Kassiafistulan kukkabutaaniuutteen ikääntymistä estävät ja tyrosinaasia estävät vaikutukset, osa 1

Abstrakti

Tausta: Kasviperäisiä luonnontuotteita on käytetty monissa kosmeettisissa sovelluksissa ravinnon lähteenä ja valkaisuaineena. Fabaceae-heimoon kuuluvan Cassia fistula L:n kukkia on käytetty perinteisenä lääkkeenä ihosairauksiin ja haavojen paranemiseen, ja niillä on raportoitu olevan antioksidanttisia ominaisuuksia. C. fistula -kukkauutteen ikääntymistä estävää vaikutusta ihmisen ihon fibroblasteihin tutkittiin.

Cistanchen glykosidi voi myös lisätä SOD:n aktiivisuutta sydämen ja maksan kudoksissa ja vähentää merkittävästi lipofussiinin ja MDA:n pitoisuutta kussakin kudoksessa, poistaen tehokkaasti erilaisia ​​reaktiivisia happiradikaaleja (OH-, H₂O₂ jne.) ja suojaamalla DNA-vaurioilta. OH-radikaalien toimesta. Cistanche-fenyylietanoidiglykosideilla on vahva vapaita radikaaleja poistava kyky, suurempi pelkistyskyky kuin C-vitamiini, ne parantavat SOD:n aktiivisuutta siittiösuspensiossa, vähentävät MDA-pitoisuutta ja niillä on tietty suojaava vaikutus siittiöiden kalvon toimintaan. Cistanche-polysakkaridit voivat lisätä SOD:n ja GSH-Px:n aktiivisuutta D-galaktoosin aiheuttamien kokeellisesti vanhenevien hiirten punasoluissa ja keuhkokudoksissa sekä vähentää MDA- ja kollageenipitoisuutta keuhkoissa ja plasmassa sekä lisätä elastiinipitoisuutta. hyvä huuhteluvaikutus DPPH:lle, pidentää hypoksian aikaa vanhenevilla hiirillä, parantaa SOD:n aktiivisuutta seerumissa ja viivyttää keuhkojen fysiologista rappeutumista kokeellisesti vanhenevilla hiirillä Solumorfologisen rappeutumisen yhteydessä kokeet ovat osoittaneet, että Cistanchella on hyvä antioksidanttikyky ja sillä on potentiaalia olla lääke ihon ikääntymisen sairauksien ehkäisyyn ja hoitoon. Samaan aikaan Cistanchen ekinakosidilla on merkittävä kyky poistaa DPPH-vapaita radikaaleja ja se voi poistaa reaktiivisia happilajeja, estää vapaiden radikaalien aiheuttaman kollageenin hajoamisen ja sillä on myös hyvä korjaava vaikutus tymiinin vapaiden radikaalien anionivaurioihin.

Napsauta Desert Cistanche -etuja

【Lisätietoja:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

menetelmät: C. fistula -kukkien butanoliuutto saatiin päätökseen ja aktiiviset yhdisteet luokiteltiin. Fibroblastien sytotoksisuus arvioitiin SRB-määrityksellä myrkyttömän annoksen valitsemiseksi lisäkokeita varten. Kollageeni- ja hyaluronihapon (HA) synteesi mitattiin sitten käyttämällä kollageenipakkausta ja vastaavasti ELISA:a. Lisäksi arvioitiin entsyymiaktiivisuus, mukaan lukien kollagenaasi, matriksmelloproteinaasi-2 (MMP-2) ja tyrosinaasi.

Tulokset: Havaittiin, että kukkauute ei vaikuttanut ihon fibroblastisolujen kasvuun (IC50 > 200 ug/ml). Tulokset osoittivat, että kukkauute lisäsi merkittävästi kollageeni- ja HA-synteesiä annoksesta riippuvalla tavalla. Kukkauute (50–200 ug/ml) esti myös merkittävästi kollagenaasi- ja MMP{5}}-aktiivisuutta. Lisäksi tämä kukkauute voi estää tyrosinaasiaktiivisuutta, joka aiheuttaa hyperpigmentaatiota, mikä indusoi ihon ikääntymistä.

Johtopäätökset: C. fistula -kukkauutteella oli ehkäisevä vaikutus, kun sitä käytettiin ikääntymistä ehkäiseviin tarkoituksiin ihmisen ihon fibroblasteissa, ja se voi olla sopiva valinta kosmeettisille tuotteille, joiden tarkoituksena on saada aikaan valkaisuvaikutuksia ja jotka on nimetty ikääntymistä ehkäiseviksi kasvojen ihonhoitotuotteiksi. .

Avainsanat: kollagenaasi, kollageenisynteesi, glykosaminoglykaani, hyaluronihappo, matriisi metalloproteinaasi

Tausta

Ihon ikääntyminen on monimutkainen biokemiallinen eteneminen, joka johtuu monista yksilöllisistä sisäisistä ja ulkoisista tekijöistä, kuten iästä, hormoneista ja UV-valolle altistumisesta [1]. Eteneminen tapahtuu orvaskeden ja ihon kerroksissa ja liittyy pääasiassa ekstrasellulaarisen matriisin (ECM) hajoamiseen [2]. ECM:n hajoamiseen osallistuvat entsyymit ovat matriksin metalloproteinaasit (MMP:t), kuten gelatinaasit (MMP-2) ja kollagenaasi [3]. Iho menettää vetolujuutensa MMP:iden aiheuttaman ECM:n hajoamisen vuoksi. Tässä prosessissa esiintyy ihon ryppyjä ja myös karheutta ja kuivuutta esiintyy selvästi tiettyjen pigmenttipoikkeavuuksien, kuten hypo- tai hyperpigmentaation, kanssa [2, 4]. Hyperpigmentaation hoitoon on tutkittu tyrosinaasin estäjiä. Tyrosinaasi on nopeutta rajoittava entsyymi, joka muuttaa tyrosiinin melaniiniksi [5]. Tyrosiini-inhibiittoreilla on siis tärkeä rooli ihoa vaalentavina aineina [6], kun taas hyaluronihapon (HA) synteesi säätelee ihon kosteutta ja ryppyjen esiintymistä. HA, sulfatoitumaton glykosaminoglykaani (GAG), koostuu toistuvista disakkaridien yksiköistä, mukaan lukien D-glukuronihappo ja N-asetyyli-Dglukosamiini [7]. HA säätelee myös kudosten korjausta, mukaan lukien immuunijärjestelmän vasteen tehostaminen aktivoimalla tulehdussoluja ja vasteena fibroblastien vaurioille [8–10].

Kasviperäisiä luonnontuotteita, kuten Glycyrrhiza glabra [11] tai vihreää teetä [12], on käytetty kosmeettisissa sovelluksissa ravinnon lähteenä ja valkaisuaineena. Merkittävä määrä näyttöä on osoittanut kasviuutteista saatujen suun kautta tai paikallisesti annosteltavien fytokemikaalien suotuisat vaikutukset erityisesti ihon tilan parantamisessa. Joitakin esimerkkejä hyödyllisistä vaikutuksista ovat, että ihon ikääntymistä ja ihotulehdusta voidaan vähentää. C. fistula (kultainen suihku), Fabaceae-perhe, tavataan useissa Aasian maissa, kuten Thaimaasta, Kiinassa, Myanmarissa ja Intiassa. Aiemmissa tutkimuksissa C. fistula -kukkauutteella todettiin olevan antioksidanttisia, syöpää estäviä, antibakteerisia, sieniä torjuvia ja diabetesta ehkäiseviä ominaisuuksia [13, 14]. C. fistulan vaikutuksen Ayurvedic-lääketieteessä tiedetään olevan osallisena erilaisten sairauksien, mukaan lukien ihosairauksien, spitaalin, verenvuodon, kutinan ja diabeteksen hoidossa [15, 16]. C. fistulan eri osilla on ollut farmakologisia ominaisuuksia [17]. Kukkia, siemeniä, hedelmiä ja hedelmälihaa on käytetty ihosairauksien, mukaan lukien spitaalin, hoitoon [18]. Massa on tunnustettu antidiabeettisista ominaisuuksistaan ​​[15], ja sitä on käytetty tonicissa, jota on käytetty kihdin ja reuman hoidossa [19]. Lehtiä ja kypsiä paloja on perinteisesti käytetty laksatiivina [20, 21]. C. fistulan fenolien ja flavonoidisten fytokemikaalien on myös raportoitu olevan hyödyllisiä ihosairauksien hoidossa [14]. Siksi olemme tässä tutkimuksessa kiinnostuneita C. fistula -kukkauutteen rooleista kosmeettisissa sovelluksissa. ECM:n hajoamisen ehkäiseviä vaikutuksia sekä ihon ikääntymisen entsyymejä, jotka sisältävät kollagenaasi- ja MMP{13}}-aktiivisuutta, sekä tyrosinaasia on tutkittu. Lisäksi kollageenin ja HA:n synteesi on määritetty.

menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), DQ-gelatiini ja penisilliini-streptomysiini toimitettiin Gibcolta (Grand Island, NY, USA). Naudansikiön seerumi (FBS) toimitettiin Thermo Scientificilta (USA). Sirius Red/Fast Green Collagen Staining Kit ostettiin Chondrex, Inc:ltä (Redmond, WA, USA). Sulforodamiini B -reagenssi, hyaluronihappo ja sienityrosinaasi saatiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA).

Kasvimateriaalit

C. fistula -kukat saatiin Lampang Herb Conservationista, Lampangin maakunnasta, Thaimaasta. Kupongin näytteen numero (023197) on sertifioinut Wannaree Charoensup, kasvitieteilijä Thaimaan kasviston herbaariossa, farmasian tiedekunnan Chiang Main yliopistossa, Thaimaassa.

Cassia fistula -kukkauutteen valmistus

C. fistulan kukat kuivattiin ilmavassa huoneessa ja sitten 500 g kuivattuja kukkia jauhettiin hienoksi jauheeksi. Sen jälkeen jauhe liotettiin 50-prosenttisessa etanolissa ja ravisteltiin sitten 70 rpm:llä 24 tuntia. 24 tunnin kuluttua näytteet suodatettiin sitten suodatinpaperin läpi jäännöksen erottamiseksi. Jäännös liotettiin 50-prosenttisessa etanolissa ja ravisteltiin nopeudella 70 rpm 24 tuntia ja tämä vaihe toistettiin 2 kertaa. Suodatetut näytteet yhdistettiin ja haihdutettiin pyörivällä tyhjiöhaihduttimella (BUCHI, Sveitsi) vesifraktioiden saamiseksi. Vesifraktioon lisättiin heksaania suhteessa 2:1. Näytteitä ravisteltiin ja annettiin erottua 30 minuutin ajan. Näytteet erotettiin kahteen fraktioon, jotka olivat heksaani- ja vesifraktioita. Sitten vesifraktio otettiin talteen ja lisättiin 10 % hiiltä 30 minuutin ajaksi sekoittaen kevyesti huoneenlämpötilassa. Näytteet suodatettiin suodatinpaperin ja seliitin läpi hiilen erottamiseksi. Näytteet sekoitettiin kyllästetyn butanolin kanssa suhteessa kyllästettyä butanolia 2:1 ja näytteiden annettiin erottua 12 tunnin aikana ja tämä vaihe toistettiin 3 kertaa. Näytteet erotettiin kahteen fraktioon, jotka sisälsivät vesi- ja butanolifraktioita. Vettä lisättiin edelleen butanolifraktioihin yhtä suureen tilavuuteen asti ja näiden fraktioiden annettiin haihtua käyttämällä pyörövakuumihaihdutinta. Haihdutetut näytteet pakastekuivattiin C. fistula -kukkauutejauheen saamiseksi.

C. fistula -kukkauutteen fenolin kokonaispitoisuuden kvantifiointi UV-näkyvällä spektrofotometrillä

Kokonaisfenolipitoisuus C. fistula -kukkauutteessa määritettiin käyttämällä Folin-Ciocalteu-määritystä. Lyhyesti sanottuna 0,4 ml C. fistula -kukkauutetta sekoitettiin 0,3 ml:aan 10-prosenttista Folin-Ciocalteau-reagenssia ja inkuboitiin pimeässä huoneenlämmössä 3 minuuttia . Sitten lisättiin 0,3 ml natriumkarbonaattiliuosta ja liuosta inkuboitiin edelleen pimeässä huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Absorbanssi arvioitiin 765 nm:ssä käyttämällä UV-näkyvää spektrofotometriä. Kokonaisfenolipitoisuuden pitoisuus laskettiin ja sitä verrattiin gallushapon (GA) standardikäyrään pitoisuudessa 0–20 ug/ml. Fenolin kokonaispitoisuus ilmoitettiin milligrammoina GA-ekvivalentteja grammaa kohden C. fistula. kukkauute (mg GAE/g uutetta).

Fenoliyhdisteiden kvantifiointi C. fistula -kukkauutteessa käyttäen HPLC-analyysiä

Erityyppiset fenoliyhdisteet C. fistula -kukkauutteissa analysoitiin käyttäen HPLC-analyysiä ja niitä verrattiin sitten tavalliseen gallushappoon, katekiineihin, protokatekuiinihappoon, vanilliinihappoon, klorogeenihappoon, ferulihappoon ja kumarihappoon. Kukkauutteet liuotettiin 5 0-prosenttiseen etanoliin ja arvioitiin edelleen HPLC:llä (Agilent Technologies, CA, USA) käyttämällä käänteisfaasi-C18-kolonnia (WATER, MA, USA). Liikkuva faasi koostui metanolista (A) ja 0,1 % trifluorietikkahaposta (TFA) vedessä (B) gradienttiolosuhteissa. Virtausnopeus asetettiin arvoon 1,0 ml/min ja detektioaallonpituus rekisteröitiin 280 °C:ssa UV-detektorilla. Fenoliyhdisteiden pitoisuustasot laskettiin ja niitä verrattiin standardikäyrään ottaen huomioon standardipitoisuudet ja piikkien pinta-alat (mg/g uutetta).

C. fistula -kukkauutteen kokonaisflavonoidipitoisuuden kvantifiointi kolorimetrisellä määrityksellä

Flavonoidin kokonaispitoisuus määritettiin modifioidulla alumiinikloridi (AlCl3) kolorimetrisellä määrityksellä, kuten aiemmin kuvattiin [22]. Lyhyesti sanottuna 0,25 ml kukkauutetta sekoitettiin 0,125 ml:aan 5-prosenttista natriumnitriittiä (NaNO2) ja liuosta inkuboitiin 5 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sitten seokseen sekoitettiin 0,125 ml 10-prosenttista AlCl3:a ja pidettiin pimeässä 5 minuuttia. Sen jälkeen lisättiin 1 ml natriumhydroksidia (NaOH) ja liuosta inkuboitiin 15 minuuttia huoneenlämpötilassa pimeässä. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 510 nm käyttämällä UV-näkyvää spektrofotometriä. Flavonoidin kokonaispitoisuus laskettiin ja sitä verrattiin katekiinin standardiarvoihin ja ilmaistiin mg katekiiniekvivalenttia grammaa kohti uutetta (mg CE/g uutetta).

Soluviljelmät

Primääriset ihmisen ihon fibroblastit eristettiin aseptisesti vatsan arpeesta kirurgisen toimenpiteen jälkeen, johon sisältyi keisarileikkaus Chiang Main yliopiston (Chiang Mai, Thaimaa) CM Maharaj -sairaalan kirurgisella osastolla (tutkimuskoodi: BIO-2558-03549, Medicalin hyväksymä Chiang Main yliopiston tutkimuksen eettinen komitea). Rasva poistettiin lähtöaineesta ja se liotettiin DMEM:ssä, joka sisälsi anti-penisilliiniä ja streptomysiiniä. Sen jälkeen iho upotettiin DMEM:ään, joka sisälsi 1 % proteaasia (Dispase, Gibco, Grand Island, NY, USA) 48 tunniksi 4 °C:ssa. Epidermaaliset kerrokset poistettiin ja normaalit fibroblastit eristettiin verinahasta. Fibroblasteja viljeltiin DMEM:ssä, johon oli lisätty 10 % FBS:ää, 2 mM L-glutamiinia, 50 U/ml penisilliiniä ja 50 ug/ml streptomysiiniä. Soluja pidettiin 5 % C02:a kostutetussa inkubaattorissa 37 asteessa.

Solujen elinkelpoisuusmääritys

C. fistula -kukkauutteen solujen elinkelpoisuusmääritys ihon fibroblastisoluja vastaan ​​mitattiin käyttämällä sulforodamiini B (SRB) -määritystä, kuten aiemmin kuvattiin [23]. Lyhyesti sanottuna solut (8 x 103 solua/kuoppa) kylvettiin 96-kuoppalevylle ja inkuboitiin 37 asteessa, 5 % CO2:ssa 24 tuntia. Sen jälkeen soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (0–200 ug/ml) C. fistula -kukkauutteella tai ilman sitä 48 tunnin ajan. 48 tunnin kuluttua soluihin lisättiin 10 % (w/v) trikloorietikkahappoa (TCA) ja soluja inkuboitiin sitten 4 asteessa 1 tunti. Elatusaine poistettiin ja solut huuhdeltiin hitaasti juoksevalla vesijohtovedellä. 0,057 % (w/v) SRB-liuosta (100 µl) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja soluja inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. SRB-liuos poistettiin ja sitten solut pestiin 4 kertaa 1 % (v/v) etikkahapolla ja niiden annettiin kuivua huoneenlämpötilassa. Väriaine liuotettiin 10 mM Tris-emäsliuokseen (pH 10,5) ja absorbanssi mitattiin 510 nm:ssä käyttäen mikrolevylukijaa.

Kollageenisynteesimääritys

Solunsisäisen kollageenin kokonaismäärä fibroblastisoluissa määritettiin käyttämällä Sirius Red/Fast Green Collagen Staining Kit -sarjaa (Chondrex, Inc, Redmond, WA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna ihon fibroblastisoluja siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille 24 tunnin ajan 37 asteessa, 5 % C02:ssa. Sen jälkeen soluja esikäsiteltiin seerumittomalla DMEM-elatusaineella 24 tunnin ajan. Elatusaine poistettiin ja soluja inkuboitiin sitten C. fistula -kukkauutteen (0-150 ug/ml) kanssa tai ilman sitä 48 tuntia. 48 tunnin kuluttua viljelyalusta poistettiin. Sitten solut pestiin PBS:llä ja kiinnitettiin Kahle-kiinnitysaineella 10 minuutin ajan. Kiinnitysaine poistettiin ja solut pestiin PBS:llä. Sirius Red/Fast Green -väriliuos lisättiin jokaiseen kuoppaan ja näytteitä inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Väriaine poistettiin ja solut pestiin neljä kertaa DI-vedellä tai kunnes neste oli väritöntä. Lopuksi lisättiin uuttopuskuri ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 540 nm ja 605 nm käyttämällä UV-näkyvää spektrofotometriä.

Kollagenaasiaktiivisuusmääritys

Kollagenaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä modifioitua fluorogeenistä DQ™-gelatiinimääritystä, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, erilaisia ​​pitoisuuksia C. fistula -kukkauutetta (0-200 ug/ml) lisättiin 96-kuoppaisille levyille. Yksi U/ml kollagenaasia lisättiin kuhunkin kuoppaan (100 µl/kuoppa). Sen jälkeen lisättiin 15 ug/ml gelatiinia (DQ-gelatiinia) ja seoksia inkuboitiin 10 minuuttia. Proteolyysin nopeus määritettiin mittaamalla absorbanssi 2 minuutin välein 20 minuutin ajan käyttämällä mikrolevylukijaa viritysaallonpituudella 485 nm ja emissioaallonpituudella 528 nm. Entsyymiaktiivisuus arvioitiin tarkastelemalla lineaarisen regression kaltevuutta ajan ja absorbanssin välillä 2-6 min jakson aikana.

MMP{0}} aktiivisuusmääritys

MMP{{0}}-aktiivisuus määritettiin gelatiinitsymografialla, kuten aiemmin kuvattiin [25]. Fibroblastisoluja viljeltiin seerumivapaassa DMEM-elatusaineessa 24 tuntia. Tämän jälkeen viljelmän supernatantti kerättiin. Viljelmän supernatantti altistettiin 10-prosenttisille polyakryyliamidigeeleille, jotka sisälsivät 0,1 % w/v gelatiinia ei-pelkistävissä olosuhteissa. Geelit pestiin kahdesti 2,5 tilavuus-prosenttisella Triton X-100:lla 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa SDS:n poistamiseksi. Geelilevy leikattiin viipaleiksi, jotka vastasivat kaistoja, ja sitten viipaleet laitettiin eri tankkeihin ja inkuboitiin aktivointipuskurin (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4) kanssa, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia C:tä. fistulakukkauute (0–200 ug/ml) 37 asteessa 18 tuntia. Sen jälkeen geeliliuska pestiin ja värjättiin Coomassie Brillant Blue R:llä (0,1 % w/v) ja sitten poistettiin värjäys 30 % metanolissa ja 10 % etikkahapossa. MMP-2-aktiivisuus näkyi selkeänä nauhana sinistä taustaa vasten. Ruoansulatusvyöhykkeet kvantitoitiin Image J -ohjelmalla.

Hyaluronihapon (HA) synteesimääritys ELISA:lla

C. fistula -kukkauutteen vaikutus HA-synteesiin määritettiin käyttämällä ELISA-sarjaa, kuten aiemmin on kuvattu [26]. Fibroblastisolut (50 × 104 solua/kuoppa) kylvettiin 24-kuoppalevyille 24 tunnin ajan 37 asteessa, 5 % CO2:ssa. Soluja esikäsiteltiin seerumittomassa elatusaineessa 6 tuntia ja sitten niitä käsiteltiin eri konsentraatioilla C. fistula -kukkauutteella (0-200 ug/ml) tai ilman sitä 48 tuntia. Viljelyelatusaine kerättiin ja HA-synteesi mitattiin ELISA:lla. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 450 ja 570 nm käyttäen mikrolevylukijaa. Käsitellyistä fibroblastisoluista saadun viljellyn supernatantin HA-pitoisuus laskettiin ja sitä verrattiin HA:n standardikäyrään.

Tyrosinaasin estomääritys

Tyrosinaasin estomääritys määritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [27]. Erilaisia ​​pitoisuuksia C. fistula -kukkauutetta lisättiin 96-kuoppalevylle. Reaktio suoritettiin natriumpuskurissa (pH 6,4), joka sisälsi 100 U/ml sienityrosinaasia. L-DOPA-substraattia (1 mM) lisättiin reaktioseokseen ja sitten sitä inkuboitiin 10 minuuttia huoneenlämpötilassa. Absorbanssin muutos aallonpituudella 490 nm mitattiin 1,5 minuutin välein 15 minuutin ajan käyttämällä mikrolevylukijaa. Tyrosinaasin estoprosentti laskettiin seuraavalla kaavalla:

Antioksidanttiaktiivisuuden määritys

C. fistula -kukkauutteen antioksidanttiaktiivisuus määritettiin käyttämällä 1,1-difenyyli-2-pikrylhydratsyyli (DPPH)-vapaiden radikaalien aktiivisuutta, kuten aiemmin on kuvattu [28]. Erilaisia ​​pitoisuuksia kukkauutetta (0–100 ug/ml) valmistettiin metanoliin. 1 ml 0,002-prosenttista DPPH:ta lisättiin 1 ml:aan kukkauuteliuosta ja seosta pidettiin pimeässä 30 minuuttia. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 517 nm käyttäen spektrofotometriä. Prosentuaalinen esto laskettiin ja sitä verrattiin tavalliseen E-vitamiiniin (1–100 ug/ml) käyttämällä seuraavaa kaavaa:

C. fistula -kukkauutteiden antioksidanttiaktiivisuus varmistettiin käyttämällä ABTS-määritystä, kuten aiemmin kuvattiin [29]. ABTS [2,2'-atsino-bis(etyylibentstiatsoliini-6-sulfonihappo)]-radikaalikationi valmistettiin sekoittamalla 7 mM ABTS-varastoliuosta 2,45 mM kaliumpersulfaatin (K2S2O8) kanssa (1/1, v/v). Seosta inkuboitiin pimeässä 12-16 tuntia, kunnes reaktio oli päättynyt. Määritys suoritettiin 990 µl:lla ABTS-liuosta ja 10 µl:lla kukkauutetta (0–4 ug/ml). 6 minuutin kuluttua absorbanssi rekisteröitiin välittömästi aallonpituudella 734 nm käyttäen spektrofotometriä. Kukkauutteen ABTS-aktiivisuuden prosentuaalinen esto laskettiin käyttämällä seuraavaa yhtälöä:

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvoina ± keskihajonta (SD). Tilastollinen analyysi analysoitiin Prism version 6.{1}} ohjelmistolla käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa Dunnettin testillä. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin arvolla * p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0,001 tai **** p < 0,0001.

Tulokset

C. fistula -kukkauutteen fytokemiallinen karakterisointi

Näytteiden pakastekuivauksen sisältävän vaiheen jälkeen C. fistula -kukkauute punnittiin ja sille suoritettiin edelleen fytokemialliset ja biologiset tutkimukset. 18.08 g C. fistula -kukkauutetta saatiin 500 g raaka-aineesta ja kukkauutteen prosentuaalinen saanto oli 3,62. C. fistula -kukkauutteiden HPLC-sormenjälki määritettiin HPLC-analyysillä (kuvio 1). HPLC-profiili, joka osoitti fenoliyhdisteiden piikin, leimattiin yksittäisten komponenttien suhteen kullakin retentioajalla. C. fistula -kukkauutteen fenoliyhdisteiden karakterisointi on esitetty taulukossa 1. Kokonaisfenolipitoisuus kukkauutteessa oli 275,32 ± 14,21 mg GAE/g uutetta. Hydroksibentsoehappojohdannaisten, mukaan lukien vanilliinihappo ja protokatekuiinihappo, todettiin olevan {{20}},95 ± 0.09 ja 2,56 ± 0. 42 mg/g uutetta, vastaavasti, kun taas gallushapon arvoksi kirjattiin {{30}},60 ± 0,02 mg/g uutetta. Hydroksikanelihappojohdannaisia, mukaan lukien kumarihappo, ferulihappo ja klorogeenihappo, havaittiin pitoisuuksina 0,39 ± 0,08, 0,80 ± 0,09 ja 0,83 ± 0,03 mg/g uutetta, vastaavasti. Flavonoidipitoisuus oli 27,62 ± 3,56 mg CE/g uutetta. Katekiinia flavonolijohdannaisena mitattiin 1,10 ± 0.{43}} mg/g uutetta.

【Lisätietoja:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】