosiseptiivinen toimintaC. deserticolauutteet eivät johtuneet yhdisteen vaikutuksesta opiaattireseptorissatai liittyvät immuunijärjestelmään. Tutkimuksessamme runsaasti fenyylipropanoideja sisältävä uute osoitti aktiivisuutta formaliinitestin molemmissa vaiheissa. Havaittu aktiivisuus johtui itse asiassa tutkitusta farmakologisesta kohteesta eikä mistään mahdollisesta motorisesta muutoksesta, kuten rota sauvatesti osoittaa. Formaliinitestin tulokset osoittavat mahdollisen neurogeenisen kivun sekä sen aiheuttaman kivuntulehduksen välittäjät. Aluksi päätimme tutkia neurogeenisen kivun reittiä. Koska samanlaiset yhdisteet muista aiemmin tutkituista lajeista eivät osoittaneet opiaattireseptoriaktiivisuutta, päätimme testata muita malleja, kuten glutamaatti- ja kapsaisiinimalleja.

Glutamaatti on kiihottava välittäjäainejolla on tärkeä rooli kivun moduloinnissa koko ääreis- ja keskushermostossa. Tätä vaikutusta välittävät ligandin ohjaamat ionotrooppiset glutamaattireseptorit(iGluRs) ja metabotrooppiset glutamaattireseptorit. iGluR:t voidaan jakaaN-metyyli-d-aspartaatti (NMDA) ja -amino-3-hydroksi-5-metyyli-isoksatsoli-4-propionihappo (AMPA) (Kolber, 2015)). Tutkimukset ovat osoittaneet, että kun antagonisoidaan NMDA- ja AMPA-reseptoreita ketamiinilla jakainaattiVastaavasti havaitaan antinosiseptiovaikutus. Näihin reseptoreihin kohdistetut antagonistit ovat kuitenkin tähän mennessä aiheuttaneet huomattavan haitallisen vaikutuksen, ja tästä syystä on tehty uusi tutkimus, joka keskittyy mGluR:iin toivoen, että tämän reseptorin kautta välittämä lääke aiheuttaisi vähemmän sivuvaikutuksia (Palazzo et al., 2014). CSHE:n testaustulokset osoittivat, että tämä hoito oli tehokas vähentämään glutamaatin aiheuttamaa kipua. Vielä ei kuitenkaan tiedetä, välittyykö tämä vaikutus ionotrooppisten ja/tai metabotrooppisten reseptorien kautta. Morfiini on yksi saatavilla olevista lääkkeistä, joilla on vaikutusta glutamatergiseen siirtymiseen (Deyama et al., 2007).). Kirjallisuudessa on raportoitu, että glutamaattireseptorin aktivaatio lisää TRPV1-vasteita (Szteyn et ai., 2015). Tästä syystä on mahdollista, että CSHE:n havaittu vaikutus voi johtua aktiivisuudesta TRPV1:een eikä välttämättä suorasta vasteesta glutamaattireseptoreihin.

Tämän tutkimuksen seuraava vaihe oli tehdä käpälän nuolemiskoe käyttämällä kapsaisiinia algesic-aineena, joka on TRPV1-reseptorin agonisti. Tulokset osoittivat, että CSHE todellakin vähensi kipua TRPV1-reseptorin kautta.

CSHE:n tapauksessa lähes kaikissa testatuissa menetelmissä havaittiin, että annoksella 30 mg/kg saavutettiin parempia tuloksia kuin 100 mg/kg:lla. Tämä voi johtua liuoksen kyllästymisestä, mikä johtaa saostuneisiin yhdisteisiin ja tehokkaasti pienempään määrään lääkkeitä, jotka ovat biologisesti käytettävissä.

Kazakstanin CSHE-uutteen vakiintuneen kemiallisen koostumuksen vahvistaminen oli tärkeä askel, koska sen sisältämien tärkeimpien aineosien antinosiseptiiviset/anti-inflammatoriset vaikutukset on jo jollain tavalla vahvistettu. Esimerkiksi ekinakosidi vahvistettiin yhdeksi aktiivisista aineista, joka on vastuussa antinosiseptiivisestä vaikutuksesta.Echinaceae(Hostettmann, 2003). Myös Schapovalin ja työtovereiden aikaisemmassa tutkimuksessa (Schapoval et al., 1998) todettiin akteosidin yhdeksi tärkeimmistä vaikuttavista aineista etanoliuutteessa, joka on valmistettuStachytarpheta cayennensistassun turvotus- ja keittolevymalleilla arvioituna. Backhouse ja työtoverit (Backhouse et al., 2008) pitivät myös akteosidia aktiivisena ainesosanaBuddlejaglobosakäyttämällä useita kivunarviointimalleja, mukaan lukien formaliinitesti. Uusia formulaatioita kehitetään nyt käyttämällä viimeisintä tietämystä stabiilisuuden lisäämiseksi ja akteosidin antinosiseptiivisen vaikutuksen pidentämiseksi (Isacchi et al., 2016).

Johtopäätös

Kazakstanin stoloneista tunnistettiin kymmenen fenolista ainettaC. salsaHPLC/MS-analyysillä. Nämä yhdisteet voivat olla vastuussa tässä suoritetuissa kokeellisissa malleissa havaitusta antinosiseptiivisestä aktiivisuudesta. Ottaen huomioon, että Kazakstanin alueella sukuCistancheedustaa pääasiassa lajejaC. salsa, voimme suositella sen korjuuta ja standardointia käyttämällä ekinakosidia ja akteosidia standardiyhdisteinä, jotta saadaan hyvälaatuista raaka-ainetta perinteiseen kiinalaiseen lääketieteeseen.