Leontopodium Alpinum (Edelweiss) -kalluskulttuuriuutteen ikääntymistä estävät vaikutukset transkriptioprofiilin avulla

Klikkaaoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Abstrakti:Edelweiss (Leontopodium Alpinum) Asteraceae-heimoon kuuluva luonnonkukka, joka kasvaa kivisissä kalkkikivipaikoissa. Täällä tutkimme edelweissin kallusviljelyuutteen (Leontopodium Alpinum kallusviljelmäuute; LACCE) tehokkuutta käyttämällä useita määrityksiä in vitro in vivo sekä transkriptioprofilointia. Useat in vitro -määritystulokset osoittivat LACCE:n vahvan antioksidanttiaktiivisuuden vasteena UVB-käsittelylle. Lisäksi LACCE tukahdutti tulehdusta ja ryppyjä; LACCE lisäsi kuitenkin kosteuttavaa aktiivisuutta. Kliininen testi in vivo osoitti, että LACCE:n jatkuva käyttö kasvoille ja ihokudoksille paransi periorbitaalisia ryppyjä, ihon kimmoisuutta, ihon tiheyttä ja ihon paksuutta lumelääkkeeseen verrattuna. RNA-sekvensointitulokset osoittivat, että vähintään 16,56 prosenttia ihmisen geeneistä ilmentyi keratinosyyttisoluissa. LACCE-ylössäädellyt geenit, jotka koodaavat useita KRT-proteiineja; DDIT4, BNIP3 ja IGFBP3 osallistuivat kehitysprosessin positiiviseen säätelyyn, ohjelmoituun solukuolemaan, keratinisoitumiseen ja kornioitumiseen muodostaen ihoesteitä, mikä tarjoaa monia etuja ihmisen iholle. Sitä vastoin alas säädellyt geenit olivat stressiherkkiä geenejä, mukaan lukien metalli-, hapettumis-, haava-, hypoksia- ja virusinfektiot, mikä viittaa siihen, että LACCE ei aiheuttanut haitallista stressiä iholle. Kattava tutkimuksemme osoitti, että LACCE on lupaava aine ikääntymistä estävässä kosmetiikassa.

Avainsanat:ikääntymistä vastaan; kallus; Edelweiss;ihosoluja; transkriptio

1. Esittely

Edelweiss(Leontopodium noble sub sp. Alpinum(Cass.) Greuter) Asteraceae-heimoon kuuluva luonnonkukka, joka kasvaa kallioisissa kalkkikivipaikoissa korkeilla paikoilla, kuten Sveitsin Alpeilla [1,2]. Lyhytikäisten valkoisten kukkien harvinaisuuden vuoksi adelweissi edustaa Alpeille ja Karpaateille liittyvää kauneutta ja puhtautta. Lisäksi monet maat, kuten Itävalta, Bulgaria, Romania, Slovenia ja Sveitsi, pitävät edelweissiä kansallisena symbolina.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Edelweissiä on pitkään käytetty perinteisenä lääkkeenä vatsakipuja, keuhkoputkentulehdusta, ripulia, punatautia ja kuumetta vastaan ​​[3, A]. Viime aikoina useat tutkimukset ovat osoittaneet edelweiss-uutteiden tehokkuuden anti-inflammatorisissa hiirissä ja rotissa [3] sekä ihmisen keratinosyyteissä ja endoteelisoluissa [4]. Lisäksi edelweissin juuriuutteet sisältävät ainesosia, jotka tehostavat kolinergistä neurotransmissiota, mikä osoittaa sen potentiaalin antidementia-aineille [5] ja antioksidanteille, kuten esim.

leontopodihappo A ja 35-kofeoyylikiinihappo, joita voidaan käyttää ikääntymistä ehkäisevinä aineina [6]. Lisäksi Edelweiss-uutteet osoittivat antibakteerista vaikutusta Enterococcus faeciumia, Escherichia colia, Pseudomonas aeruginosaa, Staphylococcus aureusta, Streptococcus keuhkokuumetta ja Streptococcus pyogenesiä vastaan, mikä viittaa niiden mahdolliseen etnomääketieteelliseen käyttöön hengityselinten ja vatsan sairauksien hoidossa [7].

Useat aiemmat tutkimukset ovat analysoineet edelweissiuutteiden yhdisteitä. Esimerkiksi kapillaarikromatografiamenetelmä paljasti edelweissin ilmaosista 12 farmakologisesti tärkeää yhdistettä, mukaan lukien flavonoidit, kofeiinihapot ja leontopodihappo [8]. Antioksidanttien uuttamiseksi edelweiss-kasveista on kehitetty keskipakopartitiokromatografia (CPC) ja korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) [6]. Tiedetään, että edelweiss-uutteiden aktiiviset yhdisteet ilmaosien ja juurien välillä ovat erilaisia[3]. Esimerkiksi edelweissin karvajuuret tuottavat farmakologisesti aktiivisia lignaaneja, kuten login- ja 5-metoksilogiinia, joita voidaan stimuloida useilla muilla ainesosilla, kuten hopeanitraatilla, sakkaroosilla, metyylijasmonaatilla ja hiivauutteella [ 9].cistanche-uutteen edutLisäksi 11 erilaisen Leontopodium-lajin aineenvaihduntakuviot on paljastettu ydinmagneettisella resonanssilla (1H NMR) -spektroskopialla ja nestekromatografia-massaspektrometrialla (LC-MS) niiden taksonomiasuhteessa [10].

Cistanche voi ehkäistä ikääntymistä

Kasvien kallus voidaan määritellä järjestäytymättömiksi tai erilaistumattomiksi solumassoiksi, jotka indusoituvat helposti haavoittamalla kasvihaavan peittämiseksi tai suorittamalla keinotekoisesti in vitro -järjestelmää. Kasvikallus viljellään keinotekoisesti lisäämällä ravinteita ja kasvien kasvunsäätelyaineita antiseptisissä kasvuolosuhteissa. Tällä hetkellä bioreaktorissa on mahdollista tuottaa suuri määrä samanlaatuisia spesifisiä kasvisoluja. Lisäksi kasvisolulla on kyky, jota kutsutaan totipotenssiksi, joka on kasvisolun geneettinen potentiaali tuottaa koko kypsä kasvi [11]. Siten on mahdollista muodostaa kypsä kasvi tietystä kasvin kalluksesta. Lisäksi kallusta voidaan käyttää laajasti kasvien uudistamiseen harvinaisten ja uhanalaisten kasvien suojelemiseksi [12,13].

Kuten eläinsolut, kasvisoluilla on kyky helpottaa kasvien stimulaatiota ja uusiutumista vamman jälkeen [14]. Vaikka kasvien kantasoluja pidetään nousevina materiaaleina kosmetiikkateollisuudessa, saatavilla olevia materiaaleja on rajoitetusti. On tärkeää tunnistaa uusia kasvilähteitä ja arvioida niiden kosmetiikkaan liittyviä toiminnallisia komponentteja.

Edelweiss-uutteet ovat hyvin tunnettuja niiden käytöstä farmaseuttisissa aineissa; Edelweiss-uutteen vaikutuksia luonnonkosmeettisena lähteenä raportoidaan kuitenkin harvoin. Täällä tutkimme edelweiss-kallusuutteen (Leontopodium Alpinum kallusviljelmäuute; LACCE) tehokkuutta, joka oli peräisin Edelweissin lehdistä useilla määrityksillä in vitro - in vivo ja paljastimme LACCE:n aiheuttaman molekyylimekanismin käyttämällä transkriptioprofiilia.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Edelweiss Calluksen tuotanto

Edelweissin siemenet ostettiin kaupallisesti. Edelweissin siemeniä liotettiin 70-prosenttisessa etanolissa 30s, minkä jälkeen ne pestiin tislatulla vedellä. Jälleen siemeniä ravisteltiin 0,3-prosenttisessa natriumhypokloriitissa (Waco, Osaka, Japani) 20 minuuttia ja pestiin tislatulla vedellä. Steriloidut siemenet idätettiin perus Murashige- ja Skoog(MS)-elatusaineella (Duchefa Biochemie, Haarlem, Alankomaat). Edelweissin lehdet leikattiin aseptisessa tilassa pieniksi paloiksi (0,5-1 cm). Indusoimme kasvisolujen varhaisen vaiheen MS-elatusaineella, joka sisälsi 0.5-3 mg/ml 6-bentsyyliaminopuriinia (6-BAP) (Duchefa Biochemie) ja 0.3-1 mg/ml 2,4-dikloorifenoksietikkahappoa (2,4-D) (Duchefa Biochemie) pimeässä 25±2 asteessa [15]. MS-alustan pH säädettiin arvoon 5,8 käyttämällä 1 N NaOH:ta (Duchefa Biochemie). Indusoitu kallus lisääntyi petrimaljassa. Valittua kalluslinjaa viljeltiin bioreaktorissa Anti-Aging Research Institute of BIO-FD&C Co., Ltd.:ssä, Incheon, Korea. Viljelty kallus otettiin talteen ja pestiin kolme kertaa tislatulla vedellä.cistanche Tšingis-khaaniKallus kuivattiin pakastekuivaimella (IlShinbioBase, Dongducheonsi, Korea) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kuivattua edelweiss-kallusta sekoitettiin tislatussa vedessä 50 asteessa 8 tuntia. Kallusuutteet saatiin lämpöuutolla 98 asteessa 10 minuutin ajan.

2.2. Ihmisen ihosolujen viljely

Edelweiss-uutteiden arvioidut vaikutukset ihmisen ihosoluihin, keratinosyyttisoluihin (HaCaT) ja normaaleihin ihmisen Detroit 551 -fibroblasteihin (ATCC, Manassas, VA, USA) viljeltiin Dulbeccon modifioidussa kotkaelatusaineessa (DMEM) (Welgene, Gyeongsan-si, Korea). ) täydennettynä 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja 1 prosentilla antibiootti-antimykoottia (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 37 asteessa 5 prosentin CO2-olosuhteissa.

2.3. Solujen metabolisen aktiivisuuden arviointi MTT-määrityksellä

LACCE:n sytotoksisuuden arvioimiseksi ihmisen ihosolujen solujen kasvuun, lisääntymiseen ja eloonjäämiseen käytetään MTT({{0}}(45-dimetyylitiatsol-2-yyli){{3} },5-difenyylitetratsoliumbromidi) -määritys suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla[16,17]. Lyhyesti sanottuna HaCaT- ja Detroit 551 -soluja tiheydellä 5 × 10* solua per kuoppa, vastaavasti, inkuboitiin 96-kuoppalevyllä 24 tuntia. Sen jälkeen lopulliset pitoisuudet olivat 0,1 prosenttia. , 0,5 prosenttia ja 1 prosenttia LACCE:tä käsiteltiin 24 tuntia. Kontrollina käytettiin tislattua vettä. LACCE-käsittelyn jälkeen väliaine poistettiin, minkä jälkeen lisättiin 4 µLof 5 mg/ml MTT:tä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja inkuboitiin 4 tuntia. Väliaineen poistamisen jälkeen lisättiin 100 µl dimetyylisulfoksidia (DMSO) (Sigma) ja liuotettiin 10 minuutin ajan.vesisäiliön käyttöiän pidentäminenAallonpituuden absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm käyttämällä Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrophotometer -spektrofotometriä (Fisher Scientific Ltd., Vantaa, Suomi). Solujen elinkelpoisuus saatiin käyttämällä seuraavaa kaavaa. Solujen elinkelpoisuus (prosenttia)=(käsiteltyjen solujen absorbanssin määrä / kontrollisolujen absorbanssin määrä) × 100.

2.4. Antioksidanttiaktiivisuuden arviointi DPPH-määrityksellä

LACCE:n antioksidanttiaktiivisuus mitattiin DPH (2,2-difenyyli-1-pikryylihydratsiinihydraatti) -määrityksellä, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Lyhyesti sanottuna 0,1 ml lopulliset pitoisuudet 0,1 % , {{10}},5 % ja 1 % LACCE käsiteltiin 0,1 ml:ssa 0,1 mM DPPH:ta (Sigma-Aldrich) 0,4 ml etanolin läsnä ollessa. Käytimme 0,001-prosenttista askorbiinihappoa (C-vitamiini) (Sigma-Aldrich) positiivisena kontrollina. Näytteitä sekoitettiin hyvin 10 sekuntia ja inkuboitiin huoneenlämmössä pimeissä olosuhteissa 30 minuuttia. Aallonpituuden absorbanssi mitattiin aallonpituudella 517 nm käyttämällä Thermo Scientific Multiskan GO Microplate -spektrofotometriä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Radikaalien poistoaktiivisuus laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa. Huuhteluaktiivisuus (prosenttia )=[1-(testinäytteen absorbanssi/kontrollin absorbanssi)]×100.

2.5. Antioksidanttiaktiivisuuden arviointi vetyperoksidi(H2O2)-määrityksellä

Vetyperoksidi tuottaa soluissa happivapaita radikaaleja, mikä johtaa solukuolemaan. Testasimme vetyperoksidin aiheuttamaa solukuolleisuutta LACCE-käsitellyissä näytteissä. HaCaT-soluja tiheydellä 5 x 105 solua per kuoppa inkuboitiin 24-kuoppalevyllä 24 tuntia. Tämän jälkeen lopulliset pitoisuudet 0,1 prosenttia, 0,5 prosenttia ja 1 prosenttia LACCE:ta käsiteltiin 1 mM H, O:n läsnä ollessa 8 tunnin ajan. Positiivisena kontrollina käytettiin 0,033 % NAC:ta (Sigma-Aldrich). MTT-määritystä käytettiin HO2:n aiheuttaman LACCE-käsiteltyjen näytteiden solujen eloonjäämisasteen mittaamiseen. Lisäksi havaitsimme solujen morfologiaa metyleenisinivärjäyksellä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

2.6. Reaaliaikainen käänteinen transkriptio (RT)-PCR

LACCE:n ryppyjä ehkäisevän, kosteuttavan ja tulehdusta ehkäisevän vaikutuksen tutkimiseksi suoritimme reaaliaikaisen RT-PCR:n tunnetuilla alukkeilla, jotka monistavat markkerigeenejä käyttäen QuantiTect Primer Assaysia (Qiagen, Hilden, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Detroit 551 -soluja tiheydellä 5 × 104 solua per kuoppa inkuboitiin 96-kuoppalevyllä 24 tuntia. Sen jälkeen loppupitoisuuksia 0,1 prosenttia , 0,5 prosenttia ja 1 prosenttia LACCE:tä käsiteltiin 24 tunnin ajan. cDNA syntetisoitiin vastaavista Detroit 551 -soluista, joita oli käsitelty erilaisilla LACCE-konsentraatioilla käyttämällä SuperPrep Cell Lysis & RT -kittiä qPCR:lle (Toyobo, Osaka, Japani), joka sisälsi lyysireagensseja ja RT-reagensseja valmistajan ohjeiden mukaisesti. LACCE-hoidon ryppyjä ehkäisevän vaikutuksen vuoksi Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) -geenin ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR:llä käyttämällä Thunderbird SYBR qPCR Mix -pakkausta (Toyobo). valmistajan ohjeiden mukaan. LACCE-käsittelyn kautta tapahtuvan kosteutuksen arvioimiseksi Aquaporin 3:a (AOP3) koodaavan geenin ilmentymistä tutkittiin reaaliaikaisella RT-PCR:llä. Anti-inflammatorisen määrityksen tapauksessa HaCaT-soluja, joiden tiheys oli 5 × 104 solua kuoppaa kohti, inkuboitiin 96-kuoppalevyllä 24 tuntia. Väliaineen poistamisen jälkeen UVB säteilytettiin HaCaT-soluille. UVB-säteilytykseen CL-1000 UV-laatikko (Analytik Jena AG, Jena, Saksa) käytti 5 mJ/cm'. Sen jälkeen loppupitoisuuksia 0,1 %, 0,5 % ja 1 % LACCE käsiteltiin 4 tuntia. Käytimme deksametasonia (Dex) (Sigma-Aldrich) positiivisena kontrollina. LACCE-hoidon anti-inflammatorista vaikutusta varten COX2:ta ja iNOS:a koodaavien geenien ilmentyminen kvantifioitiin reaaliaikaisella RT-PCR:llä. Yksittäisten geenien ilmentyminen normalisoitiin GAPDH-geenin ilmentymiseen. 2.7. LACCE:n kliininen arviointi kosmetiikan agenttina Vioossa

Ellead-yhtiö suoritti kliinisen tutkimuksen LACCE:n tehokkuuden arvioimiseksi kasvojen kohottamiseksi ja silmänympärysryppyjen, ihon kimmoisuuden, ihon tiheyden ja ihon paksuuden parantamiseksi standardikäyttömenettelyihin perustuvan hyväksynnän jälkeen (versio 3.{1} }) (Ellead, Seongnam, Korea) Ellead IRB:n elintarvike- ja lääketurvallisuusministeriön (MFDS) kuvaamien Korean hyvien kliinisten käytäntöjen ohjeen (B1-2015-4-002) ja Elleadin vakiotoimintamenettelyjen (EL-P{) mukaisesti. {4}}).

LACCE:n vaikutuksen tutkimiseksi in vivo suoritimme LACCE:n kliinisen arvioinnin neljälle eri tekijälle: kasvojen kohottaminen ja silmänympärysryppyjen parantaminen, ihon kimmoisuus, ihon tiheys ja ihon paksuus. Tätä varten kliiniseen arviointiin osallistui neljän viikon aikana yhteensä 21 naisvapaaehtoista, joiden ikä oli keskimäärin 48,04 ± 4,28 vuotta ja jotka jaettiin edelleen 12:een 40-vuotiaan ja yhdeksään 50-vuotiaaseen.

Kliininen testi suoritettiin kolmella eri ajankohdalla, lähtötasolla, 2 viikkoa ja 4 viikkoa, kaikille vapaaehtoisille. Viikon ennen tutkimuksen alkua sen loppuun asti kaikille vapaaehtoisille ei tehty lisähoitoja ihon, kosmeettisten ja hygieniatukien parantamiseksi, mikä olisi voinut vaikuttaa tuloksiin. Pestyään vapaaehtoisten kasvot puhdistusvaahdolla vapaaehtoiset seisoivat vähintään 30 minuuttia valvotussa huoneessa, jossa lämpötila (20-24 astetta) ja kosteus (40 prosenttia -60 prosenttia suhteellisesta kosteudesta) oli vakio. . Teimme mittauksen satunnaisesti vapaaehtoisten kasvojen vasemmalla tai oikealla puolella. Testimme oli kaksoissokkotesti, jossa koehenkilöt tai tutkijat eivät tienneet, mikä tuote oli testinäyte. Taulukossa 1 kuvattiin formulaatiot alentuneiden ja kasvaneiden nopeuksien laskemiseksi.

2.8. Kasvojen kohoamisen ja periorbitaalisten ryppyjen parantamisen mittaaminen

Kaikilta vapaaehtoisilta mitattiin lähtötasolla periorbitaaliset rypyt, ihon joustavuus, ihon tiheys, ihon paksuus poskessa ja kasvojen kohotus suun kulmassa. Sen jälkeen kaksi erilaista näytettä, LACCE ja lumelääke (kontrolli), levitettiin nimetylle kasvojen alueelle kahdesti päivässä (aamulla ja illalla). Vapaaehtoiset jaettiin kahteen eri ryhmään, ryhmään I (LACCE:tä levitettiin vasemmalle kasvojen alueelle, kun taas lumelääkettä oikealle kasvojen alueelle) ja ryhmään II (plaseboa vasemmalle kasvojen alueelle, kun taas LACCE:ta levitettiin kasvojen alueelle. oikea kasvojen alue). Kaksi ja neljä viikkoa hoidon jälkeen suoritettiin samat mittaukset LACCE:n vaikutuksen arvioimiseksi lumelääkkeeseen verrattuna.

Periorbitaaliset rypyt analysoitiin optisella 3D-ihonmittausjärjestelmällä (Dimension) PRIMOS High Resolution (Canfield Scientific, Parsippany, NJ, USA), joka on ihanteellinen ihon mikrorakenteen ja ryppyjen tutkimukseen. Kaksi erilaista karheusparametria, Ra (keskimääräinen karheus), joka on karkeusprofiilin profiilin korkeuksien absoluuttisten arvojen keskiarvo, ja Rg (neliön keskimääräinen karheus), joka on profiilin profiilin korkeuksien neliökeskiarvo. karheusprofiili mitattiin.

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Genes 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes