Anterior Basolalateral Amygdala neuronit sisältävät kaukopelkomuistiengrammin, osa 1

Esittely:

Uhkaavat ympäristön vihjeet synnyttävät usein kestäviä pelkomuistoja, mutta kuinka ne muodostuvat ja säilytetään, tutkitaan edelleen aktiivisesti.

Pelkomuisti on muistin muoto aivoissamme. Se on hyvin erityinen muistimuoto, joka saa meidät usein pelkäämään, pelkäämään ja hermostumaan. Mutta tämän pelkomuistin ja muistimme välinen suhde on hyvin monimutkainen.

Ensinnäkin pelkomuistoilla ei ole mitään tekemistä lyhytaikaisen muistimme kanssa. Suurin osa pelkomuistoista on tallennettu pitkäaikaisiin muistipankkeihimme. Tästä syystä mielessämme leijuu joskus muistoja kauan sitten.

Toiseksi, pelkomuistot eivät välttämättä vaikuta muistiimme. Vaikka se voi aiheuttaa muutoksia huomiossamme ja mielialassamme, ei ole näyttöä siitä, että se aiheuttaisi muistin menetystä. Monet ihmiset voivat silti näyttää erittäin vahvoja muistoja kokeaan joitain kauheita asioita.

Lopuksi, meidän ei pitäisi antaa pelottavien muistojen tulla teemaksi elämässämme. Meidän on ryhdyttävä positiivisiin toimiin käsitelläksemme nämä muistot ja siirtyäksemme positiivisempaan suuntaan. Tämä sisältää terapian saamisen, sosiaalisesti aktiivisuuden, kehon ja aivojen harjoittamisen sekä positiivisen ajattelutavan ja mielenterveyden ylläpitämisen.

Joten vaikka pelottavat muistot voivat aiheuttaa meille paljon stressiä ja epämukavuutta, meidän on uskottava kykyihimme ja ponnisteluihimme. Voimme kohdata nämä pelottavat muistot, vahvistaa muistiamme, kasvaa ja tulla paremmiksi, itsevarmemmiksi ihmisiksi. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistiamme. Cistanche deserticola voi parantaa muistia merkittävästi, koska Cistanche deserticola on perinteinen kiinalainen lääkeaine, jolla on monia ainutlaatuisia vaikutuksia, joista yksi on muistin parantaminen. Jauhetun lihan teho perustuu sen sisältämiin erilaisiin vaikuttaviin ainesosiin, mukaan lukien happo, polysakkaridit, flavonoidit jne. Nämä ainesosat voivat edistää aivojen terveyttä monin eri tavoin.

Napsauta Tiedä lyhytaikaista muistia, kuinka voit parantaa

Äskettäisen pelkomuistin palauttamisen uskotaan heijastavan hermosolujen uudelleenaktivoitumista useilla aivoalueilla, jotka aktivoituvat muistin muodostumisen aikana, mikä osoittaa, että anatomisesti jakautuneet ja toisiinsa liittyvät hermosolut sisältävät pelkomuistiengrammeja.

Se, missä määrin anatomisesti spesifiset aktivoinnin uudelleenaktivointimerkit jatkuvat pitkäaikaisen pelkomuistin palauttamisen aikana, on kuitenkin suurelta osin tutkimatta. Oletimme, että etummaisen basolateraalisen amygdalan (BLA) päähermosolut, jotka koodaavat negatiivista valenssia, aktivoituvat akuutisti uudelleen kaukopelkomuistin palauttamisen aikana ohjatakseen pelkokäyttäytymistä.

Menetelmät:

Käyttämällä TRAP2- ja Ai14-hiirten aikuisia jälkeläisiä käytettiin jatkuvaa tdTomato-ekspressiota aBLA-neuronien "TRAP" saamiseksi, joille tehtiin Fos-aktivaatio kontekstuaalisen pelon ehdoin (sähköiskut) tai vain kontekstin ehdoin (ei iskuja) (n=5/ryhmä) . Kolme viikkoa myöhemmin hiiret altistettiin uudelleen samalle kontekstille etämuistin palauttamiseksi ja sitten uhrattiin fosimmunohistokemian vuoksi.

Tulokset:

TRAPed (tdTomato +), Fos + ja uudelleen aktivoidut (kaksoismerkityt) neuronaaliset ryhmät olivat suurempia peloissaan kuin kontekstissa säädetyt hiiret, ja aBLA:n keskimmäinen osa-alue ja keskimmäinen/kaudaalinen dorsomediaalinen kvadrantti esittivät suurimmat tiheydet kaikista kolmesta ryhmäpopulaatiosta.

Kun taas dTomato + -yhtyeet olivat pääosin glutamatergisiä kontekstissa ja pelkoryhmissä, jäätymiskäyttäytyminen etämuistin palauttamisen aikana ei korreloi yhtyeiden koon kanssa kummassakaan ryhmässä.

Keskustelu:

Päättelemme, että vaikka aBLA:n sisältävä pelkomuistigrammi muodostuu ja säilyy kaukaisessa pisteessä, plastisuus, joka vaikuttaa engrammihermosolujen sähköfysiologisiin vasteisiin, ei niiden populaatiokokoon, koodaa pelkomuistia ja ohjaa pitkäaikaisen pelkomuistin palauttamisen käyttäytymisilmiöitä.

Johdanto

Pelkoa herättävät ärsykkeet muodostavat usein vankkoja ja kestäviä assosiatiivisia muistoja, jotka yhdistävät ympäristön vihjeet uhkaaviin elämäntapahtumiin.

Myöhemmät kohtaamiset samanlaisten havaittujen uhkien kanssa johtavat voimakkaampiin suojakäyttäytymiseen, mikä heijastaa pelkomuistin palauttamista. Virheet pelko-assosiaatioprosessoinnissa voivat johtaa negatiivisen valenssin psykiatrisiin seurauksiin, mukaan lukien ahdistuneisuus ja posttraumaattinen stressihäiriö (PTSD) (Tovote et al., 2015).

Pelkomuistin taustalla olevien mekanismien täyden monimutkaisuuden ymmärtäminen on välttämätöntä sellaisten toiminnallisten piirien poikkeavuuksien tunnistamiseksi, jotka edistävät pelkoon liittyviä psykiatrisia sairauksia ja ehdottavat uusia terapeuttisia kohteita normaalin pelonkäsittelyn palauttamiseksi.

Viime vuosikymmeninä pelkomuistitutkimus on keskittynyt pitkälti lyhytaikaisen muistin muodostukseen, tallentamiseen ja muistamiseen (Kimand Jung, 2006; Kim ja Cho, 2020; Lee et al., 2021).

Tutkimukset ovat osoittaneet, että laajalti jakautuneet toisiinsa liittyvät keskushermoston hermosolut ovat vastuussa pelko-muistin muodostumisesta ja varastoinnista (Ramirez et al., 2013; Liu et al., 2014; Roy et al., 2022). Näiden ryhmien aktivointi havaittujen uhkien vaikutuksesta johtaa voimistuneeseen synaptiseen siirtoon, joka edustaa pysyvää fyysistä jälkiä, joka tunnetaan nimellä muistiengrammi (Yuan et al., 2011; Miyawaki ja Mizuseki, 2022).

Lyhytaikaisen muistin palauttamisen uskotaan heijastavan samojen hermosoluryhmien uudelleenaktivoitumista, jotka aktivoitiin alun perin muistin muodostumisen aikana, ja todisteet osoittavat, että jopa yksittäisen hermosoluryhmän osittainen aktivoituminen voi herättää pelkoon liittyvää käyttäytymistä, mikä viittaa muistin palauttamiseen (Roy et al., 2022). ). Vaikka stanatomisesti vakaat potensoidut piiriengrammit voivat selittää lyhytaikaisen pelkomuistin, se, missä määrin ne osallistuvat pitkäaikaiseen pelkomuistiin, on edelleen epäselvää.

Vaikka pitkän aikavälin pelkomuistin lujittumisen uskotaan riippuvan lyhytaikaisen muistin asteittaisesta tai satunnaisesta vahvistumisesta, useat viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että lyhytaikaisen pelon muistin hermosolujen ryhmät muuttuvat ajasta riippuvaiseksi uudelleenorganisoitumiseksi, mikä johtaa tallennettujen muistien siirtymiseen toiseen hermosoluryhmään joko sisällä. sama aivoalue (DeNardo et al., 2019) tai eri aivoalueet kokonaan (Frankland ja Bontempi, 2005; Do Monte ym., 2016).

Basolateraalinen amygdala (BLA) on aivojen alue, joka on olennainen osa pelkomuistia, ja se on osallisena sekä äskettäisessä että etäisessä pelkomuistissa (Maren et al., 1996; Gale et al., 2004; Kitamura et al., 2017; Liu et al. ., 2022).

Erityisesti raportit ovat kuvanneet BLA:ssa erityisen lyhytaikaisen pelko-muistin engrammin, joka (1) aktivoituu muistin muodostumisen aikana, (2) aktivoituu uudelleen muistin palauttamisen aikana ja (3) pystyy ohjaamaan pelon kaltaista käyttäytymistä ei-pelkotilanteissa ( Royet al., 2022; Zaki et ai., 2022). Kuitenkin, missä määrin muistin muodostuksen aikana aktivoitunut aBLA-hermosoluryhmä aktivoituu uudelleen etämuistin palauttamisen aikana, on edelleen epäselvä.

Tässä tutkimuksessa testasimme hypoteesia, että BLAfear-muistiryhmän uudelleenaktivoituminen havaitaan etäajankohdassa 3 viikkoa pelon ehdollistamisen jälkeen. Erityisen tärkeitä ovat BLA-talopiirit, jotka myötävaikuttavat sekä vastenmielisyyteen että palkintoja tavoittelevaan käyttäytymiseen (Hu, 2016), ja negatiivisen valenssin neuronit reagoivat pelkoärsykkeisiin, jotka ovat paikantuneet erityisesti etu-BLA:han (aBLA) (Goosensand Maren, 2001; Kim et al., 2016, 2017; Zhang et ai., 2020).

Keskittyessämme aBLA:han käytimme toisen sukupolven TargetedRecombination in Activated Populations (TRAP2) siirtogeenisiä hiiriä (DeNardo et al., 2019), joissa Cre-rekombinaasiaktiivisuus on sidottu c-fos-välittömän varhaisen geenin promoottorin tehostajaelementteihin parannetun Cren avulla. - estrogeenireseptori (ER) -kompleksi. Tätä kompleksia ekspressoivat neuronit voivat läpikäydä jatkuvan Cre-rekombinaation, eli se voidaan "TRAPoida" antamalla ER-agonisttamoksifeenia tai sen lyhyempivaikutteista analogia 4-hydroksitamoksifeenia (4-OHT), mikä mahdollistaa Cre:n jatkuvan ilmentymisen. -riippuvaiset efektori- tai reportterimolekyylit.

Täällä risteytettiin TRAP2-hiiret ja Cre-riippuvainen tdTomato-reportterilinja Ai14 (Madisen et al., 2010) ja kvantifioitiin, missä määrin aBLA-neuronit TRAPed (tdTomatopositive) aktivoituvat uudelleen kontekstuaalisen pelon ehdottelun aikana (ekspressoi Fos-immunoreaktiivista proteiinia) etämuistirekaalitutkimuksen aikana. 3 viikkoa myöhemmin.

Kuten lyhytaikaisessa pelkomuistissa, löydökseemme tukevat pitkäaikaisen glutamatergisen pelkomuistin neuronaalisten ryhmien esiintymistä aBLA:ssa.

Erityisesti on kuitenkin huomattava, että aBLA-hermosoluryhmien koko, aktivoitiinpa ne ehdottelun tai etämuistin palauttamisen tai molempien aikana, ei korreloinut pelkokäyttäytymisen kanssa, mikä viittaa siihen, että pelon oppimiseen liittyvän plastisuuden luonne ja sen mahdollinen vaikutus kaukopelkomuistin palauttamiseen liittyvät ryhmäneuronien elektrofysiologisiin vasteisiin. , ei yhtyepopulaation koko, ohjaa ensisijaisesti kaukopelomuistikäyttäytymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen hyväksyntä

Teksasin yliopiston terveysalan SanAntonion Institutional Animal Care and Use Committee hyväksyi kokeelliset menettelyt, ja ne olivat National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals -ohjeita.

Eläimet

Pesiviä homotsygoottisia Fos2A-iCreER/2A-iCreER knockin (TRAP2, #030323) ja R26Ai14/+ (Ai14, #007914) hiiriä (Jackson Laboratories) risteytettiin urospuolisten hemitsygoottisten TRAP2:1-jälkeläisten (AFigu14re TRAP2:1) tuottamiseksi. Vieroituksen jälkeen hiiret ryhmiteltiin ja pidettiin muovihäkeissä (29 × 18 × 13 cm), joissa oli jyrsijäpeitteet (Sani-chips; Harlan Teklad, Madison, WI, USA). :10 hlight-pimeä sykli (valot päälle klo 0600). Ruokaa ja vettä oli saatavilla ad libitum. Kokeet aloitettiin, kun hiiret olivat 3 kuukauden ikäisiä.

Käyttäytymiseen tottuminen

Kuten aiemmin julkaistuissa tutkimuksissa (DeNardo et al., 2019), hiirille tehtiin viisi peräkkäistä totutusharjoittelua välittömästi ennen kontekstuaalista pelon ehdollistamista cfos-induktion minimoimiseksi vastauksena koeolosuhteisiin, joita ei ole tutkittu (esim. käsittely, uusi kontekstin tutkiminen jne.)( Kuva 1B).

Jokainen päivittäinen totutteluistunto kesti 3 minuuttia ja koostui altistumisesta ilmastointikammiolle (HabitestModular System, Coulbourn Instruments). Kammion sensoriset vihjeet koostuivat (1) 70 % etanolista (hajuvihje), (2) metalliristikkolattiasta (haptinen vihje), (3) kuvioidusta taustasta (visuaalinen vihje) ja (4) näkyvästä valosta (visuaalinen vihje).

Lisäksi kaikkia hiiriä pidettiin käsissä minuutin ajan ennen kuin ne asetettiin hoitokammioon, ja niitä "raapattiin" varovasti 10 sekunnin ajan kammiosta poistuttuaan. Totutusistunnot suunniteltiin jäljittelemään hiirten käsittelyä hoitopäivänä, paitsi että vatsaontelonsisäisiä (IP) injektioita ei tehty.

Kontekstuaalinen pelon ehdolla

Hiiret jaettiin seuraavaksi satunnaisesti pelon ehdollistettuihin (shokki) ja kontekstiin ehdollistettuihin (ei shokkia/vain konteksti) ryhmiin. Hoito aloitettiin päivänä 0 ja koostui siitä, että hiiret sijoitettiin hoitokammioon ja annettiin tutkia 2 min. Seuraavien 4 minuutin aikana pelosta ehdolla oleva misere sai sarjan viiden jalan pituisia iskuja, joiden kesto oli 1 s ja intensiteetti 0,75.

Iskuja annettiin hiirille arvaamattomin väliajoin, mutta silti yhdenmukaisia ​​hiirten välillä. Kontekstikäsitellyille hiirille tehtiin identtinen protokolla jalkaiskuja lukuun ottamatta (kuva 1C). Tehtävän päätyttyä jokainen hiiri sai injektion 4-hydroksitamoksifeenia (4-OHT, 100 mg/kg, IP) liuotettuna auringonkukka- ja risiiniöljyn 4:1 cocktailiin, joka oli valmistettu aiemmin kuvatulla tavalla (DeNardo et al., 2019).

Hiiret palautettiin sitten kotihäkkeihinsä, joissa ne jätettiin häiritsemättä käyttäytymishuoneen viereiseen huoneeseen vähintään 72 tunniksi ennen kuin he palasivat normaaliin asumiseen.

Kolme viikkoa pelon ehdollistamisen (päivä 21) jälkeen hiirille tehtiin etämuistitesti (kuvio 1D), joka koostui altistumisesta uudelleen testikammioon aistinvaraisilla vihjeillä, jotka olivat identtisiä ehdoittelun aikana esiintyvien kanssa. Hiirten annettiin tutkia kammiota 5 minuutin ajan, jonka aikana pelkokäyttäytyminen (asentojäätyminen) pisteytettiin käyttämällä FreezeFrame 4 -videoseurantaohjelmistoa (ActiMetrics, Wilmette IL, USA).

Aivojen kiinnitys ja histologia

90 minuuttia muistitestin jälkeen hiiret nukutettiin syvästi isofluraanilla (5 % hapessa) ja sitten heille suoritettiin transkardiaalinen perfuusio 30 ml:lla heparinisoitua (100 U/ml) isotonista suolaliuosta ja sen jälkeen 100 ml 4 % paraformaldehydiä (PFA) ) 0,1 M fosfaattipuskurissa.

Aivot poistettiin, jälkikiinnitettiin 4-prosenttisessa PFA:ssa 6 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (~22°C) ja kylmäsuojatussa 30-prosenttisessa sakkaroosissa -0.01 M fosfaattipuskurisuolaliuoksessa (PBS) vähintään 2 päivän ajan.

Aivot leikattiin sitten 30 µm paksuisiin koronaalisiin leikkeisiin jäädyttävällä mikrotomilla (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa) ja aBLA:ta sisältävät leikkeet (Paxinos ja Franklin, 2019), säilytettiin polyvinyylipyrrolidonissa (PVP) -20 ◦C:ssa.

Immunohistokemia

Immunovärjäys suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Mitchell et al., 2018; Maruyama et al., 2019).

Lyhyesti sanottuna leikkeet pestiin PBS:ssä PVP:n jäätymisenestoaineen poistamiseksi ja inkuboitiin 3 0 minuuttia PBS:ssä, joka sisälsi natriumboorihydridiä (0,5 %) kiinnityksen aikana syntyneiden autofluoresoivien aldehydien poistamiseksi. Ylimääräisten PBS-pesujen jälkeen leikkeitä inkuboitiin estopuskurissa (3 % vuohen seerumia, 0,05 % Triton-X-100 PBS:ssä) 2 tunnin ajan ~22°C:ssa, minkä jälkeen inkuboitiin 4°C:ssa estopuskurissa, joka sisälsi apolyklonaalista kaniinia c. -Fos-primaarinen vasta-aine (Ab) 72 tunnin ajan (1:1 500,synaptiset järjestelmät #226 003) tai monoklonaalinen hiiren CaMKII-primääriAb 24 tunnin ajan (1:500, Enzo Life Sciences, #ADI-KAM-CA002).

Lisäpesun jälkeen Fos- ja CaMKII-leikkeitä inkuboitiin erikseen 2 tuntia ∼ 22 °C:ssa biotinyloidussa vuohen anti-rabbitIgG sekundaarisessa Ab:ssa (1:25{6}} EMD Millipore #AP132B), minkä jälkeen suoritettiin sarjapesu 0. 05 M tris-puskuroitu suolaliuos (TBS) ja 0,1 M natriumasetaatti altistettiin sitten streptavidiini-Alexa Fluor 488:lle (1:250, Invitrogen #S11223) 1 tunnin ajaksi TBS-pohjaisessa estoliuoksessa.

Lopuksi leikkeet pestiin Tris-puskurissa ja kiinnitettiin dialle Fluoromount-G:llä (Invitrogen, #00-4958-02).

Kuvantaminen ja analyysi

A{{0}}-bittistä valomonistinputkea, joka oli liitetty Zeiss LSM710-laserpyyhkäisykonfokaalimikroskooppiin ja joka oli varustettu asianmukaisilla laserlinjoilla, käytettiin ottamaan aBLA-kuvia käyttämällä 20-kertaista objektiivia (NA 0,8) ja skannauspään reiän kokoa 47,5 µm. Jokaiselle kuvalle käytettiin ImageJ-ohjelmistoa (NIH, Bethesda, MD) luomaan erilliset pikselikartat tdTomato (eli TRAPed, punainen) ja Alexa-488 (Fos, vihreä) fluoresenssista.

Pikselikynnyksen intensiteetti ja aallonpituuden päällekkäisyyden havaitseminen kaksoisleimauksessa määritettiin vertaamalla kudososia, jotka oli käsitelty Fo:n ensisijaisen Ab:n kanssa ja ilman sitä, kuten aiemmin on kuvattu (Mitchell et al., 2018; Maruyama et al., 2019). Solulaskenta- ja yhteislokalisaatiotiedot saatiin nämä puoliautonominen ImageJ-laajennus EzColocalization (Stauffer et al., 2018).

Kuvat aBLA:sta jaettiin kolmeen lähes samankokoiseen rostro-kaudaaliseen osa-alueeseen, jolloin kukin osa-alue määriteltiin rostral-caudaalisten stereotaksisten koordinaattien spesifisellä alueella suhteessa tobregmaan: rostral, −0.8 - −1,1 mm; keskimmäinen, -1,2 - -1,5 mm; ja kaudaalinen, -1,6 - -1,9 mm (Paxinos ja Franklin, 2019). Regionof Interest (ROI) -päällikköä ImageJ:ssä käytettiin sitten jakamaan theaBLA sen dorsalis-ventraal- ja mediaal-lateralia kvadrantteja pitkin suhteessa sen kehään. Tätä mallia sovellettiin myöhemmin allikuviin kullakin määritellyllä rostral-caudaal-ala-alueella.

aBLAperimeter-rajoja käytettiin ImageJ EzColocalization -laajennuksen kanssa luomaan 2-D-tilakaavio kaikista hermosolujen määrästä kussakin kuvassa. Spatiaaliset alueet rostral-, keski- ja kaudaalisten osa-alueiden sisällä asetettiin sitten erikseen päällekkäin. Tämä johti 10 pelko- ja 10 kontekstikuvaamiseen rostraaliselle osa-alueelle, 10 pelko- ja 13 kontekstikuvaa keskimmäiselle osa-alueelle ja 12 pelko- ja 13 kontekstikuvaa kaudaaliselle osa-alueelle.

Jos haluat korjata suuremman määrän alialueen kuvakaavioita kontekstiryhmässä, korjauskertoimet 1.0(10/10), 0,77 (10/13) ja 0,92 (12/13) käytettiin vastaavasti kontekstiryhmän rostral-, keski- ja kaudaalisen osa-alueen kuvaajiin. Kontekstidatan laskemien topografisen jakauman vääristymisen välttämiseksi MS Excelin satunnaislukugeneraattoria käytettiin tunnistamaan, mitkä määrät jätetään pois kustakin aBLA-ala-alueesta.

Seuraavaksi jaoimme aBLA-ala-alueet kvadrantteihin, jotka on merkitty numeroilla 1–4 (katso kuva 2D). Tätä varten leikkauskoordinaatti (0,0) määritettiin MS-Excelissä pisteeksi 2-D-tasossa, jossa kunkin kvadrantin pinta-ala oli suunnilleen yhtä kuin neljäsosa. kunkin rostral-caudaalisen osa-alueen kokonaispinta-alasta. Kvadrantin akselit ja jokaisen laskurin xy-koordinaatit määritettiin ja kierrettiin 30◦ myötäpäivään, jolloin ne kohdistettiin aBLA:n anatomiseen akseliin.

Osa-alueiden ja niiden kvadranttien kokojen pienten vaihteluiden huomioon ottamiseksi laskentatiedot normalisoitiin pinta-alaan (määrää/mm2), jotta raportoidut arvot edustavat lukujen tiheyttä osa-aluetta tai kvadranttia kohti.

TRAP2-järjestelmämme vangitsemien hermosolujen eksitatorisen fenotyypin arvioimiseksi kvantitoitiin TRAPed-tdTomato-ekspression samanaikainen lokalisointi kalsium-kalmoduliinista riippuvaisen proteiinikinaasi II:n (CaMKII) kanssa, joka on vakiintunut glutamatergisten neuronien markkeri (McDonald et al., 2002). kuvia vähintään kolmesta aBLA-osuudesta hiirtä kohden käyttämällä ImageJ-solulaskurilaajennusta.

Tilastot

Tilastollinen testaus suoritettiin Prism 9.5.1 -ohjelmistolla (GraphPad, San Diego, CA, USA), ja siihen sisältyi kaikkien tietojoukkojen normaalijakauman testaus Shapiro-Wilk-testillä. Jatkuvien tietojen ryhmävertailu tehtiin kaksisuuntaisella parittomalla opiskelijalla. t-testit tai kaksi- tai kolmisuuntainen ANOVA, jota seuraa Sidakin ja Tukeyn moninkertainen vertailutesti, vastaavasti, parittaisille vertailuille merkittävien ANOVA-vuorovaikutusten jälkeen.

Ryhmän sisäinen korrelaatioanalyysi suoritettiin Pearsonin r-kertoimen ja vastaavan P-arvon määrittämiseksi. Korrelaatioita verrattiin ryhmien välillä käyttäen Fisher'sZ-transformaatiota (lisätaulukko 1). Ryhmätiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin P < 0.05.

Tulokset

Pelon ehdollistaminen saa aikaan kaukopelkomuistin engrammin

Sen selvittämiseksi, missä määrin pelkomuistin muodostumisen aikana aktivoidut aBLA-hermosolut aktivoituvat uudelleen etämuistin muistojen aikana, hiiret kokivat pelkoa (n=5) tai kontekstia (n=5) ehdoin, mitä seurasi 4-OHT-injektio. (Kuvat 1A–C).

Tarkasteltaessa pelkomuistin muodostumista (eli pelon oppimista), havaittiin hoidon (shokki vs. ei shokki) ja aikavälin (30 s intervalli kunkin shokin jälkeen) merkittävää vuorovaikutusta jäätymiskäyttäytymisessä [two-wayANOVA, F(5, 40)=6.733, P=0.0001]. Pelkokäsitellyillä hiirillä oli pidempi jäätymisaika verrattuna lähtötilanteeseen shokin jälkeen (275 ± 68 % BL:stä, P=0.0203), 4 (486 ± 76 % BL:stä, P < 0,0001) ja 5 (402 ± 26) % BL:stä, P < 0,0001) ja suhteessa kontekstiin ehdittyihin hiiriin sokin jälkeen 4 (251 ± 38 % kontekstista, p < 0,0001) ja 5 (375 ± 25 % kontekstista, p < 0,0001).

Kuten odotettiin, uudelleenaltistuminen ehdollistamiskammioon etämuistin palauttamista varten 21. päivänä hoidon jälkeinen hoito paljasti, että pelossa ehdollistuneet hiiret käyttivät huomattavasti enemmän aikaa jäätymiseen verrattuna kontekstikontrolliin[346 ± 18%, pariton t-testi, t(8) {{7} }.16, P < 0.0001] (kuva 1D).
Yhdessä kuvan 1 tiedot osoittavat, että pelkokäsittelyprotokollamme aiheutti vahvan pelkomuistin muodostumisen ja etäisen pelkomuistin palauttamisen.

Pelkooppiminen saa aikaan vankan ala-aluekohtaisen aBLA:n yhtyeelle

TRAPed- (tdTomato +) -määrien analyysi paljasti huomattavasti suuremman fos-aktivoidun aBLA-populaation pelkoehdollisissa (110 ± 6,2) kuin kontekstiehdollisissa (77 ± 3,1) hiirissä [pariton t-testi, t(8)=4 .782, P=0.0014] (taulukko 1). Kuten odotettiin, noin 70 % kontekstin ja ∼ 80 % pelon TRAPoiduista neuroneista (n=6 aBLA-leikkauksia/ryhmä) oli CaMKII + (lisäkuvat 1A, B), mikä osoittaa, että ne olivat ensisijaisesti glutamatergisiä projektiohermosoluja.

Samoin kuin aikaisemmissa raporteissa (Kim et al., 2016), jaoimme theaBLA:n kolmeen rostrokaudaaliseen osa-alueeseen: rostrokaudaaliseen, keski- ja kaudaaliseen osa-alueeseen (kuvat 2A–C) ja vertasimme TRAPed-lukutiheyksiä (lukumäärää/mm2) eri osa-alueilla ja hoitoryhmien välillä (kuva 2D). Kaksisuuntainen ANOVA paljasti merkittävän vuorovaikutuksen osa-alueen ja hoidon välillä [F(2,24)=7.7099,P=0.0038].

Ryhmän sisäiset analyysit paljastivat, että TRAPed-määrä oli suurempi keskimmäisellä aBLA-ala-alueella pelko- (239 ± 9) ja kontekstiryhmissä (144 ± 12) verrattuna rostraaliin (pelko: 86 ± 6,P < { {8}}.0001; konteksti: 81 ± 9, P=0.0035) ja kaudaalinen (pelko:123 ± 15, P < 0,0001; konteksti: 90 ± 12, P {{20 }}.0132) osa-alueet.

Ryhmien välinen analyysi paljasti, että TRAPed-määrän tiheys oli merkittävästi suurempi pelkoehdollisten hiirten keskialueella (P < 0,0001).

TRAPed-hermosolujen sijainnin määrittelemiseksi tarkemmin jaoimme rostral-, keski- ja kaudaaliset aBLA-ala-alueet neljään kvadranttiin (kuva 2E). Keskimmäisellä osa-alueella havaittiin tärkein hoidon vaikutus laskentatiheyteen [kolmisuuntainen ANOVA, F(1,32)=17.44, P=0.0002] ja suurempi TRAPedcount-tiheys pelossa kuin kontekstiryhmässä kvadranteissa 3 (218 ± 29 vs. 107 ± 17, P=0,0031) ja 4 (240 ± 16 vs. 101 ± 12, P < 0,0001).

Arvioimme edelleen ryhmän sisällä ja kvadrantin sisällä TRAPed-lukutiheyksiä aBLA-ala-alueilla (kuva 2E ja lisätaulukko 2). Varsinkin, kun verrataan rostraaliseen osa-alueeseen (59 ± 8), pelkoryhmän neljännellä 2 oli suurempi TRAPed-tiheys sekä keskellä (245 ± 21, P < 0.0001) että kaudaalissa (172 ± 23, P=0.0040) osa-alue.

Seuraavaksi arvioimme jäätymiskäyttäytymisen ja TRAPed-hermosoluryhmän koon välistä suhdetta koko aBLA:ssa, sen keskiosassa ja keski- ja kaudaalisten osa-alueiden kvadranteissa, joissa ryhmien lukumäärätiheydet vaihtelivat kontekstin ja pelon ehdollistettujen ryhmien välillä. Merkittäviä korrelaatioita ei havaittu pelko- tai kontekstiryhmässä (kuvio 2F), mikä viittaa siihen, että pelkokäyttäytyminen ei heijasta pelon oppimisen fosensemblen kokoa aBLA-ala-alueilla.

Yhteenvetona kuvion 2 havainnot osoittavat, että pelko ehdollistaminen johti suurempaan fos-ryhmään aBLA:ssa kuin kontekstiehdoittaminen. Ensemble neuronit olivat tiheimmin lokalisoituneet keskimmäiselle aBLA-ala-alueelle, mutta pelkokäyttäytyminen ei korreloi yhtyeen populaation kokojen kanssa.

For more information:1950477648nn@gmail.com