Eri kurkumalajien antityrosinaasiominaisuudet ja aktiivisten yhdisteiden eristäminen Curcuma Amadasta

Jesmin Akter1 ● Md. Zahorul Islam1,2 ● Md. Amzad Hossain1 ● Kensaku Takara1

1 Maataloustieteellinen tiedekunta, Ryukyus-yliopisto, Okinawa, Japani

2 Farmakologian laitos, eläinlääketieteellinen tiedekunta, Bangladeshin maatalousyliopisto, Mymensingh, Bangladesh

Lisätietoja:Scotty.Wang@wecistanche.com

Abstrakti

Kurkumaa käytetään perinteisesti ihokosmetiikkana joissakin uskonnollisissa ja kulttuurisissa tilaisuuksissa Intian niemimaalla. Tässä tutkimuksessa vertailimme neljän Curcuma spp.:n, nimittäin C. xanthorrhizan, C. aromaattisen, C. amadan ja C. zedoarian tyrosinaasia estäviä ominaisuuksia. Tyrosinaasi-inhibiittoreiden biotestiohjattu eristys ja puhdistus käyttämällä silikageelikolonnia ja korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa. Yhdisteiden rakenteellinen tunnistus suoritettiin käyttämällä1H NMR:tä,13C

NMR ja nestekromatografia-tandem-massaspektrometria. C. amada osoitti korkeinta tyrosinaasia estävää aktiivisuutta IC50-arvon ollessa 53,4 ug/ml. Siksi se valittiin tyrosinaasin estäjien eristämiseen ja puhdistamiseen. Puhdistetut yhdisteet olivat zederoni (1), furanodienoni (2), 1,5-epoksi-3-hydroksi-1-(3,4-dihydroksi-5-metoksifenyyli){ {13}}(4-hydroksifenyyli)heptaanit (3), 3,5-dihydroksi-1-(3,4-dihydroksifenyyli)-7-({{22 }}hydroksi-3-metoksifenyyli)heptaanit (4) ja 1,5--epoksi-3-hydroksi-1-(3,4-dihydroksi-5-metoksifenyyli) -7-(4-hydroksi-3-metoksifenyyli)heptaanit (5). Sienen IC50-arvotanti-tyrosinaasiyhdisteiden 1, 2, 3, 4 ja 5 aktiivisuus olivat 108,2, 89,2, 92,3, 21,7 ja 41,3 uM, vastaavasti. Nämä yhdisteet estivät myös solunsisäistä tyrosinaasin aktiivisuutta vähentäen siten melaniinin synteesiä B16F10-melanoomasoluissa. Yhdiste 4 oli merkittävästi vahvempianti-tyrosinaasikuin arbutiinilla (positiivinen kontrollilääke). Merkittävää eroa ei havaittu tyrosinaasia estävässä vaikutuksessa yhdisteen 5 ja arbutiinin välillä. Tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että C. Amanda on lupaava luonnollisten tyrosinaasin estäjien lähde melanogeneesin estämiseksi ja sitä voitaisiin käyttää valkaisevana kosmeettisena aineena.

Avainsana: Curcuma amada ● Aktiiviset yhdisteet ● NMR ● Antityrosinaasi ● Antimelanogeeninen

Cnuolla Cistancheen anti-tyrosinaasia varten

Johdanto

Melaniini on hiusten ja ihon musta pigmentti, ja se on välttämätön ihon suojaamiseksi UV-säteilyltä. Pigmenttiä tuottavat melanosyyttisolut, jotka ovat läsnä dermiksen tyvikerroksessa fysiologisen prosessin kautta, jota kutsutaan melanogeneesiksi. Melaniinin epänormaali tuotanto aiheuttaa kuitenkin dermatologisia häiriöitä, kuten pisamia, melasmaa, lentigiiniä, ikääntymistä, ephelidejä ja tulehduksen jälkeistä hyperpigmentaatiota [1]. Elintarviketeollisuudessa hedelmien ja vihannesten hyperpigmentaatio johtaa merkittäviin ravitsemuksellisen laadun ja markkina-arvon menetyksiin [2]. Melanogeneesiä voidaan hallita estämällä tyrosinaasin, melaniinin synteesin nopeutta rajoittavan entsyymin aktiivisuutta nisäkkäissä, kasveissa, mikro-organismeissa ja sienissä [3]. Siksi tyrosinaasin aktiivisuuden estäminen estää hyperpigmentaatiota ja johtaa ihon valkaisuun. Se säätelee myös vihannesten ja hedelmien laatua säätelemällä vihannesten ja elintarvikkeiden ei-toivottua ruskistumista. Useimmat ihoa vaalentavat aineet, kuten hydrokinoni, atselaiinihappo, kojiinihappo ja arbutiini, ovat tehokkaita tyrosinaasin estäjiä. Niillä on kuitenkin useita ei-toivottuja vaikutuksia, kuten sytotoksisuus, okronoosi, vitiligo, ärsytys, ihon hilseily ja punoitus [4]. Lisäksi kojiinihapolla ja -arbutiinilla on huono formulaatiostabiilius ja ihon läpäisykyky ja alhainen teho in vivo [5]. Joillakin orgaanisilla ja epäorgaanisilla elohopeasuoloilla on melanogeenisia vaikutuksia, ja niitä käytetään ihon valkaisuaineissa. Ihon kautta imeytyessään elohopeayhdisteet voivat kuitenkin aiheuttaa myrkyllisiä vaikutuksia, kuten ihon värimuutoksia, munuaisvaurioita, allergisia reaktioita ja arpia [6]. Siten vähemmän toksisten ja tehokkaampien tyrosinaasin estäjien tutkimusta tarvitaan. Kurkuma (suku: Zingiberaceae; suku: Curcuma), perinteinen lääkekasvi, joka kasvaa pääasiassa Aasian ja Afrikan trooppisilla ja subtrooppisilla alueilla, ja sillä on laaja kirjo farmakologisia tehtäviä. Sitä on perinteisesti käytetty avioliittoa edeltävissä rituaaleissa tuhansien vuosien ajan Intian niemimaalla ihoa vaalentavana aineena. Kurkuman uskotaan parantavan ihon väriä vähentämällä kasvojen karvojen kasvua, aknea ja ihon ikääntymistä [7, 8]. Siksi kurkumalla täydennettyjä ihonhoitotuotteita on kaupallisesti saatavilla markkinoilla [9]. Yli 70 kurkumalajia/lajiketta, joilla on erilaisia ​​kemiallisia ja farmakologisia ominaisuuksia, on tunnistettu. Tieteellistä tietoa eri kurkumalajien melanogeenisistä ominaisuuksista ja kurkuman mahdollisista aktiivisista aineosista ei kuitenkaan ole. Kurkuminoidit ovat tärkeimmät aktiiviset yhdisteet, jotka vastaavat suurimmasta osasta kurkuman biologisista toiminnoista. Kurkuminoideilla on potentiaalia kosmeettisissa valmisteissaantioksidantti, tulehdusta estävä,ja ihoa vaalentava aine [7, 8]. Aiemmassa tutkimuksessa havaitsimme kuitenkin merkittäviä vaihteluita kurkumin kurkuminoidipitoisuudessa, ja jotkin lajit (C. amada, C. zedoaria) eivät edes sisältäneet kurkumiinia [10]. Kerroimme myös sienilääkkeistä,antioksidantti, ja eri kurkumalajien ja -lajikkeiden verisuonia laajentava vaikutus [10–13]. Siksi tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida eri kurkumalajien, nimittäin C. xanthorrhizan, C. aromatican, C. amadan ja C. zedoaria, vaikutuksia tyrosinaasientsyymiin ja tunnistaa spesifiset kemialliset yhdisteet, jotka ovat vastuussa kurkumasta.anti-tyrosinaasitoiminta. Arvioimme myös puhdistettujen aktiivisten yhdisteiden tyrosinaasia inhiboivaa aktiivisuutta ja melanogeenisiä vaikutuksia melaniinin synteesiin B16F10-melanoomasoluissa.

tulokset ja keskustelu

Neljästä eri kurkumalajista C. amadan MeOH-uute osoitti suurimman sienen tyrosinaasia estävän vaikutuksen IC50-arvolla 53,4 ± 2,7, jota seurasivat C. xanthorrhiza, C. aromaattinen ja C. zedoaria (kuva 1a). Kurkumiini on kurkuman (Curcuma longa) tärkein aktiivinen komponentti, ja sillä on laaja valikoima biologisia vaikutuksia, mukaan lukien syöpää ehkäisevä, anti-inflammatorinen, antibakteerinen, sieni- ja antioksidanttivaikutus. Se osoitti 75-kertaisesti voimakkaampaa antityrosinaasiaktiivisuutta kuin arbutiini ja kojiinihappo [14]. Aiemmassa tutkimuksessa raportoimme kuitenkin, että kurkumiinin pitoisuuksissa oli merkittäviä eroja eri kurkumalajeissa [10].

Kurkumiinia esiintyi C. xanthorrhizassa ja C. aromaattisessa, mutta ei C. zedoariassa ja C. amadassa [10]. Tämän tutkimuksen mielenkiintoiset havainnot ovat, että ilman kurkumiinia C. amada osoitti voimakasta tyrosinaasia estävää aktiivisuutta. Tämä tulos osoittaa, että C. amadassa täytyy olla joitakin aktiivisia yhdisteitä, jotka johtuvat sen vahvasta antityrosinaasivaikutuksesta. C. xanthorrhizan ja C. aromatican antityrosinaasiaktiivisuus saattaa johtua niiden kurkumii- nipitoisuudesta. Emme kuitenkaan voineet sulkea pois muiden yhdisteiden mahdollisuutta. C. amadan MeOH-uute fraktioitiin vedellä, n-heksaanilla ja EtOAc:lla. Näiden kolmen fraktion joukossa EtOAc osoitti merkittävästi voimakkaampaa estävää vaikutusta kuin vesi ja n-heksaani (kuvio 1b). Siksi EtOAc-osa otettiin lisäfraktiointia varten. Kuuden fraktion antityrosinaasiaktiivisuudet [n-heksaani:EtOAc; 100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) ja 0:100 (F6)] saatu C. amadan EtOAc-osasta verrattiin. Näiden kuuden fraktion joukossa F6 ja F3 osoittivat merkittävästi korkeampaa antityrosinaasiaktiivisuutta kuin muut (kuvio 1c). Sitten fraktioista F3 ja F6 olevien viiden yhdisteen kemialliset rakenteet tunnistettiin niiden1H NMR- ja13C NMR-spektrien mukaan. Huipputiedot olivat seuraavat:

Yhdiste 1:

Väritön neulan muotoinen kristalli; UV λmax: nm 234, 285. ESI-MS (plus) m/z: 247,3 [M plus H] plus, 229,4 [M plus H-H20] plus. 1H-NMR (CD3OD): 8 7,22 (1H, s, H{15}}), 5,59 (1H, br d, J=12 Hz, H{{2{86}}}}) 3,99 (1H, s, H-5), 3,85 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3,69 (1 H, d, J=16 Hz, H-9b), 2,57 (1H, dddd, J=13, 13, 12, 4 Hz, H-2a), 2,26 (1H, m, H{{46) }}a), 2,20 (1H, m, H{{50}}b), 2,09 (3H, s, H-13), 1,57 (3H, s, H{58}}), 1,32 (1H, ddd, J=13, 13, 4 Hz, H-3b), 1,28 (3H, s, H{69}}). 13C-NMR (CD3OD): 8 194,2 (C{75}}) 160,2 (C{78}}), 139,7 (C12), 132,8 (C{84}}), 132,0 (C{87}}). ), 124,3(C{90}}), 123,0(C-7), 67,8(C-5), 65,2(C-4), 42,5(C-9 ), 39,0(C{105}}), 25,4(C-2), 15,7 (C-15), 15,4(C-14), 10,7(C{117}} ) (Lisätiedot). Kun näitä tietoja verrattiin kirjallisuudessa raportoituihin [15, 16], aine tunnistettiin zederoniksi (kuva 2). Se on seskviterpeeni, joka eristettiin aiemmin C. amadasta ja C. zedoariasta, ja sen on raportoitu sen kipua lievittävistä, tulehdusta ehkäisevistä, sieniä ehkäisevistä ja sytotoksisista vaikutuksistaan ​​[12, 17–20].

Yhdiste 2:

Väritön öljy; UV λmax: nm 243, 280. ESIMS (plus) m/z: 231.{83}} [M plus H] plus, 223,3 [M plus H-H2O] plus. 'H-NMR (CD3OD): 8 7,16 (1H, s, H{14}}), 5,83 (1H, s, H{18}}), 5,21 (1H, dd, J=12 Hz) , 5 Hz, H-1), 3,73 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3,63 (1H, d, J=16 Hz, H -9b), 2,45 (1H, ddd, J=15 Hz, 11 Hz, 4 Hz, H-3a), 2,31 (1H, m, H-2a ), 2,2{92}} (1H, dddd, J=12 Hz, 12 Hz, 12 Hz, 4 Hz, H-2b), 2,06 (3H, s, H{{57} }), 1,92 (3H, s, H{61}}), 1,89 (1H, m, H-3b), 1,25 (3H, s, H{69}}). 13C-NMR (CD3OD): 8 191,8 (C{75}}), 158,6 (C{78}}), 147,6 (C{81}}), 140,0 (C{84}}), 136,1 (C) C-10), 133,3 (C-5), 132,0 (C-1), 124,6 (C-11), 123,1 (C-7), 42,4 (C) C-9), 41,4 (C-3), 27,3 (C-2), 19,3 (C-14), 15,9 (C-2), 9,9 ( C-13) (lisätiedot). Kun näitä tietoja verrattiin kirjallisuudessa [21] raportoituihin, aine tunnistettiin furanodienoniksi (kuva 2). Se eristettiin Lindera pulcherrima (Nees.) Benthistä. ex koukku. f [22], Curcuma zedoaria [19], Curcuma amada [12] ja Curcuma wenyujin [23]. Se on furanooskviterpenoidi, jolla on sieniä [12], tulehdusta [19], syöpää ehkäisevää [24], antibakteerista ja antioksidanttivaikutusta [22].

Yhdiste 3:

Kellertävä öljy; UV λmax: nm 275. ESIMS (plus) m/z: 383,3 [M plus Na] plus, 361,3 [M plus H] plus, 343,2 [M plus H-H2O] plus. 1H-NMR (CD3OD): 8 6,99 (2H, dd, J=9, 2 Hz, H-2´´, -6´´), 6,67 (2H, d, J=9 Hz, H-3´´, -5´´), 6,52 (2H, s, H-2´, -6´), 4,63 (1H) , br b, J=12 Hz, H-1), 4,21 (1 H, m, H-3), 3,89 (1 H, m, H-5), 3,85 ( 3H, s, 5'-OCH3), 2,63 (2H, m, H-7), 1,82 (1H, m, H-2a), 1,78 (1 H, m, H{{6{ {107}}}}a), 1,73 (1H, m, H-2b), 1,69 (1H, m, H-4a), 1,68 (1H, m, H{{72} }b), 1,53 (1 H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): 8 156,3 (C-4´´), 149,5 (C-5´), 146,4 (C-3´), 134,5 (C{91}} ´), 134,44 (C-1´), 134,41 (C-1´´), 130,4 (C-2´´, -6´´), 116,1 (C{ {104}}´´, -5´´), 108,0 (C-2´), 102,8 (C-6´), 75,2 (C-1), 72,6 ( C-5), 65,6 (C3), 56,6 (5'-OCH3), 41,1 (C-2), 39,5 (C-4), 39,2 (C-6) 31,8 (C-7) (lisätiedot). Kun näitä tietoja verrattiin kirjallisuudessa [25] raportoituihin tietoihin, aine tunnistettiin 1,5-epoksi-3-hydroksi-1-(3,4-dihydroksi{ {145}} metoksifenyyli)-7-(4-hydroksifenyyli)heptaanit (kuva 2). Se eristettiin Zingiber officinalen juurakoista ja niiden antioksidanttisia ominaisuuksia tutkittiin [25].

Yhdiste 4:

Viskoosi siirappi; UV λmax: nm 281. ESIMS (plus) m/z: 385,3 [M plus Na] plus, 363,3 [M plus H] plus, 345,2 [M plus H-H2O] plus. 1H-NMR (CD3OD): 8 6,75 (1H, d, J=2 Hz, H-2'), 6,68 (1H, d, J=8 Hz, H{{21) }}´), 6,64 (1H, J=8 Hz, H-5´´), 6,61 (1H, J=2 Hz, H-2´´), 6,60 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6,49 (1 H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´´), 3,80 (3H, s, 3'-OCH3), 3,73 (2H, m, H-3, -5), 264-2,47 (4H, m, H{{59) }}a, -1b, -7a, -7b), 1.71-1,65 (4H, m, H-2a, {{ 68}}b, -6a, -6b), 1,61 (2H, m, H-4a, -4b). 13C-NMR (CD3OD): 8 148,8 (C{81}}´), 146,1 (C{84}}´´), 145,4 (C{87}}´), 144,2 (C{81}}'). ´´), 135,24 (C-1´ tai C-1´´), 135,22 (C-1´ tai C-1´´), 121,8 (C{{101 }}´), 120,6 (C-6´´), 116,5 (C-2´´), 116,3 (C-5´´), 116,1 (C-5´ ), 113,2 (C-2´), 70,94 (C-3 tai C-5), 70,92 (C-3 tai C-5), 56,4 (3 ´-OCH3), 44,9 (C-4), 40,8 (C-2, -6), 32,3 (C-1), 32,1 (C-7) (Lisätiedot). Kun näitä tietoja verrattiin kirjallisuudessa [26, 27] raportoituihin tietoihin, aine tunnistettiin öljyksi 3,5-dihydroksi-1-(3,4-dihydroksifenyyli){{150 }} (4-hydroksi-3-metoksifenyyli)heptaanit (kuva 2). Se eristettiin Tacca chantrieri [26] ja Curcumalonga L. [27] juurakoista. Ne ovat diaryyliheptanoideja, joilla on sytotoksisia [26] ja kasvaimia estäviä [27] vaikutuksia.

Yhdiste 5:

Väritön öljy; UV λ max nm: 279. ESI-MS (plus) m/z: 413,3 [M plus Na] plus, 391,3 [M plus H] plus, 373,3 [M plus HH2O] plus. 1H-NMR (CD3OD): 8 6,76 (1H, s, H-2´´), 6,67 (1H, d, J=8 Hz, H{{20}} ´´), 6,21 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6,53 (2H, s, H-2´, -6´´ ), 4,63 (1H, br d, J=12 Hz, H-1), 4,21 (1 H, m, H-3), 3,83 (3H, s, 5'-OCH3) 3,78 (3H, s, 3-OCH3), 2,65 (2H, m, H{55}}), 1,84 (1 H, m, H-2a), 1,79 (1 H, m, H-6a), 1,74 (1H, m, H-2b), 1,69 (1H, m, H-4a), 1,68 (1H, m, H{{ 75}}b), 1,53 (1 H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): 8 149,5 (C-5´), 148,8 (C-3´´), 146,4 (C-3´), 145,4 (C{94}}). ´´), 135,3 (C-1´), 135,2 (C{-1´´), 134,4 (C-4´), 121,9 (C-6´´), 116,1 (C-5´´), 113,4 (C-2´´), 108,0 (C-2´), 102,7 (C-6´), 75,2 (C{ {121}}), 72,5 (C-5), 65,6 (C-3), 56,6 (5'-OCH3), 56,3 (3''-OCH3), 41,2 (C{{140}). }), 39,4 (C-4), 39,3 (C-6), 32,2 (C-7) (lisätiedot). Kun näitä tietoja verrattiin kirjallisuudessa [20] raportoituihin tietoihin, aine tunnistettiin 1,5-epoksi-3-hydroksi-1-(3,4-dihydroksi{ {157}}metoksifenyyli)- 7-(4-hydroksi-3-metoksifenyyli)heptaanit (kuva 2), eikä niiden biologisesta aktiivisuudesta ole tietoa. Eristimme yhdisteet 3, 4 ja 5 ensimmäistä kertaa C. amadalta. Kaikilla yhdisteillä oli sienen tyrosinaasia estävää vaikutusta

Viisi yhdistettä, nimittäin zederoni, furanodienoni, 1,5-epoksi-3-hydroksi-1-(3,4-dihydroksi-5-metoksifenyyli)- 7-( 4-hydroksifenyyli)heptaanit, 3,5-dihydroksi-1-(3,4-dishy hydroksifenyyli)-7-(4-hydroksi-3- metoksifenyyli) heptaanit ja 1,5-epoksi-3-hydroksi-1-(3,4-dihydroksi-5-metoksifenyyli)- 7-(4- hydroksi-3-metoksifenyyli)heptaanit, eristettiin fraktioista F3 ja F6. Eristetyt yhdisteet osoittivat tyrosinaasivastaista aktiivisuutta konsentraatiosta riippuvalla tavalla. Viiden yhdisteen joukossa yhdiste 4 osoitti merkittävästi voimakkaampaa antityrosinaasiaktiivisuutta kuin arbutiini. Ei ollut merkittäviä eroja antityrosinaasin vaikutuksissa yhdisteen 5 ja arbutiinin välillä (kuvio 3). Eristetyn yhdisteen vaikutuksia solujen elinkelpoisuuteen tutkittiin hiiren B16F10-melanoomasoluilla. Soluja käsiteltiin yhdisteen 50, 100, 200 ja 400 µM konsentraatioilla 48 tunnin ajan. Eristetyt yhdisteet eivät osoittaneet sytotoksisia vaikutuksia 200 µM asti, mutta noin 50 prosenttia solukuolemista havaittiin kaikissa tapauksissa 400 µM pitoisuudella (kuva 4). Siten pitoisuuksia 200 µM asti käytettiin arvioimaan niiden solunsisäistä antityrosinaasi- ja anti-melanogeenista vaikutusta.

Eristettyjen yhdisteiden anti-melanogeenisten ja antityrosinaasiaktiivisuuksien määrittämiseksi arvioitiin niiden vaikutukset melaniinipitoisuuteen ja tyrosinaasiaktiivisuuteen B16F10-melanoomasoluissa. Kuten taulukosta 1 näkyy, eristetyt yhdisteemme estivät annosriippuvaisesti solunsisäistä melaniinipitoisuutta ja tyrosinaasiaktiivisuutta. Yhdiste 4 oli merkittävästi vahvempi kuin positiivinen kontrollilääke arbutiini sekä melaniinia että tyrosinaasia estävissä vaikutuksissa. Yhdisteen 5 ja arbutiinin välillä ei havaittu merkittävää eroa. Koska solujen tyrosinaasi tehostaa melaniinin tuotantoa, tyrosinaasiaktiivisuuden vähentäminen on tehokas strategia melanogeenisten aineiden kehittämiseksi. Tätä varten arvioimme intrasellulaarisen tyrosinaasiaktiivisuuden ja melanogeneesin estäviä ominaisuuksia B16F10-melanoomasoluissa. Samoin kuin sienten tyrosinaasia estävän aktiivisuuden löydökset, eristetyt yhdisteet estävät solunsisäistä tyrosinaasin aktiivisuutta ja melanogeneesiä annoksesta riippuvaisella tavalla. Eristettyjen yhdisteiden antityrosinaasivaikutukset johtivat niiden anti-melanogeenisiin ominaisuuksiin. Näiden yhdisteiden anti-tyrosinaasin ja anti-melanogeenisen aktiivisuuden järjestys oli yhdiste 4 > arbutiini > 5 > 2 > 3 > 1. Yhdisteen 4 laskettu IC50-arvo oli merkittävästi alempi kuin arbutiinilla. Yhdisteen 4 tehokkuus oli 1.9- - 5-kertainen verrattuna neljän muun yhdisteen tehokkuuteen. Yhdiste 5 osoitti myös vahvaa antityrosinaasiaktiivisuutta, joka oli verrattavissa arbutiinin aktiivisuuteen. Tuloksemme osoittivat, että yhdisteitä 4 ja 5 voitaisiin käyttää mahdollisina luonnollisina tyrosinaasin estäjinä ja ihoa valkaisuina kosmetiikkaina. Oksidatiivisen stressin on ehdotettu liittyvän melaniinin ylituotannon taustalla olevaan mekanismiin [28]. Siksi antioksidanttiroolia on tutkittu monissa ihosairauksissa, mukaan lukien fotokarsinogeneesi tai melanooma [9]. Me ja muut raportoivat aiemmin C. amadan antioksidanttisista ominaisuuksista [13, 29], jotka saattavat olla vastuussa eristettyjen yhdisteiden melanogeenisistä vaikutuksista. Tässä tutkimuksessa havaitsimme eristettyjen yhdisteiden estäviä vaikutuksia solunsisäiseen melaniinin synteesiin ja -MSH:n indusoimaan tyrosinaasiaktiivisuuteen. Siten eristettyjä yhdisteitämme voidaan käyttää aineina funktionaalisessa kosmetiikassa tehokkaiden ihonvalkaisuhoitojen kehittämiseksi.

Johtopäätös

Ehdotamme vahvasti, että C. amadalla voi olla tärkeä rooli tehokkaana tyrosinaasin estäjänä. C. amadaa ja sen bioaktiivisia yhdisteitä voitaisiin käyttää kosmeettisessa teollisuudessa luonnollisina valkaisuaineina, elintarviketeollisuudessa ruskeamisen estoaineina ja lääketieteen alalla hyperpigmentaation hoitoon. Siitä huolimatta tarvitaan lisätutkimuksia eristettyjen yhdisteiden melanogeenisten vaikutusten tutkimiseksi eläinmalleissa.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

Tyrosinaasi sienestä ja arbutiini ostettiin Sigma-Aldrich Chemical Co.:lta (St. Louis, MO, USA). L-Tyrosine oli Wako pure Chemical Industries Ltd:ltä (Osaka, Japani). Metanoli (MeOH), etyyliasetaatti (EtOAc) ja n-heksaani ostettiin yhtiöltä Nacalai Tesque (Kioto, Japani). Ostettiin silikageeli (63–200 μm, Kanto Chemical Co. Tokio, Japani) ja MeOH-d4 (CD3OD, Merck KGaA, Saksa).

Kasvimateriaalin valmistus Neljää erilaista kurkumalajia, nimittäin C. xanthorrhizaa, C. aromaticaa, C. amadaa ja C. zedoariaa, viljeltiin harmaalla maaperällä (karkeaa hiekkaa 3,6 prosenttia, hienoa hiekkaa 30,9 prosenttia). , liete 24,3 prosenttia , savi 32,8 prosenttia , pH 7,4, NO{{10}}N 0,07 prosenttia , NH4-N 0,08 prosenttia, P 4,6 ng/g, K 42,9 ng/g) Subtropical Field Science Center, Ryukyusin yliopisto, Okinawa, Japani. Kuukauden keskilämpötila oli viljelyaikana 17–29 astetta, kosteus 61–83 prosenttia ja sademäärä 22–369 mm. Tarjottiin yhteisiä maatalouskäytäntöjä, mukaan lukien lannoite ja kastelu. Juurakoita korjattiin, kun lajin kaikki versot kuihtuneet kokonaan. Juurakot pestiin, viipaloitiin ja kuivattiin kuumailmauunissa 50 asteessa 72 tuntia.

Näytteiden talteenotto

Uutokset suoritettiin liuottamalla erilainen kurkumajauhe (300 g) MeOH:hon (3 l) huoneenlämpötilassa (25 astetta) ja ilmakehän paineessa ja pidettiin kaksi päivää jatkuvalla magneettisekoituksella estämään ilman aiheuttama hapettuminen ja suojattu auringonvalolta. Liuotinliukoiset yhdisteet suodatettiin käyttämällä suodatinpaperia (nro 2, Advantec, Tokyo Roshi Kaisha Ltd., Tokio, Japani). Käytettyyn kasvimateriaaliin lisättiin tuoreita liuottimia (MeOH) ja prosessi toistettiin kolme kertaa. Suodatetut kasviyhdisteitä sisältävät liuokset kuivattiin pyöröhaihduttimella alennetussa paineessa 40 asteessa. Kaikkien uutteiden saanto pidettiin jääkaapissa 4 asteessa kokeellisia analyyseja varten.

Tyrosinaasin estomääritys

Tyrosinaasin estoaktiivisuus määritettiin aikaisemman menetelmän [30] mukaisesti mittaamalla tyrosinaasientsyymin vaikutuksesta tyrosiinisubstraatilla tuotetun DOPA-kromin pitoisuus. Lyhyesti sanottuna testinäyte liuotettiin 80-prosenttiseen MeOH:iin erilaisten pitoisuuksien (25, 50 ja 100 ug/ml) saamiseksi. 96-kuoppalevy asetettiin seuraavassa järjestyksessä: 120 µl fosfaattipuskuria (20 mM, pH 6,8), 20 µl näytettä ja 20 µl sienityrosinaasia (500 U/ml 20 mM fosfaatissa) puskuri). Kun oli inkuboitu 15 minuuttia 25 asteessa, reaktio käynnistettiin lisäämällä 20 µl 0,85 mM L-tyrosiiniliuosta ja inkuboitiin sitten 10 minuuttia 25 asteessa. Tyrosinaasiaktiivisuus määritettiin mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 470 nm käyttäen mikrolevylukijaa (Biotek Powerwave XS2 spektrofotometri). Arbutiinia käytettiin positiivisena kontrollina, kun taas 80 prosenttia MeOH:ta käytettiin negatiivisena kontrollina. Tyrosinaasin eston prosenttiosuus laskettiin seuraavasti:

jossa C on negatiivisen kontrollin absorbanssi, B on nollanäytteen absorbanssi ja S on testinäytteen absorbanssi.

Bioaktiivisten yhdisteiden eristäminen Curcuma amadan raakauutteesta

Kun otetaan huomioon neljän kurkumauutteen tulokset, C. amada osoitti merkittävästi korkeampaa antityrosinaasiaktiivisuutta kuin muut. Siksi suoritettiin aktiivisten yhdisteiden biotestiohjattu puhdistus C. amadan raakauutteesta. Antityrosinaasiyhdisteiden tunnistamiseksi fraktiointi C. amadan raakauutteesta suoritettiin kuvassa 5 kuvatulla tavalla. Raakauute laimennettiin tislatulla vedellä ja uutettiin sitten n-heksaanilla ja sen jälkeen EtOAc:lla. Samat tilavuudet kutakin liuotinta ja raakauuteliuosta sekoitettiin sitten ravistamalla 3 minuuttia erotussuppilossa. Kaikki fraktiot väkevöitiin kuiviin pyöröhaihduttimella 40 asteessa. Näiden kolmen fraktion antityrosinaasiaktiivisuudet määritettiin edellä olevan menettelyn mukaisesti. Koska EtOAc-fraktiolla oli suurin antityrosinaasiaktiivisuus, se valittiin bioaktiivisen yhdisteen eristämiseen ja puhdistamiseen. Aktiivinen EtOAc-fraktio haihdutettiin kuiviin ja kromatografoitiin silikageelikolonnissa (75 g) (30 x 3 cm). Eluointi suoritettiin käyttämällä n-heksaania ja EtOAc:tä kasvavilla määrillä EtOAc:tä [100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) ja 0:100 (F6)]. Näiden kuuden fraktion antityrosinaasiaktiivisuus suoritettiin yllä olevan menettelyn mukaisesti, ja useimmat aktiivisuudet löydettiin F3:sta ja F6:sta. Fraktiot F3 ja F6 puhdistettiin C18-käänteisfaasi-HPLC:llä (COSMOSIL 5C18-AR-II; Nacalai Tesque, Inc., Kioto, Japani), joka oli varustettu vedellä ja asetonitriilillä liikkuvana faasina virtausnopeudella 2,5 ml min-1, havaittiin 280 nm:ssä.

Kolme piikkiä F3:sta eluoitui kohdissa 9,55, 13,66 ja 16,47 minuuttia ja neljä piikkiä F6:sta eluoitui kohdissa 11,56, 12,20, 12,75 ja 15.03 min värittöminä valkoisina aineina, joista inhiboivia aktiivisuus havaittiin viidessä huippufraktiossa, jotka eluoituivat kohdissa 9,55 ja 16,47 minuuttia F3:sta ja 11,56, 12,75 ja 15.03 minuuttia (lisätiedot) F6:sta (kuva 5). Eristetyt yhdisteet (~1{79}} mg) liuotettiin MeOH-d4:ään ja alistettiin sitten spektrianalyysiin. Ydinmagneettiresonanssi (NMR) -spektrit tallennettiin BRUKER NMR -spektrometreillä (500 MHz 1 H:lle ja 125 MHz 13 °C:lle) huoneenlämpötilassa. Kemialliset siirtymät (8) kirjattiin miljoonasosina (ppm) suhteessa tetrametyylisilaaniin (TMS) sisäisenä standardina. Massaspektrometriakokeet suoritettiin Waters Mass Spectrometer -laitteella käyttäen sähkösumutusionisaatio- (ESI − MS) -anturia seuraavissa instrumentaalisissa olosuhteissa: Kolonni: COSMOSIL 5C18-AR-II, (2 × 150) mm. Liuotin A: Vesi (0,1 prosenttia muurahaishappoa), liuotin B: asetonitriili, virtausnopeus: 4 ml/min, injektiotilavuus: 100 µl, ajoaika: 35 min, aikaohjelma F3:lle: 75 prosenttia B (0 min) → 75 prosenttia B (20 min) → 100 prosenttia B (20,1 min) → 100 prosenttia B (27 min) → 75 prosenttia B (27,1 min) → 75 prosenttia B (35 min). Aikaohjelma F6:lle: 45 prosenttia B (0 min) → 45 prosenttia B (14 min) → 100 prosenttia B (14,1 min) → 100 prosenttia B (20 min) → 45 prosenttia B (20,1 min) → 45 prosenttia B (25 min) min). Pumpputila: Binäärigradientti. Uunin tiedot: CTO-20AC, lämpötila 40 astetta. MS-ionisaatiotila: ES ( plus ), kapillaarijännite: 4,0 kV, kartiojännite: 20 V, lähdelämpötila: 120 astetta, desolvataatiolämpötila: 350 astetta, kartiokaasuvirtaus: 100 l/h, desolvataatiokaasuvirtaus: 800 L /h (lisätiedot).

Eristettyjen yhdisteiden antityrosinaasiaktiivisuus

Eristetyt yhdisteet liuotettiin MeOH:iin pitoisuuksina 5, 10, 30, 50, 100 ja 200 µM kullekin yhdisteelle. Antityrosinaasiaktiivisuus määritettiin käyttämällä edellä kuvattua menettelyä.

Eristetyillä yhdisteillä tyrosinaasin ja melanogeneesin solunsisäinen esto

Soluviljely

B16F10-melanoomasoluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10 prosentilla lämpöinaktivoidulla naudan sikiön seerumilla (FBS) ja 1 prosentilla penisilliiniä (10, 000 U/ml)/streptomysiiniä (100 ug/ml) 37 asteessa kostutetussa ilmakehässä, joka sisältää 5 prosenttia CO2:ta.

Solujen elinkelpoisuus

B16F10-solut maljattiin 96-kuoppalevylle tiheydellä 5 × 104 solua/kuoppa. 24 tunnin kuluttua solut altistettiin eristetyn yhdisteen eri pitoisuuksille ja inkuboitiin vielä 48 tuntia 37 °C:ssa. Inkuboinnin jälkeen solujen elinkelpoisuus määritettiin MTS-määrityksellä. Kaksikymmentä mikrolitraa MTS-liuosta lisättiin ja inkuboitiin 60 minuuttia. Inkuboinnin jälkeen solujen absorbanssi määritettiin 490 nm:ssä käyttämällä mikrolevylukijaa (Benchmark Plus).

Eristettyjen yhdisteiden tyrosinaasi- ja anti-melanogeeniset vaikutukset

Solujen melaniinipitoisuuden ja tyrosinaasiaktiivisuusmääritykset suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [31] pienin muutoksin. B16F10-melanoomasolut maljattiin 96-kuoppalevylle tiheydellä 5 × 104 solua/kuoppa. 24 tunnin kuluttua solut altistettiin eristetyn yhdisteen tai arbutiinin eri pitoisuuksille. 1 tunnin kuluttua lisättiin 100 nM melanosyyttiä stimuloivaa hormonia (-MSH) ja soluja inkuboitiin vielä 48 tuntia 37 °C:ssa. Antityrosinaasiaktiivisuustutkimusta varten solut pestiin sitten jääkylmällä fosfaattipuskurilla ja hajotettiin fosfaattipuskurilla (pH 6,8), joka sisälsi 1 % Triton-X:ää (90 µl/kuoppa). Levyt pakastettiin -80 asteessa 30 minuuttia. Sulatuksen ja sekoittamisen jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 10 µl 1-prosenttista L-DOPA:ta. 37 asteessa 2 tunnin inkuboinnin jälkeen absorbanssi mitattiin aallonpituudella 490 nm. Melaniinipitoisuuden määritystä varten solut pestiin kahdesti fosfaattipuskurilla ja liuotettiin sitten 100 µl:aan NaOH:a (1 N), joka sisälsi 10 prosenttia DMSO:ta. Näytteitä inkuboitiin 80 asteessa 1 tunti ja sekoitettiin melaniinin liuottamiseksi. Sekoitettu homogenaatin optinen tiheys mitattiin 490 nm:ssä.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Tilastolliset erot näiden kahden keskiarvon välillä arvioitiin Studentin t-testillä. Useita vertailuja suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä, jota seurasi Bonferroni-testi. Erot katsottiin merkittäviksi, kun P <>

Tämä on väsymystä ehkäisevä tuotteemme! Klikkaa kuvaa saadaksesi lisätietoja!

Viitteet

1. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem GH. Hypopigmentoidut aineet: päivitetty katsaus biologisista, kemiallisista ja kliinisistä näkökohdista. Pigment Cell Res. 2006;19:550–71.

2. Loizzo MR, Tundis R, Menichini F. Luonnolliset ja synteettiset tyrosinaasin estäjät ruskehtumisenestoaineina: Päivitys. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2012;11:378–98.

3. Lin YS, Chen HJ, Huang JP, Lee PC, Tsai CR, Hsu TF, et ai. Tyrosinaasia estävän aktiivisuuden kinetiikka käyttämällä Vitin vinifera-lehtiuutteita. Biomed Res Int. 2017: 5232680.

4. Manini P, Napolitano A, Westerhof W, Riley PA, d' Ischia M. Reaktiivinen orto-kinoni, joka syntyy tyrosinaasin katalysoiman ihon pigmentinpoistoaineen monobentsonin hapetuksesta: itsekytkentä- ja tiolikonjugaatioreaktiot ja mahdolliset vaikutukset melanosyytteihin myrkyllisyys. Chem Res Toxicol. 2009;13:1398–405.

5. Couteau C, Coiffard L. Yleiskatsaus ihon valkaisuaineisiin: lääkkeet ja kosmeettiset tuotteet. Kosmetiikka. 2016; 3:27.

6. Al-Saleh I, Shinwari N, El-Doush I, Billedo G, Al-Amodi M, Khogali F. Elohopeatasojen vertailu albiinojen ja pigmentoituneiden hiirten eri kudoksissa, joita on käsitelty kahdella eri merkillä ihoa vaalentavalla elohopeavoiteella. Biometallit: Int J rooli Met ionit Biol, Biochem, Med. 2004;17:167–75.

7. Gopinath H, Karthikeyan K. Kurkuma: mauste, kosmeettinen ja parannuskeino. Intialainen J Dermatol Venereol Leprol. 2018;84:16–21.

8. Vaughn AR, Branum A, Sivamani RK. Kurkuman (Curcuma longa) vaikutukset ihon terveyteen: järjestelmällinen katsaus kliinisistä todisteista. Phytother Res. 2016;30:1243–64.

9. Baliga MS, Katiyar SK. Valokarsinogeneesin kemopreventio valituilla ravintoaineilla. Photochem Photobio Sei. 2006;5:243–53.

10. Akter J, Hossain MA, Sano A, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Erilaisten kurkumalajien ja -kantojen (Curcuma spp.) antifungaalinen vaikutus Fusarium Solani Sensu Lato -bakteeria vastaan. Pharm Chem J. 2018;52:292–7.

11. Akter J, Islam MZ, Hossain MA, Kawabata S, Takara K, Nguyen H, et ai. Endoteelista riippumaton ja kalsiumkanavasta riippuvainen sian aivovaltimon rentoutuminen eri kurkumalajeilla ja -kannoilla. J Tradit Complement Med. 2018; 9:297–303.

12. Akter J, Takara K, Islam MZ, Hossain MA, Sano A, Hou DX. Curcuma amadan sienilääkkeiden eristäminen ja rakenteellinen selvitys. Asian Pac J Trop Med. 2019;12:123–9.

13. Akter J, Hossain MA, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Erilaisten kurkumalajien ja -lajikkeiden antioksidanttivaikutus (Curcuma spp): Aktiivisten yhdisteiden eristäminen. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharm. 2019; 215:9–17.

14. Khunlad P, Tundulawessa Y, Supasiri T, Chutrtong W. Kurkuminoidien tyrosinaasia estävä aktiivisuus kurkumajauheesta (Curcuma longa Linn.). J SWU Sei. 2008;24:125–39.

15. Giang PM, Son PT. Seskviterpenoidien eristäminen vietnamilaisen Curcuma aromaattisen salisbin juurakoista. J Chem. 2000;38:96–9.

16. Asem SD, Laitonjan SW. Curcuma caeca Roxb:n juurakosta peräisin olevan zederonin rakenteen ja epälineaarisuuden suhteen tutkiminen. Ind J Chem. 2012;51:1738–42.

17. Faiz Hossain C, Al-Amin M, Rahman KM, Sarker A, Alam MM, Chowdhury MH, et ai. Analgeettinen periaate Curcuma amadalta. J Etnopharmacol. 2015; 163:273–7.

18. Ahmed Hamdi OA, Syed Abdul Rahman SN, Awang K, Abdul Wahab N, Looi CY, Thomas NF, Abd Malek SN. Sytotoksiset aineosat Curcuma zedoarian juurakoista. Sci World J. 2014; 2014: 321943.

19. Makabe H, Maru N, Kuwabara A, Kamo T, Hirota M. Anti-inflammatoriset seskviterpeenit Curcuma zedoariasta. Nat Prod Res. 2006;20:680–5.

20. Kikuzaki H, Nakatani N. Sykliset diaryyliheptanoidit Zingiber officinalen juurakoista. Fytokemia. 1996;43:273–7.

21. Dekebo A, Dagne E, Sterner O. Furanosesquiterpenes from Commiphora sphaerocarpa ja siihen liittyvät todellisen mirhan hajotusaineet. Fitoterapia. 2002;73:48–55.

22. Joshi SC, Mathela CS. Lehtien eteerisen öljyn ja sen aineosien furanodienonin ja kurserenonin antioksidanttiset ja antibakteeriset vaikutukset Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. ex koukku. f. Pharmacogn Res. 2012; 4:80–4.

23. Yang FQ, Li SP, Zhao J, Lao SC, Wang YT. GC-MS-olosuhteiden optimointi, joka perustuu analyyttien erottelukykyyn ja stabiilisuuteen yhdeksän seskviterpenoidin samanaikaiseen määrittämiseen kolmessa kurkumajuuralajissa. J Pharm Biomed Anal. 2007;43:73–82.

24. Li YW, Zhu GY, Shen XL, Chu JH, Yu ZL, Fong WF. Furanodienoni estää solujen lisääntymistä ja eloonjäämistä estämällä ER-signalointia ihmisen rintasyövän MCF{1}}-soluissa. J Cell Biochem. 2011; 112:217–24.

25. Tao QF, Xu Y, Lam RY, Schneider B, Dou H, Leung PS, et ai. Diarylheptanoidit ja monoterpenoidi Zingiber officinalen juurakoista: antioksidanttisia ja soluja suojaavia ominaisuuksia. J Nat Prod. 2008;71:12–17.

26. Yokosuka A, Mimaki Y, Sakagami H, Sashida Y. Uudet diaryyliheptanoidit ja diaryyliheptanoidiglukosidit Tacca chantrierin juurakoista ja niiden sytotoksinen aktiivisuus. J Nat Prod. 2002;65:283–9.

27. Jiang JL, Jin XL, Zhang H, Su X, Qiao B, Yuan YJ. Antituumoriaineosien tunnistaminen Curcuma longa L. -lajin kurkuminoideissa koostumuksen ja aktiivisuuden suhteen perusteella. J Pharm Biomed Anal. 2012;70:664–70.

28. Marrot L, Meunier JR. Ihon DNA:n valovaurio ja sen biologiset seuraukset. J Am Acad Dermatol. 2008;58:139–48.

29. Policegoudra RS, Abiraj K, Channe Gowda D, Aradhya SM. Antioksidantin ja antibakteerisen yhdisteen eristäminen ja karakterisointi mango-inkivääri (Curcuma amada Roxb.) juurakosta. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2007;852:40–8.

30. Tadtong S, Viriyaroj A, Vorarat S, Nimkuntat S, Suksamrarn S. Mangosteenin perikarpiuutteen antityrosinaasi ja antibakteeriset vaikutukset. J Health Res. 2009;23:99–102.

31. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Bicalein estää melanogeneesiä aktivoimalla ERK-signalointireitin. Int J Mol Med. 2010;25:923–7.