Talamuksen anterioriset ytimet: kriittinen substraatti ei-spatiaaliseen parilliseen muistiin rotilla, osa 2

2|MATERIAALIT JA MENETELMÄT

2.1|Eläimet ja kasvatusolosuhteet

Urospuoliset Long-Evans-rotat (12 kuukauden ikäiset; keskipaino 630 g) pidettiin kolmen tai neljän hengen ryhmissä Makrolon-häkeissä (48 28 22 cm) käänteisessä 12-h valo–pimeä-jaksossa (valot päälle klo 20. ).

Käyttäytymistestiä tehtiin valosyklin pimeässä vaiheessa viisi kertaa viikossa; havainnot vahvistivat, että rotat olivat suhteellisen aktiivisempia pimeän vaiheen aikana. Rotat pidettiin 85 %:ssa vapaan ruokinnan saaneesta ruumiinpainosta vedellä ad libitum; ruokaa annettiin ad libitum ennen ja jälkeen leikkauksen leikkauksen jälkeistä toipumista varten.

Leikkaus on prosessi sairauksien hoitamiseksi ja fyysisen terveyden parantamiseksi. Toipumisprosessi leikkauksen jälkeen vaatii erityistä huomiota. Hyvä olo vaatii fyysisen palautumisen lisäksi keskittymistä muistin palautumiseen. Leikkauksen jälkeisen toipumisen ja muistin välillä on vahva yhteys.

Leikkauksen aikana aivojen muistitoimintaan vaikuttavat usein tekijät, kuten kehon vastoinkäymiset ja anestesialääkkeiden vaikutukset. Kun keho on toipunut, kiinnitä huomiota hyvään ruokavalioon, kohtuulliseen liikuntaan ja riittävään uneen. Sairaalan ulkopuolella toipumisjakson aikana sinun tulee edelleen välttää liiallista toimintaa ja ylläpitää mukavaa kehon tilaa.

Elämistottumusten lisäksi järkevä psykologinen sopeutuminen auttaa myös terveyttä ja muistia palauttamaan. Rentoudu, säilytä rauhallinen mieli ja auta itseäsi sopeutumaan muistin palautumiseen. Samalla sinun tulee osallistua aktiivisesti virkistystoimintaan ja kommunikoida sukulaisten ja ystävien kanssa pitääksesi aivosi aktiivisina ja parantaaksesi kognitiivisia ja muistikykyjäsi. Tätä toimintaa voidaan lisätä asteittain ja se voidaan tehdä periaatteessa kerran viikossa.

Lyhyesti sanottuna leikkauksen jälkeinen toipumisprosessi vaatii kaikenlaista huomiota. Hyvien elintapojen ja psyykkisten sopeutumisten ylläpitäminen on erittäin tärkeä rooli fyysisen palautumisen ja muistin palautumisen edistämisessä. Suhtaudutaan asiaan myönteisesti, täydellä luottamuksella ja toivolla. Meidän on parannettava muistia, ja Cistanche deserticola voi parantaa merkittävästi muistia, koska Cistanche deserticola voi myös säädellä välittäjäaineiden tasapainoa, kuten lisäämällä asetyylikoliinin ja kasvutekijöiden tasoa. Nämä aineet ovat erittäin tärkeitä muistille ja oppimiselle. Lisäksi liha voi myös parantaa verenkiertoa ja edistää hapen toimitusta, mikä voi varmistaa, että aivot saavat riittävästi ravinteita ja energiaa, mikä parantaa aivojen elinvoimaa ja kestävyyttä.

Napsauta tietää tapoja parantaa aivojen toimintaa

Kaikki menettelyt vastasivat Canterburyn yliopiston eläinetiikkakomitean hyväksymiä ohjeita. Neljä rottaryhmää muodostettiin satunnaisella jakamalla leikkausta edeltävän perehtymisen jälkeen säteittäiseen käsivarren sokkeloon (RAM) ja kiitotielle. Nämä neljä ryhmää olivat kahdenvälisiä ATN-leesioita, joissa ei ollut jälkeäkään hajun ja esineen ärsykkeiden välillä, kun niitä harjoitettiin pariliitostehtävässä ja vastaavassa kahdessa Sham-leesioryhmässä.

Lopulliset otoskoot olivat (1) Sham-No Trace=7 (eli valeleesioryhmä, jossa ei ole väliä haju- ja esineärsykkeiden välillä, joita käytettiin pariliitostehtävässä); (2) Sham-Trace=7 (Shamlesion-ryhmälle on annettu 10-s-jälki hajun esiintymisen ja esineen ärsykkeiden välillä); (3) ATN-No Trace=8;ja (4) ATN-Trace=9. Toinen ATN-leesiorotta suljettiin pois, koska se ei täyttänyt leesiokriteerejä (katso alla).

2.2|Leikkaus

Rotat nukutettiin isofluraanilla (induktio 4 %; ylläpito 2,5 %) ja asetettiin stereotaksiseen laitteeseen, jossa oli atraumaattiset korvatangot (Kopf, Tujunga, CA). Etuhammastanko asetettiin 7,5 mm interauralisen viivan alapuolelle, jotta se minimoi etuhammasvaurion.

Kummallakin pallonpuoliskolla kaksi infuusiota suunnattiin anteroventraaliseen tumaan (AV; ylempi ja alempi) ja yksi infuusio suunnattiin theanteromediaaliseen tumaan (AM). Jokaisessa leikkauksessa käytettiin yhtä anterior-posterior (AP) -koordinaattia suhteessa yksittäisen rotan Bregma-Lambda-etäisyyteen (kaikki arvot inmm). AV-leesioiden AP-koordinaatit olivat: 2,20 B–L 6,9–7,2; 2,25 B–L:lle 7,3–7,6; 2,30 B–L Suurempi tai yhtä suuri kuin 7,7. AV-infuusiot tehtiin 5,68 ja 5,73 duran alapuolella ja 1,52 lateraalissa keskiviivasta.

AM-infuusio tehtiin {{0}},1 mm anterioriseksi kuin AV-koordinaatti, 5,76 kovakalvon alapuolella ja 1,16 lateraalisuunnassa; ensimmäinen AM-leesio tehtiin kaikkien AV-infuusioiden suorittamisen jälkeen ja se aloitettiin kontralateraalisesti viimeiseen AV-leesiokohtaan nähden. 0,15 M N-metyyli-d-aspartaattia (NMDA; Sigma, CastleHill, NSW) 0,1 M fosfaattipuskurissa (pH 7,20) infusoitiin kuhunkin kohtaan nopeudella 0,04 ul minuutissa 2.5-ulHamilton-ruisku (Reno, NV, USA) käyttäen mikroinfuusiopumppua (Stoelting, Wood Dale, IL).

AV sitesper -puolisko sai {{0}},12 ja 0,10 ul dorsalandin ventraalisille kohdille, vastaavasti; 0,06 ul käytettiin jokaiseen AM-kohtaan. Ruiskun neula pysyi paikallaan 3 minuuttia per puoli infuusion jälkeen.
Valeleesioleikkauksissa käytettiin samaa menettelyä, mutta neula laskettiin 1 mm:n korkeudelle ylemmän AV- ja AM-leesiokohtien yläpuolelle antamalla noinfuusio.

2.3|Käyttäytymistehtävät

Kahdeksanhaarainen RAM vahvisti spatiaalisen muistin heikkenemisen ATN-leesiorotilla leikkauksen jälkeen. Kiitotielaitteistolla rotat koulutettiin kaikkiin ei-avaruustehtäviin, eli yksinkertaisiin hajujen ja yksinkertaisten esineiden erotteluun sekä haju-objekti- ja haju-jälki-objekti-paritehtäviin.

Ennen leikkausta ruoalla rajoitetut rotat totutettiin kahdeksanhaaraiseen RAM-muistiin, joka on kuvattu alla, jotta ne saivat 0,1 g suklaapaloja (Foodfirst LTD Auckland, NZ) ja mukautuivat käsivarsien ovien avaamiseen ja sulkemiseen. Punaisella Perspex-kiitoradalla (kuva 1) rotat muotoiltiin myös niin, että ne pistivät 2-cm pyöreän valkoisen muovikorkin, joka oli 10 cm lattian yläpuolella ja ohuen sienen keskellä kirkkaassa Perspex-sisäkkeessä, joka oli kiinnitetty päätyseinä.

Ne muotoiltiin myös työntämään (käyttäen nenää tai tassua) sen pohjasta saranoitua esinettä ruokakaivoon, joka oli upotettu 5 x 8,5 3 cm:n puupalkan keskelle. Ruoka sisälsi suklaan paloja (ja säilytti syötävää, johon ei ollut pääsyä syvennyksen alla). Esiharjoitteluun käytettyä esinettä ei käytetty uudelleen. Leikkauksen jälkeen toipuvat rotat tutustuttiin uudelleen sekä RAM-muistiin että kiitotieen.

2.4|Tilallinen työmuisti RAM-muistissa

Leikkauksen jälkeistä spatiaalista työmuistia testattiin käyttämällä ikkunattoman huoneen (3 3 m) keskellä sijaitsevaa RAM-muistia. Labyrintissa oli harmaaksi maalattu puinen 35 cm leveä keskinapa, jossa oli kahdeksan alumiinivartta (65 cm pitkä, 8,6 cm leveä, 4,5 cm korkeat reunat), kohotettu 67,5 cm huoneen lattian yläpuolelle. Kirkkaat Perspex-seinät (19 cm pitkät ja 25 cm korkeat) ulottuivat kummankin käsivarren toiselle puolelle navasta estäen rottia hyppäämästä käsivarsien väliin.

Musta puinen ruokakuoppa (5 8,5 3 cm), jonka alle ei pääse käsiksi, asetettiin kummankin käsivarren päähän. Testauksen aikana jokaisen ruokakuopan alussa oli 2 0,1 g suklaapalaa. oikeudenkäyntiä. Kirkkaat Perspexguillotine-ovet, jotka voitiin nostaa navan alta hihnapyöräjärjestelmän avulla, kontrolloivat pääsyä napavarsiin.

Kymmenen peräkkäisen päivän muodollista koulutusta RAM-muistissa käytettiin tilatyömuistin testaamiseen. Rotta asetettiin keskinapaan, ja 10 sekuntia myöhemmin kaikki kahdeksan käsivartta avattiin, ja rotan annettiin tehdä valinta, joka määriteltiin molemmiksi takajaloiksi käsivarren kynnyksen yli. Kun rotta oli mennyt käsivarteen, kaikki ovet suljettiin ja se rajoittui käsivarteen 15 sekunniksi riippumatta siitä, tekikö se oikean valinnan.

Rotta päästettiin sitten takaisin keskinapaan ja pidettiin siellä 10 sekuntia ennen kuin kaikki ovet avattiin uudelleen toisen käsivarren valinnan mahdollistamiseksi. Koe päättyi, kun rathad vieraili kaikissa kahdeksassa käsivarressa, 20 käsivarren valintaa oli tehty tai 10 minuuttia oli kulunut.

2,5|Ei-tilatehtävät: Yksinkertainen syrjintä ja parillinen oppiminen

Sekä yksinkertaiset erottelutehtävät että parilliset liitännäistehtävät käyttivät samaa punaista Perspex-kiitotietä (93 26 26 cm), joka oli sijoitettu 75- cm korkealle pöydälle (kuva 1). Kiitotie voitaisiin jakaa kolmella pystysuoraan irrotettavalla ovella (redPerspex, 26 26 cm), jotka valittiin tietyn käyttäytymistehtävän perusteella. Mitä tulee tutustumiseen, 6,5 6 8 mm ohut sieni, jonka korkki oli keskellä, sisälsi suklaaruokapalkinnon (kuva 1).

Sieni kiinnitettiin kiitotien irrotettavaan oveen (pariliitostehtäviä varten) tai kiitotien päätyseinään (yksinkertaista erottelutehtävää varten). Jokaista hajua varten käytettiin erilaista doorplus-sientä, joka infusoitiin astian viereen 5 ml:lla auringonkukkaöljyä, johon oli sekoitettu 20 ul:aan New Zealandin eteerisiä öljyjä.

Tuoksuina olivat sitruuna ja neilikka parityössä ja kanelia ja limettiä yksinkertaisissa syrjintätehtävissä tai päinvastoin vastapainoisissa ryhmissä. Kevyet ja visuaalisesti erottuvat esineet (kuva 1) kiinnitettiin saranalla sen pohjan takaosassa ruokakuopan yläosaan, jotta rotta saattoi helposti työntää esinettä taaksepäin (joko nenän tai tassun) etsiäkseen kuopasta ruokapalkkion.

Puurunko (1,8 m korkea lattiasta, 1,3 m leveä), päällystetty mustilla verhoilla, sulki testialueen kaikki sivut vähentämään tilavihjeitä testauksen aikana.

Yksinkertaiset erottelut (vain haju; vain esine) ja parilliset tehtävät käyttivät "go/no-go" -menettelyä.

Ensimmäinen koe jokaiselle istunnolle aloitettiin pidättämällä rotta aloitusalueella 120 sekuntia, jotta se tottuisi uudelleen teemaan; myöhemmissä kokeissa käytettiin 20 s tällä lähtöalueella. Allrotit saivat 12 joukkokoetta päivittäistä hoitokertaa kohden, kuusi go (palkittu) ja kuusi no-gos (ei-palkita) koetta apseudo-satunnaistetussa järjestyksessä. Yhdessä istunnossa suoritettiin peräkkäin enintään kolme go tai kolme no-go-koetta.

Mitään neljästä haju-objekti-ärsykkeen parista ei toistettu peräkkäisissä kokeissa. Oikeat kohteet yksinkertaisissa syrjintätehtävissä ja oikeat ärsykeparit pari-assosioituneissa tehtävissä olivat vastapainoksi ristiin.

Yksinkertaista hajun erottelua varten vaste määriteltiin nenän työntämiseksi korkkiin hajustetun sienen keskellä; vain sienen nuuskailua pidettiin kieltovastauksena. Ruoka oli aina läsnä korkissa sienen keskellä haju-objekti-pariliitostehtäviä varten; go/no-go-aspekti viittaa tässä siihen, onko kohde työnnetty paljastamaan, oliko sen alla ruokapalkkio kiitotien päässä.

Esineiden kohdalla vaste määriteltiin mitä tahansa työntöä nenäkäpälällä, joka kallistaa kohdetta taaksepäin. Latenssi siitä hetkestä, kun viimeinen ovi nostettiin ja kun rotta oli vuorovaikutuksessa hajun kanssa (nenä pistää korkkiin; yksinkertaisen hajun erottelua varten) tai esineen kanssa (työnnetty saranaan taaksepäin, yksinkertaista esineiden erottelua ja parillisia tehtäviä varten). mitattu hiljaisella sekuntikellolla (Dick Smith, Uusi-Seelanti).

Tarkkailija istui verhojen sisällä kiitotien vieressä ohjaamaan ovia ja tallentamaan käyttäytymistä. Koe luokiteltiin "oikeaksi", jos rotta reagoi alle 8 sekunnissa liikkeellä olevissa kokeissa tai ei vastannut ennen 8 sekuntia no-go-kokeissa.

2,6|Yksinkertaista syrjintää

Puolet rotista sai koulutuksen yksinkertaisessa hajuerottelutehtävässä, jota seurasi yksinkertainen esineerottelu ja toinen puolisko päinvastoin. Oven X (kuva 1a) välinen latenssi ja vuorovaikutus kiitotien päässä olevan haju-objektin kanssa tallennettiin. Rottia koulutettiin yksinkertaiseen hajun ja yksinkertaisen esineen erottelutehtävään, kunnes ne saavuttivat kriteerin (80 % oikein kahden peräkkäisen päivän aikana).

Yksinkertaista hajuerottelutehtävää varten jokaisessa kokeessa esitettiin yksi haju. Rathad erottaa kumpi kahdesta hajusta oli paritettu ruokapalkkion kanssa, joka esitettiin lokeron B lopussa olevassa sienessä (kuva 1a).

Yksinkertaisessa objektien erottelutehtävässä kussakin kokeessa esitettiin yksi kohde B-osaston lopussa (ei esitetty kuvassa 1). Theratin täytyi oppia, kumpi kahdesta esineestä yhdistettiin esineen alle tarjotun ruokapalkkion kanssa.

2,7|Pariliitostehtävät (trace andno-trace)Näissä tehtävissä käytettiin uutta pystysuoraan irrotettavien ovien asettelua (kuva 1). Rotat oppivat kumpi kahdesta haju-objekti -parista palkittaisiin (esim. Haju 1 + ObjektiA ja Haju 2 + Objekti B) ja mitkä parit eivät palkittu (eli Haju 1 + Objekti B ja Haju 2 + Kohde A).

Parisuhteesta riippumatta rotat saivat aina palkinnon hajun ilmaantumisesta, kun ne päästettiin kiitotien toiseen osastoon. Tämä oli osasto C "no-trace" -tilasta, jossa osastoa A ei käytetty ja osasto B oli lähtöosasto. Haju oli osaston B päässä "jälki"-tilanteessa, johon osastoa A käytettiin aloituslaatikkona.

Jäljitystilassa olevat rotat altistettiin 10-s:n viiveelle hajun ja esineärsykkeiden välillä, kun niitä pidettiin osastossa C, kun taas rotat, joilla ei ollut jälkiä, altistettiin esineelle välittömästi niiden vuorovaikutuksen jälkeen hajun kanssa (sen jälkeen palkkion syöminen). Sekä jälki- että ei-jäljitysolosuhteissa tallensimme viiveen osaston D läpikulkua varten siitä hetkestä, kun DoorZ nostettiin, kunnes rotta oli vuorovaikutuksessa kohteen kanssa tai pidättäytyi vuorovaikutuksesta sen kanssa 8 sekunnin ajan.

Kahta rottaryhmää (Sham-leesio ja ATN-leesio) koulutettiin tuoksu–objekti-pariliitostehtäviin (ei jäljitysryhmät), ja kaksi vastaavaa ryhmää koulutettiin haju–jälki–objekti-pariliitostehtäviin (jälkiryhmät), kunnes he saavutti ehdon (80 % oikeita kokeita kolmen päivän aikana) tai enintään 50 päivää.

2,8|Hankinnan jälkeinen säilytystesti

Pariliitostehtävän säilyttäminen mille tahansa rotalle suoritettiin 5 päivää kriteerin saavuttamisen jälkeen tai 50 päivän harjoittelun jälkeen. Tässä istunnossa käytettiin 12 palkitsevaa/palkitsematonta koetta yhtenä päivänä samalla tavalla kuin aiemmin kyseiselle rotalle.

2,9|Histologia

2.9.1|Perfuusio ja kudosten kerääminen

Kolmea päivää ennen pidätystestiä yksittäisiä rottia tutustuttiin tyhjään puhtaaseen häkkiin 90 minuutin ajan pimeässä ja hiljaisessa huoneessa. Välittömästi viimeisen retentiotestin kokeen jälkeen rotta sijoitettiin häkkiinsä tuttuun pimeään hiljaiseen huoneeseen 90 minuuttia ennen perfuusiota.

Rotat nukutettiin syvästi natriumpentobarbitaalilla (125 mg/kg) ja perfusoitiin transkardiaalisesti suolaliuoksella ja sen jälkeen paraformaldehydillä [4 % PFA:ta 0,1 M fosfaattipuskurissa (PB)] aivojen kiinnittämiseksi. Aivot jälkikiinnitettiin 4 % PFA:ssa, mitä seurasi vähintään 48 tuntia pitkäaikaisliuoksessa (20 % glyserolia 0,1 M PB:ssä). Koronaaliset 40-μm-leikkeet kerättiin pakastusmikrotomilla (Thermo Fisher, UK) ja säilytettiin kylmältä suojaavassa liuoksessa (30 % glyserolia, 30 % etyleeniglykolia 0,1 M PB:ssä) 20 C:ssa, kunnes ne käsiteltiin immunohistokemiaa varten.

Koronaaliset leikkeet kerättiin kahteen erilliseen sarjaan. Ensimmäisessä sarjassa otettiin peräkkäisiä leikkeitä viidessä kryovialissa immunohistokemiaa varten (eli yksi viidestä). Tämä sarja sisälsi osien etummaisen lohkon prefrontaalisesta aivokuoresta septaalialueelle (noin {{0}},7–0,6 mm Bregmasta) ja takaosan välipalasta (noin 3,5 mm Bregmasta) kaudaaliseen. retrospleniaalinen aivokuori.

Toinen sarja otti peräkkäisiä osia leesioiden todentamista varten. Nämä leikkeet kerättiin neljään kryoviaaliin välittömästi ATN:n etupuolelta takamyrskyn talamukseen (noin 0,6-3,5 mm Bregmasta).

2.9.2|Neu-N-värjäys ja ATN-leesion todentaminen

Vapaasti kelluvat leikkeet kaikkialla ATN-alueella pestiin (3 10 min) 0,1 M fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa Triton-X:llä (0,2 %; PBSTx) ennen inkubaatiota endogeenisessa peroksidaasia estävässä puskurissa 30 min [1 % vetyperoksidia (H2O2), 50 % metanolia (CH3OH) 2 % PBSTx:ssä].

Leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 C inanti-NeuN -primaarisessa vasta-aineessa (1:5000; monoklonaalinen-MouseCat# MAB377; Millipore, California USA) PBSTx:ssä, jossa oli 1 % normaalia vuohen seerumia (NGS; Life Technologies, NZ).

Ylimääräinen vasta-ainepuskuri poistettiin PBSTx:lla ja sitä seurasi inkubaatio biotinyloidussa vuohen anti-hiiri-sekundaarisessa vasta-aineessa (1:1000 Cat# BP-9200-50: VectorLaboratories, California USA) yön yli 4 C:ssa PBSTx:ssä ja 1 % NGS:ssä. Leikkeet asetettiin ExtrAvidiniin (peroksidaasikonjugoitu; 1:1000; Sigma, NSW Australia), PBSTx:ään ja 1 % NGS:ään 2 tunniksi huoneenlämpötilassa.

Ylimääräisen ExtrAvidinin ja Triton X{{0}} poistamiseksi leikkeet pestiin PBS-, PB- ja sitten Tris-puskurilla (pH 7,4 tislatussa H2:ssa0) leikkeiden valmistelemiseksi visualisointia varten juuri valmistetulla diaminobentsidiinillä ( DAB 0,05 %; Sigma 0,01 % H202:ssa Tris-puskurissa).

DAB-reaktio (noin 5 minuuttia) pysäytettiin käyttämällä Tris-puskuria (1 x 10 min pesu), ja leikkeet asetettiin PB:hen 4 °C:seen yön yli ennen kiinnitystä gelatinoiduille objektilaseille ja annettiin kuivua. Objektilasit dehydratoitiin läpilajitellulla alkoholilla (70–100 %) ennen kuin ne puhdistettiin inksyleenistä ja kiinnitettiin DPX:llä (06522; Sigma-Aldrich) ja peitinlasilla.

Neu-N-positiivisten solujen lukumäärää ATN:ssä käytettiin leesion laajuuden määrittämiseen. Tämä käytti osia sekä vasemmasta että oikeasta pallonpuoliskosta jokaista neljän40-μm:n osuutta kohti koko ATN:n alueella ja aluetta kvantitatiivisesti ImageJ:n avulla (NIH, USA). NeuN-positiivinen soluvärjäys valokuvattiin viidellä objektiivilla LeicaDM6 B -pystymikroskoopilla ja DFC7000T-kameralla (Leica Microsystems, Saksa).

Automaattiset solujen laskelmat saatiin ImageJ:n avulla (image analysissoftware, National Institute of Health, NIH, USA). ATN-alueen hermosoluja ympäröivä alue valittiin manuaalisesti ja kuvat muutettiin {{0}}bittiharmaasävyiksi, tausta vähennettiin (rullaa=40), muutettiin maskiksi ja vedenjakajatoimintoa käytettiin, ja kaikki hermosolut, jotka ylittivät kynnyksen ("MaxEntropy" -kynnys, kiertokulku 0,5–1,0), laskettiin.

Havaitsemiskynnys oli sama kaikissa osissa. Automaattiset NeuN-värjätyt solutumat laskettiin yhdeksässä valerotissa (viisi Sham-Trace-ryhmässä ja neljä Sham-No Trace -ryhmässä) solumäärän ilmentämiseksi ATN:ssä.

Säästettyjen solujen NeuN-värjäytyneiden tumien automaattisia lukuja kaikissa ATN-leesiorotissa verrattiin suhteessa valerotissa havaittuun NeuN-solujen keskimääräiseen määrään. Hyväksyttävien leesioiden määriteltiin saavuttavan 50 %:n soluhäviön kriteerin ATN:ssä ja vähintään 25 %:n aivopuoliskoa kohden. Tämä on yhdenmukainen aiempien tutkimusten ATN-leesiokriteerien kanssa (Mitchell & Dalrymple-Alford, 2005, 2006; Perryet al., 2018).

2.9.3|Zif268-immunohistokemia

Vapaasti kelluvat leikkeet käsiteltiin samalla tavalla kuin NeuN, mutta niitä inkuboitiin kanin polyklonaalisessa Zif268-primaarisessa vasta-aineessa (Egr-1; 1:1000 Cat# sc-110; Santa CruzBiotechnology, USA) 72 tuntia klo. 4 C:ssa PBSTx:ssä 1 % NGS:llä, minkä jälkeen inkuboidaan biotinyloidussa vuohen anti-kanin sekundaarisessa vasta-aineessa (1:1000: Vector LaboratoriesBA{11}}) yön yli PBSTx:ssä ja 1 % NGS:ssä.

DAB-visualisoinnin (18 min) jälkeen Zif268-positiivinen soluvärjäytyminen kullakin kiinnostavalla alueella valokuvattiin 10-objektiivilla valomikroskoopilla (Leica, Saksa). Automaattiset solumäärät saatiin ImageJ:n avulla ( NIH, USA) samalla tavalla kuin NeuNpositive-solut, paitsi että sirkulaarisuus asetettiin arvoon 0,65–1,0.

Zif{0}}positiivisten solujen määrä kaikilla alueilla käytti samaa kynnysalgoritmia, ja kunkin rotan kiinnostuksen kohteena olevaa aluetta kohden määritettiin 2–6 osiota. Keskimääräistä Zif268-positiivista solumäärää mm2:tä kohden käytettiin osissa (molemmalta pallonpuoliskolta) kiinnostavalla alueella.

2.10|Tietojen analysointi

ANOVA käyttäen Statisticaa (v13; Dell Inc.) suoritettiin keskimääräisten erojen testaamiseksi neljässä rottaryhmässä (Sham-No Trace, Sham-Trace, ATN-No Trace ja ATNTrace). Toistetut mittaustekijät lisättiin päiville (RAM ja yksinkertainen syrjintä), kokeilulohkoille (pariliitostehtävät) ja Zif268-laskuille liittyvillä alueilla tai kiinnostavilla osa-alueilla.

Sekä RAM- että yksinkertaisten erottelutehtävien ANOVA vertaili neljää ryhmää sen varmistamiseksi, että kaksi Sham-leesio- ja kaksi ATN-leesioryhmää olivat yhdenmukaisia ​​keskenään, mutta huomaa, että RAM-muistissa tai yksinkertaisissa erottelutehtävissä ei ollut jälkikomponenttia. Sekä yksinkertaisen erottelun että parillisten tehtävien osalta kiitotiellä käytettiin latenssitietojen vastavuoroista muuntamista yksittäisissä kokeissa varianssin homogeenisuuden varmistamiseksi.

Millä tahansa testipäivällä muunnetut latenssit loivat keskimääräisen latenssin jokaiselle kuudesta palkitsemattomasta kokeesta ja kuudesta palkitusta kokeesta. Yksinkertaisten syrjintätehtävien osalta analysoimme keskimääräisen latenssieropisteen (palkittujen kokeiden keskiarvo miinus sitten palkitsemattomien kokeiden keskiarvo), mutta emme palkittuja ja palkitsemattomia kokeita erikseen tiedontallennusvirheen vuoksi.

Kaikki kolme viivemittausta olivat käytettävissä pariliitosmuistitehtävissä (palkitsemattomat kokeet, palkitsevat kokeilut ja latenssiero). Useiden vertailujen huomioon ottamiseksi ja tyypin I ja tyypin II virheiden tasapainottamiseksi käytimme käyttäytymisanalyyseihin merkitsevyystasoa p < 0,02, koska pariliitostehtävässä oli kolme toisiinsa liittyvää mittaa (palkitsemattomat kokeet, palkitut kokeet). ja keskimääräinen latenssiero).

Zif268:n ilmentymisen kannalta kiinnostaville alueille tehtiin kuusi ensisijaista analyysiä, ja näiden analyysien merkitys määritettiin p < 0,01. Posthoc Newman–Keuls (NK) -testit arvioivat pareittain ryhmäeroja. Yksinkertaista päävaikutusten analyysiä käytettiin, kun oli merkittäviä vuorovaikutuksia, joihin liittyi toistuvia mittaustekijöitä.

3|TULOKSET

3.1|Leesion todentaminen

Kaikki yhtä lukuun ottamatta 18 rotista, joilla oli ATN-leesioita, täyttivät apriori-kriteerin, jonka mukaan ATN:n vaurio oli 50 % ja vähintään 25 % pallonpuoliskoa kohden. Kaksipuolisen vaurion mediaani oli 76 % molemmissa ATN-leesioryhmissä (vaihteluväli: ATN-No Trace, 61 %–93 %; ATN-Trace, 63 %–93 %; kuva 2). Poissuljetulla rotalla oli tyydyttävä vaurio vain yhdessä pallonpuoliskossa (48 % yhteensä, 75 % vasemmalla ja 20 % oikealla).

Kuva 2d osoittaa, että ATN-neuronien NeuN-määrät ATN-leesiorotissa (M=3388, SD=2024) olivat selvästi alle arvojen, jotka havaittiin valeleesiorotissa (M=15, 339, SD=1065; tämä luku oli samanlainen kuin Frostin et al., 2020 raportoima luku). Kahdeksalla 17 leesorottasta (neljä Trace-ryhmässä ja neljä No-Trace-ryhmässä) ei ollut vaurioitunut keski-odorsaalisessa talamuksessa (MD) eikä reunions-/romboidisissa (Re/Rh) ytimissä, ja vaurioita oli suhteellisen vähän. nämä rakenteet jäljellä olevissa yhdeksässä rotassa, joilla on vaurioita.

Kun MD-vaurio tapahtui, se oli anteriorisissa aspekteissa, jotka sijaitsevat ATN:n vieressä. Joten MD-vaurion arvioitiin olevan noin {{0}},72–+2,10 mm Bregmasta, jossa se vaihteli 0–41 prosentin soluhäviöstä koko alueella. ryhmä (mediaani=21%). Kun Re/Rh-vaurio tapahtui, se oli myös ATN-alueen vieressä, joten sen arvioitiin olevan noin 1,08–2,04 mm Bregmasta, missä se vaihteli 0–33 % (mediaani=6%). Huomaa, että nämä prosentuaaliset vamman arvot eivät edusta koko MD- ja Re/Rh-aluetta, koska molempien tumien taka-alueet olivat ehjät kaikissa ATN-leesiorotissa.

For more information:1950477648nn@gmail.com