Cistanches Herban kemiallinen ja geneettinen erottelu UPLC-QTOF/MS- ja DNA-viivakoodauksen perusteella

Ota yhteyttä: emily.li@wecistanche.com

Sihao Zheng, Xue Jiang, Labin Wu, Zenghui Wang ja Linfang Huang *

Abstrakti

CistanchesHerballa (Rou Cong Rong), joka tunnetaan nimellä "Aavikon ginseng", on silmiinpistävä parantava vaikutus vahvuuteen ja ravintoon, erityisesti munuaisten vahvistamisessa yangin vahvistamiseksi. Kuitenkin Cistanches Herban kaksi kasviperää,Cistanche deserticolajaCistanche tubulosa, vaihtelevat farmakologisen vaikutuksen jakemiallinenkomponentit. Syrjittää kasvien alkuperääCistanchesHerba, yhdistetty menetelmäjärjestelmäkemiallinenjageneettinen–UPLC-QTOF/MS-teknologiaa ja DNA-viivakoodausta – tässä tutkimuksessa käytettiin ensin. Tulokset osoittivat, että saatiin kolme mahdollista merkkiyhdistettä (kampneosidi II:n, cistanosidi C:n ja cistanosidi A:n isomeeri) näiden kahden alkuperän erottamiseksi PCA- ja OPLS-DA-analyyseillä. DNA-viivakoodaus mahdollisti kahden alkuperän erottamisen tarkasti. NJ-puu osoitti, että kaksi alkuperää ryhmittyi kahdeksi kladiksi. Tuloksemme osoittavat, että kaksi alkuperääCistanchesHerballa on erilaisiakemiallinensävellyksiä jageneettinenmuunnelmat. Tämä on ensimmäinen raportoitu arvio kahdesta alkuperästäCistanches Herba, ja löydös helpottaa laadunvalvontaa ja sen kliinistä käyttöä.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja Cistanchesta

Johdanto

CistanchesHerba (Rou Cong Rong), joka tunnetaan nimellä "Aavikon ginseng", on peräisin kuivatuista mehevistä varreista.Cistanchedeserticola YC Ma ja Cistanche tubulosa (Schrenk) Peruukki Kiinan farmakopean (2010 painos) mukaan, ja se on suosittu munuais-yinin virkistävän, elinvoimaisen olemuksen ja suoliston rentouttavan ansiosta. Tällä hetkellä Cistanches Herbaa esiintyy pääasiassa kuivilla ja lämpimillä aavikoilla Luoteis-Kiinassa, erityisesti Xinjiangin ja Sisä-Mongolian maakunnissa. Cistanches Herban kaksi alkuperää eroavat kuitenkin toisistaan ​​farmakologisen vaikutuksensa jakemiallinenkomponentit. Tu et ai. tutki kolmen keittämistäCistanchelajit (C. deserticola, C. tubulosa, Cistanche salsa) ja havaitsivat, että C. tubulosa osoitti alhaisimman vaikutuksen Yang-puutoshiirimallissa [1]. Zhang et ai. vertaili farmakologista aktiivisuutta C. deserticolan, C. tubulosan ja C. salsan välillä ja havaitsi, että näillä lajilla oli lääkinnällisiä tehtäviä, kuten väsymystä ja hypoksian sietokyky, mutta ei samassa määrin [2]. Aiemmat tutkimukset kertoivatkemiallinenkomponentti ja ilmaisi eronkemiallinenkasviperäisten komponenttien ja sisältöjen osaltaCistanchesHerba [3]. Mitä tulee kliiniseen käyttöön ja markkinoiden liikkeeseen, tonicina C. tubulosaa on perinteisesti käytetty verenkiertoa edistävänä aineena ja Japanissa impotenssin, hedelmällisyyden, lumbagon ja kehon heikkouden hoidossa [4]–[8].

Näin ollen on erittäin tärkeää erottaa kaksi alkuperääCistanchesHerba laadunvalvontaan ja kliiniseen käyttöön. Tutkimuksessa ei kuitenkaan keskity Cistanches Herban kahden alkuperän syrjintään. Cistanches-suvun tunnistamiseen on käytetty monia tutkittuja menetelmiä, mukaan lukien mikroskopia, ultravioletti- ja infrapunatunnistus, yksinkertaisten sekvenssitoistojen menetelmä, mutta ei vain kahdessa alkuperässä, erityisesti [9]–[20]. Tässä käytimme yhdessäkemiallinenja molekyylitekniikat kahden alkuperän erottamiseksiCistanchesHerba, UPLC-QTOF/MS (ultra-suorituskykyinen nestekromatografia yhdistettynä kvadrupolin lentoajan massaspektrometriaan) ja DNA-viivakoodaus. UPLC-QTOF/MS tarjoaa tietoa nopeammin ja tehokkaammin muihin tekniikoihin verrattuna. UPLC-QTOF/MS:n korkea selektiivisyys ja herkkyys ovat johtaneet sen soveltamiseen sekä kvantitatiivisiin että kvalitatiivisiin analyyseihin sekä metaboliittianalyysiin ja monimutkaisten yhdisteiden tunnistamiseen perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä [21]–[22]. Pääkomponenttianalyysi (PCA) ja ortogonaalinen projektio latenttiin rakennediskriminanttianalyysiin (OPLSDA) kehitetään myös mahdollisten merkkiyhdisteiden tunnistamiseksi. DNA-viivakoodaus, helpompi ja yleisempi molekyylimarkkeritekniikka, käyttää DNA-fragmenttia lajien tai sukujen tunnistamiseen. Se on objektiivinen, tarkempi ja helpompi suorittaa kuin perinteiset tunnistusmenetelmät ja muut molekyylimarkkeritekniikat. Lisäksi DNA-viivakoodausta on käytetty menestyksekkäästi eläinten ja kasvien, mukaan lukien lääkekasvien, tunnistamiseen [23]–[26].

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on luoda tieteellinen menetelmäjärjestelmä, yhdistetty UPLC-QTOF/MS ja DNA-viivakoodaus, kahden kasviperäisen alkuperän erottamiseen.CistanchesHerba.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen lausunto

Vahvistamme, että kenttätutkimukset eivät koskeneet uhanalaisia ​​tai suojeltuja lajeja. GPS-koordinaatit on sisällytetty esimerkkitietoihin, katso taulukko 1."

Taulukko 1 NäytteitäCistanchedeserticola ja Cistanche tubulosa.

WLMQ tarkoitti Wu Lu Mu Qin kaupunkia; GJH tarkoitti Gan Jia Hua; HBKSEMG tarkoitti Hoboksarin Mongolien autonomista piirikuntaa; KLMY tarkoitti Ke La Ma Yin kaupunkia; BDJLSM tarkoitti Badain Jaranin autiomaa; ALSZQ tarkoitti Alxa vasenta lippua; DSX tarkoitti Dong Sanin maakuntaa; CL tarkoitti Ce Le Countya; MF tarkoitti Min Feng County; HT tarkoitti He Tianin piirikuntaa.

Kasvimateriaalit ja reagenssit

Mehevä varretCistanchesHerbaa kerättiin sisä-Mongolian Qinghain provinssien Xinjiang Uygurin autonomisen alueen Kiinan kansantasavallasta (taulukko 1) toukokuussa 2012. Tutkimuksen näytteet kerättiin villiltä autiomaa-alueelta, ei yksityiseltä maalta. joissa ei vaadittu erityisiä lupia. Tohtori Linfang Huang vahvisti varsien kasvitieteelliset identiteetit. Lahjakorttinäytteet talletettiin The Institute of Medicinal Plant Developmentiin. UPLC-analyysissä käytettiin korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) -laatuista asetonitriiliä (Merck KGaA, Darmstadt, Saksa) ja muurahaishappoa (Tedia, USA). Deionisoitu vesi puhdistettiin käyttämällä Milli-Q-järjestelmää (Millipore, Bedford, MA, USA). Kaikki muukemikaalitolivat analyyttistä tasoa.

näytteen valmistus

CistanchesHerba-näytteet (1.0 g, 65-verkko) siirrettiin 50-ml erlenmeyerpulloon ja lisättiin 50 ml 70-prosenttista metanolia. 30 minuutin liotuksen jälkeen ultraäänikäsittely (35 kHz) suoritettiin huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Kun oli sentrifugoitu 10, 000 rp/min 10 minuutin ajan, supernatantti säilytettiin 4 asteessa ja suodatettiin 022- μm kalvon läpi ennen injektointia UPLC-QTOF/MS-järjestelmään analysointia varten.

UPLC-QTOF/MS

UPLC-analyysissä käytettiin seuraavia järjestelmiä/parametreja: Waters Acquity -järjestelmä (Waters), joka oli varustettu binäärisellä liuottimen syöttöpumpulla, automaattisella näytteenottimella ja PDA-detektorilla, joka on kytketty Waters Empower 2 -tietoasemaan; ultraäänikäsittely (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, Kiina); ja elektroninen analyyttinen vaakamalli AB135-2 (Mettler-Toledo., Greifensee, Zürich, Sveitsi). Waters Acquity UPLC BEH C18 -kolonnia (1,7 µm, 2,1 × 100 mm, Waters) ja Waters C18 -suojakolonnia (sama materiaali, vedet) käytettiin ja pidettiin 30 asteessa. Liikkuva faasi oli 0,1 % muurahaishapon vesiliuos (A) ja asetonitriili (B) gradienttiohjelmalla seuraavasti: 0-3 min, 10-22 % B; 3–4 min, 22–23 prosenttia B; 4–6 min, 23–35 prosenttia B; 6–8 min, 35–37 prosenttia B; 8–11 min, 37–42 prosenttia B; 11–12 min, 42–48 prosenttia B; 12–15 min, 48–50 prosenttia B virtausnopeudella 0,3 ml/min. Injektiotilavuus oli 5 ui.

UPLC/MS-analyysi suoritettiin QTOF Synapt G2 HDMS -järjestelmällä (Waters, Manchester, UK), joka oli varustettu sähkösumutusionisaatiolähteellä (ESI), joka toimi negatiivisen ionin tilassa. N2:ta käytettiin desolvatointikaasuna. Desolvataatiolämpötilaksi asetettiin 45{{10}} astetta virtausnopeudella 800 l/h ja lähdelämpötilaksi 120 astetta. Kapillaari- ja kartiojännitteet asetettiin vastaavasti 2500 ja 40 V:iin. Tiedot kerättiin välillä 50–1200 Da 0.{11}} s skannausajalla ja 0.{13}} s skannausten välisellä viiveellä 15-min analyysiajalla. Törmäyskaasuna käytettiin argonia 7,06661023 Pa:n paineessa. Kaikki MS-tiedot kerättiin käyttämällä LockSpray-järjestelmää massan tarkkuuden ja toistettavuuden varmistamiseksi. Leusiinienkefaliinin [MH]-ionia m/z:ssä 554,2615 käytettiin lukitusmassana negatiivisessa ESI-moodissa.

UPLC-QTOF/MS-tiedot kohteelleCistanchesHerba-näytteet analysoitiin mahdollisten erottelevien muuttujien tunnistamiseksi. ES-raakatietojen huippujen löytäminen, kohdistus ja suodatus suoritettiin käyttämällä Marker Lynx -sovellusten hallintaohjelmaa, versiota 4.1 (Waters, Manchester, UK). Käytetyt parametrit olivat seuraavat: retentioaika (tR) 0–15 min, massa 50-1200 Da, retentioajan toleranssi 0,02 min ja massa toleranssi 0,02 Da. Käytettiin kolmea rinnakkaisnäytettä jokaisesta maantieteellisestä sijainnista (n = 3). Mallin luomiseen käytettiin yhteensä 6 339 muuttujaa.

DNA:n viivakoodaus: DNA:n uutto, PCR-monistus ja sekvensointi

Näytteitä, jotka oli otettu kuivatuista, mehevistä C. deserticolan ja C. tubulosan (30 mg) varresta, hierottiin 2 minuutin ajan taajuudella 30 r/s. DNA uutettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Tangen). Erityisesti protokollaa muutettiin siten, että kloroformi korvattiin seoksella, jossa oli kloroformia: isoamyylialkoholia (24 x 1 samassa tilavuudessa) ja puskuriliuosta GP2 isopropanolilla (sama tilavuus). Hierottu jauhe laitettiin 1,5 ml:n eppendorf-putkiin, lisättiin 700 µl 65 astetta esilämmitettyä GP1:tä ja 1 µl -merkaptoetanolia sekoitukseen vorteksilla 10-20 s ja inkuboitiin 60 minuuttia 65 asteessa; Lisätään 700 ui seosta kloroformia:isoamyylialkoholia (24∶1), sentrifugoidaan 5 minuuttia nopeudella 12000 rpm (-13400xg); Pipetoi supernatantti uuteen putkeen, lisää 700 µL isopropanolia, sekoita 15–20 minuuttia; Putkitaan kaikki seos spinkolonniin CB3 ja sentrifugoidaan 40 s nopeudella 12000 rpm; Hävitä suodos ja lisää 500 µl GD:tä (lisäämällä kvantitatiivista vedetöntä etanolia ennen käyttöä), sentrifugoi nopeudella 12 000 rpm 40 s; heitetään pois suodos ja lisätään 700 ui PW (lisätään kvantitatiivista vedetöntä etanolia ennen käyttöä) kalvon pesemiseksi, sentrifugoidaan 40 s 12 000 rpm:llä; Suodos heitetään pois ja lisätään 500 µl PW, sentrifugoidaan 40 s nopeudella 12 000 rpm; Suodos heitetään pois ja sentrifugoidaan 2 minuuttia nopeudella 12 000 rpm jäljellä olevan pesupuskurin PW poistamiseksi; Siirretään linkouskolonni CB3 puhtaaseen 1,5 ml:n eppendorf-putkeen ja kuivataan huoneenlämmössä 3–5 minuuttia; Sentrifugoi 2 minuuttia nopeudella 12 000 rpm saadaksesi kokonais-DNA:n. Polymeraasiketjureaktion (PCR) alukkeet perustuivat aiemmin raportoituihin sekvensseihin [4], [5]. PCR-reaktioseokset sisälsivät 2-μL DNA-templaattia, 8.{51}}μL ddH2O, 12.5-μL 2× Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Kiina), 1/{ {57}}μL eteenpäin/käänteisiä (F/R) alukkeita (2,5 µM), lopullisessa tilavuudessa 25 µL. PCR-monistus suoritettiin julkaisussa Kress et ai. [4]. PCR-reaktion alukkeet olivat fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (5′-3′) ja rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (5′-3′). PCR-tuotteet erotettiin ja havaittiin 1-prosenttisella agaroosigeelielektroforeesilla. PCR-tuotteet puhdistettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti ja alistettiin suoraan sekvensoinnille.

Sekvenssikohdistus ja -analyysi

ITS- ja ITS2-sekvenssit kerättiin GenBank-tietokannasta. Näytteiden sekvensoinnin sekvenssit lähetettiin GenBank-tietokantaan (liityntänumerot lueteltiin taulukossa 1), koottiin CodonCode Aligner 3.7.1:llä (CodonCode Co., USA) ja kohdistettiin ClustalW:llä. Kimura 2-Parametrien (K2P) etäisyydet, pohjan GC-sisältö ja naapuriliitospuut (NJ) laskettiin ja muodostettiin MEGA 5.05:llä Bootstrap-menetelmällä (1000 uudelleennäytteenotto) ja K2P-mallilla [27]. Viivakoodirako (välikealue, joka muodostui sisäisen ja interspesifisen väliingeneettinenvariaatiot) ja tunnistustehokkuus (tunnistuskyky eri viivakoodien vertailuun) piirrettiin ja laskettiin Meyerin ja Paulayn [28] raportoiman menetelmän perusteella.

Tulokset

Alustava huipun määritys UPLC-QTOF/MS:n toimesta

C. deserticolan ja C. tubulosan edustavat kromatogrammit eri tuotantoalueilta on esitetty kuvassa 1. Sormenjälkikromatogrammi osoitti samankaltaisuuksiaCistanchesHerba näytteitä. Yhteensä 23 hyväksyttyä massahuippua havaittiin ja 16 huippua tunnistettiin sovittamalla retentioajat ja massaspektrit aiemmin raportoituihin (taulukko 2) [29]–[35]. Piikit 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 ja 23 tunnistettiin alustavasti sistanosidiksi F, mussaenosidihapoksi, cistanbulosidiksi C1/C2, kampneosidi II:ksi. , kampneosidi II:n isomeeri, ekinakosidi, sistanosidi A, akteosidi, isoakteosidi, syringalidi A-3′- -L-ramnopyranosidi, cistanosidi C, 2'-asetyylilakteosidi, osmantusidi B, sistanosidi D, ja tubulcistosidi B cistancinensidi A.Kemiallinenaineosien määritettiin olevan ensisijaisesti fenyylietanoidiglykosideja (PhG), kun taas yksi yhdiste, mussaenosidihappo, oli iridoidipolysakkaridi. PhG:t ovat tärkeimmät aktiiviset yhdisteet munuaisten vajaatoiminnan hoidossa sekä antioksidanttisissa ja hermostoa suojaavissa vaikutuksissa [36].

Kuva 1 C. deserticolan ja C. tubulosan edustavat kromatogrammit.

Vasemmalla puolella oli C. deserticolan kromatogrammit, jotka oli kerätty eri paikoista; oikealla puolella oli C. tubulosan kromatogrammit, jotka oli kerätty eri paikoista. Tämä kuva näyttää erot näiden kahden alkuperän välilläkemiallinenprofiilit.

Taulukko 2 Alustavasti tunnistetut yhdisteet C. deserticolasta ja C. tubulosasta.

C. deserticolan ja C. tubulosan PCA

PCA:ta käytettiin eri kasvilajien näytteiden erottamiseen. PCA on valvomaton monimuuttuja-analyysimenetelmä, jonka tarkoituksena on visualisoida yhtäläisyydet ja/tai erot sekundaarisen metaboliittikoostumuksen monimuuttujatiedoissa [37]. Kaksikomponenttinen PCA-malli vastasi kumulatiivisesti 46,04 prosenttia vaihtelusta (PC1, 36,43 prosenttia; PC2, 9,61 prosenttia). Kuvio 2 osoittaa, että 24 näytettä ryhmiteltiin kahteen ryhmään PCA-pisteissä, jotka on piirretty lajin alkuperän mukaan, mikä osoittaa, että C. deserticolan ja C. tubulosan kemiallinen koostumus erosi merkittävästi.

Kuvio 2 C. deserticolan ja C. tubulosan PCA.

Nämä näytteet ryhmiteltiin kahteen ryhmään lajin alkuperän mukaan, mikä osoitti, että C. deserticolan ja C. tubulosan kemiallinen koostumus oli merkittävästi erilainen.

OPLS-DA ja merkin tunnistus

Potentiaalin tunnistamiseksikemiallinenMerkkejä näiden kahden lajin erottamiseksi luotiin OPLS-DA:n S-kuvaaja (kuvio 3). S-kaaviossa jokainen piste edustaa yhtä tR–m/z-ioniparia. X- ja Y-akselit edustavat vastaavasti ionin panosta ja luottamusta; mitä kauempana ioni t R–m/z -pari osoittaa nollasta, sitä suurempi on tämän ionin osuus/luottamus näiden kahden ryhmän väliseen eroon. Siten tR-m/z-ioni, joka osoittaa 'S':n kahteen päähän, edustaa ominaismarkkereita, joilla on suurin luottamus kussakin ryhmässä.

Kuvio 3 C. deserticolan ja C. tubulosan OPLS-DA (S-kuvaaja).

Yksi käyrä edustaa yhtä tR–m/z-ioniparia. Nämä neliön tontit olivatkemiallinenmerkki-ionien havaittiin erottavan kaksi alkuperää. Kolmannen kvadrantin neliömäiset käyrät olivat kemiallisia merkki-ioneja, joilla oli suurempi osuus ja luottamus C. deserticolaan, ja ensimmäisen neljänneksen neliökäyrät olivat kemiallisia markkeri-ioneja, joilla oli suurempi osuus ja luottamus C. tubulosaan.

OPLS-DA-tulokset osoittivat, että UPLC-QTOF/MS:ää voitiin käyttää erottamaan C.deserticolaalkaen C.tubulosa(Kuva 3). Näiden ryhmien syrjinnän helpottamiseksi määritettiin yhteensä kuusi uskottavaa ja merkittävää merkkiä (taulukko 3). Kolmen mahdollisen markkerin identiteetit määritettiin alustavasti. Näiden kolmen ionin kanssa korreloivat komponentit tunnistettiin alustavasti kampneosidi II:n, cistanosidi C:n ja cistanosidi A:n isomeereiksi. Merkkiyhdisteitä a, b ja c voitiin käyttää näiden kahden kasvilajin erottamiseen a:n ja b:n ioni-intensiteeteinä. in C.deserticolaoli korkeampi kuin C. tubulosassa (kuvio 4A, 4B), ja markkeri c voitiin havaita C. tubulosassa, mutta ei C. deserticolassa (kuvio 4C).

Kuva 4 Markkerien a, b ja c ioni-intensiteetit.

Merkki-ionien a ja b ioni-intensiteetit C. deserticolassa olivat korkeammat kuin C. Tubulosassa, ja markkeri-ioni c voitiin havaita C. tubulosassa, mutta sitä ei voitu havaita C. deserticolassa.

Taulukko 3 Marer tR–m/z ioniparit S-käyrässä.

DNA-viivakoodaus: sekvenssitiedot ja tunnistustehokkuus

Sekvenssitiedot on esitetty taulukossa 4. KeskiarvogeneettinenpsbA-trnH:n etäisyys (0.1732) oli huomattavasti suurempi kuin kaksi muuta aluetta (0.0740, 0,1197). PsbA-trnH:n keskimääräinen GC-pitoisuus (20,64 prosenttia) oli pienempi kuin kahdella muulla alueella (55.00 prosenttia, 55.{13}} prosenttia). Vaikka ITS:n ja ITS2:n onnistumisprosenttia ei saatu tässä tutkimuksessa, psbA-trnH-alue suoriutui hyvin PCR-monistuksessa ja sekvensoinnissa (100 prosenttia, 87,23 prosenttia). Tunnistustehokkuus saavutettiin BLAST1-analyysillä ja lähimmän etäisyyden menetelmällä, ja se heijasti pääasiassa viivakoodien onnistumisastetta. psbA-trnH-alue oli selvästi korkeampi kuin kaksi muuta viivakoodia tunnistustehokkuudessa kahdella menetelmällä. Sekvenssien puute on todennäköisimmin syynä siihen, että ITS-alue osoitti 100 prosentin tunnistustehokkuutta BLAST1-menetelmällä ja 0 lähimmän etäisyyden menetelmällä.

Taulukko 4 Kolmen lokuksen tunnistustehokkuus eri menetelmillä lajien tunnistamiseen.

Geneettisen eron analyysi kuudella parametrilla

Kuuden parametrin avulla analysoitiin spesifistä vaihtelua ja lajien välistä eroa kolmella viivakoodilla (taulukko 5). Merkittävä ero spesifisten ja spesifisten variaatioiden välillä oli osoitus DNA-viivakoodien hyödyllisyydestä. Tässä kolmen viivakoodin pienin lajien välinen etäisyys oli korkeampi kuin lajinsisäinen enimmäisetäisyys. Lisäksi psbA-trnH-alueella oli suurempi maksimaalinen spesifinen etäisyys ja keskimääräinen lajien välinen etäisyys kuin kahdella muulla viivakoodilla, mikä osoittaa, että psbA-trnH-alue suoriutui hyvin kahden alkuperän erottelussa.CistanchesHerba.

Taulukko 5 Kolmen viivakoodin sukujen välisen eron ja spesifisen vaihtelun analyysi.

Viivakoodiraon analyysi C. deserticolan ja C. tubulosan tunnistamiseksi

Viivakoodirako esittelee lajien välisten ja sisäisten lajien huomattavan vaihtelun ja osoittaa erilliset, ei-päällekkäiset jakaumat sisäisten ja lajien välisten näytteiden välillä. Tässä tutkimuksessa (kuva 5) etäisyysalueeksi asetettiin 0–0,45, koska psbA-trnH:n suurin K2P-etäisyys C. deserticolan ja C. tubulosan välillä oli lähellä { {11}}.45. Kolmessa viivakoodissa oli selviä aukkoja spesifisten ja spesifisten vaihteluiden jakaumissa. Lisäksi psbA-trnH:n aukko oli huomattavasti suurempi kuin kaksi muuta viivakoodia. Siksi psbA-trnH-alue voisi olla ihanteellinen viivakoodi kahden alkuperän erottamiseenCistanchesHerba.

Kuva 5 Spesifisten erojen ja spesifisen vaihtelun suhteellinen jakautuminen kolmessa viivakoodissa.

Kolme ITS2:n, ITS:n, psbA-trnH:n viivakoodia analysoitiin C. deserticolan ja C. tubulosan välisen spesifisten erojen ja spesifisten vaihtelujen suhteellisen jakautumisen suhteen K2P:n perusteella.geneettinenetäisyys.

Neighbor-joining (NJ) puu

NJ-puu havainnollistaa lajien välistä suhdetta ja helpottaa niiden klusteroinnin määrittämistä. Tässä tutkimuksessa kolmen viivakoodin NJ-puu rakennettiin K2P-mallin pohjalta (kuva 6). Tulokset osoittivat, että kaksi alkuperääCistanchesHerba ryhmittyi kahteen kladiin erikseen. Näin ollen NJ-puu erotti selvästi toisistaanC. deserticola ja C. tubulosa.

Kuva 6 C. deserticolan ja C. tubulosan NJ-puu kolmella viivakoodilla.

C. deserticolan ja C. tubulosan NJ-puu rakennettiin kolmella viivakoodilla. Bootstrap-pisteet (1000 toistoa) näytetään (suurempi tai yhtä suuri kuin 50 prosenttia) jokaiselle haaralle. C. deserticola ja C. tubulosa ryhmittyivät selvästi kahteen kladiin.

Keskustelu ja johtopäätökset

CistanchesHerba on tärkeä lääkeaine, jota käytetään yleisesti aasialaisen yhteisön ravitsemiseen [38]. Cistanches Herban kahdella alkuperällä, C. deserticolalla ja C. tubulosalla, on kuitenkin erilaiset kemialliset koostumukset ja vastaavasti farmakologiset aktiivisuudet. Samanaikaisesti nämä kaksi alkuperää eroavat kliinisen sovelluksen ja hyödykemarkkinoiden osalta. LuokitteluCistancheon hämmentynyt ja massiiviset korvikkeet ja hajotusaineet tulvii markkinoille Cistanches Herban resurssien ja erityisen kasvuympäristön vuoksi. Cistanche-sukuun hyväksytään neljä lajia ja yksi muunnos: C. deserticola, C. tubulosa, C. Sinensis, C. salsa ja C. salsa var. albiflora [39]. Japanilaiset tutkijat pitivät Cistanches Herban alkuperää C. salsana [40]–[43], kun taas Tu [44]–[46] tunnisti sen C. deserticolaksi. Siksi se on hämmentynyt Cistanchen luokituksessa, ja Cistanches Herban kahta alkuperää on vaikea erottaa toisistaan.

Perinteiset menetelmät laadunvalvontaanCistanchesHerba ovat morfologinen tunnistus [47], [48], mikroskooppinen tunnistus [49] ja TLC (ohutkerroskromatografia) [50], [51], FTIR (Fourier-muunnos infrapunaspektroskopia) [14], HPLC (High Performance Liquid Chromatography). ) [52], [53]. Morfologisilla ja mikroskooppisilla menetelmillä voidaan helposti erottaa lajit eri suvuista tai perheistä, joilla on suuria eroja morfologisissa ja mikroskooppisissa ominaisuuksissa, kun taas sisaruslajeja on vaikea erottaa. TLC ja FTIR voivat selvästi erottaa lajit, joilla on erilaisia ​​kemiallisia koostumuksia, kun taas on vaikea määrittääkemiallinenkomponentti ja sisältö. HPLC:tä käytetään pääasiassa erilaisten lajien erottamiseenkemiallinenElementtien sisällöstä huolimatta analyysiaika on pidempi ja herkkyys suhteellisen alhaisempi verrattuna UPLC:hen. Vastaavasti UPLC-QTOF/MS-teknologia oli nopeampi ja tarkempi kemiallisen koostumuksen määrittämisessä kuin muut kemialliset menetelmät. Molekyylitunnistusmenetelmät osoittavat hyvin erottelukykyägeneettinenvaihtelut, kuten SDS-PAGE (natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi) [54], AFLP (amplified Fragment Length Polymorphism) [55], [56]. Näitä molekyylimenetelmiä ei kuitenkaan ole helppo käyttää, eivätkä ne ole universaaleja. Vastaavasti DNA-viivakoodaus voisi erottaa lajit yleisemmin, nopeammin ja tarkemmin kuin muut molekyylimenetelmät. Saman suvun ja läheisille lajeillegeneettinenNämä menetelmät eivät yksinään välttämättä toimi hyvin tunnistamisessa. Tässä yhdistimme UPLC-QTOF/MS- ja DNA-viivakoodauksen C. deserticolan ja C. tubulosan tunnistamiseen ja arvioimme kemiallisia ja molekyylimarkkereita, jotka mahdollistaisivat niiden syrjinnän. 23 hyväksyttyä massahuippua havaittiin ja 16 tunnistettiin käyttämällä UPLC-QTOF/MS-menetelmää, ja ensin havaittiin kolmen potentiaalisen markkeriyhdisteen helpottavan kahden alkuperän erottamista PCA- ja OPLS-DA-analyysillä. Lisäksi DNA-viivakoodaustekniikalla arvioitiin neljä indikaattoria niiden kyvyn perusteella erottaa kaksi alkuperää: tunnistustehokkuus, geneettinen tehokkuus, viivakoodausaukko ja NJ-puuanalyysi. psbA-trnH-aluetta tuettiin sopivana DNA-viivakoodina C. deserticolan ja C. tubulosan erottamiseen.

Lopuksi loimme ensin uuden molekyylin jakemiallinenanalyysi-yhdistetty menetelmä erotteluun ja laadunvalvontaan kahdesta syystäCistanchesHerba. DNA-viivakoodaus voi erottaa kaksi alkuperäägeneettinenvarioida ja tunnistaa lajeja yleisesti ja tarkasti; UPLC-QTOF/MS-teknologia pystyy analysoimaan kemiallisen koostumuksen ja arvioimaan lääkemateriaalien laadun nopeasti ja tarkasti. Yhdistetty DNA-viivakoodausmenetelmä ja UPLC-QTOF/MS-teknologia takaavat useiden lääkeainelähteiden tunnistamisen tarkemmin ja tieteellisemmin ja voivat toimia menetelmänä muiden luokituksen hämmentäviä lajeja tai sukuja varten.

Rahoitusselvitys

Tutkimusta tuki Kiinan National Natural Science Foundationin (nro 81274013, verkkosivusto: www.nsfc.gov.cn) apurahoilla. Rahoittajalla ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelussa, tiedonkeruussa ja analysoinnissa, julkaisupäätöksessä tai käsikirjoituksen valmistelussa.

Viitteet

1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY, et ai. (1996) Vertailu kolmen eri yrttilajin munuaisten ravitsemiseen ja yangin tehokkuuden vahvistamiseenetäisyydet. Journal of Chinese medical materials 19: 420–421. [Google tutkija]

2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) Vertailu kolmen eri lajin yrttisistansien munuaisia ​​ravitseviin ja yang vahvistaviin toimintoihin. China Journal of Chinese Materia Medica 19: 169–171. [PubMed] [Google Scholar]

3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Edistyminen tutkimuksessakemiallinenkasvien ainesosatCistancheHoffing. et Link. Chinese Traditional and Herbal Drugs 34: 473-476. [Google tutkija]

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, et ai. (2006) Cistanche tubulosasta peräisin olevat fenyylietanoidioligoglykosidit ja asyloidut oligosokerit, joilla on vasorelaksanttiaktiivisuutta. Bioorg Med Chem 14: 7468-7475. [PubMed] [Google Scholar]

5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ, et ai. (2009) Cistanche tubulosa -uutteen, perinteisen kiinalaisen raakalääkkeen, hypokolesteroleemiset vaikutukset hiirillä. Am J Chin Med 37: 1125-1138. [PubMed] [Google Scholar]

6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, et ai. (2010) Estovaikutus akteosidin eristettyCistanchetubulosa päälläkemiallinenvälittäjän vapautuminen ja RBL{0}}H3- ja KU812-solujen tulehduksellinen sytokiinituotanto. Planta Med, 1512–1518. [PubMed]

7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et ai. (2010) Asyloidut fenyylietanolioligoglykosidit, joilla on hepatosuojaavaa vaikutusta aavikkokasvistaCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 18: 1882-1890. [PubMed] [Google Scholar]

8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, et ai. (2010) Cistanche tubulosasta peräisin olevat iridoidiset ja asykliset monoterpeeniglykosidit, kankanosidit L, M, N, O ja P. Chem Pharm Bull (Tokio) 58: 1403–1407. [PubMed] [Google Scholar]

9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) Tunnistaminen ja tutkimus kaupallisen raakalääkkeen herba cistanchis. Journal of Chinese medical materials 20: 117–122. [PubMed] [Google Scholar]

10. Zhu SY (2001) Cistanche tubulosan farmakognostinen tunnistus, sekava lajiCistanchedeserticola. Journal of Chinese medical materials 24: 24–25. [PubMed] [Google Scholar]

11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, et ai. (2013) Kolmen yrttisäiliön mikroskooppinen tunnistaminen Xin Jiangissa. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883. [Google tutkija]

12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Kaupallisten Herba Cistanchesin mikroskooppinen tunnistaminen digitaalisella kuvantamistekniikalla. Journal of Chinese medical materials 27: 400–402. [PubMed] [Google Scholar]

13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Tutkimus yrtin tunnistamisestavesisäiliötja aviorikoksesta. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318. [Google tutkija]

14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN, et ai. (2010) FTIR- ja 2D-IR-spektroskooppiset tutkimukset eri yrttilähteistävesisäiliöt. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900. [PubMed] [Google Scholar]

15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J, et ai. (2009) Boschniakla rossica- ja Cynomorium songaricum -lajin Cistanche deserticolan tunnistaminen FTIR- ja kaksiulotteisen korrelaatio-IR-spektroskopian avulla. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507. [PubMed] [Google Scholar]

16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008) Tutkimus HPLC-sormenjäljestäCistanchedeserticola. Pharm Care & Res 8: 255–257. [Google tutkija]

17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) Cistanche deserticolan kromatografinen sormenjälki HPLC:llä. Kiinan perinteiset ja yrttilääkkeet 36: 268–271. [Google tutkija]

18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J, et ai. (2010) TunnistusCistanchelajit (Orobanchaceae), jotka perustuvat plastidin psbA-trnH intergeenisen alueen sekvensseihin. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130. [PubMed] [Google Scholar]

19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) Identification of Cistanche Species byKemiallinenja Inter-Simple Sequence Repeat Fingerprinting. Biol. Pharm. Sonni. 32: 142-146. [PubMed] [Google Scholar]

20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W, et ai. (2012) Fenyylietanoidiglykosidien rakenteellinen karakterisointi ja tunnistaminenCistanchesdeserticola YC Ma, UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Fytokemiallinen analyysi 23: 668-676. [PubMed] [Google Scholar]

21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS Alkaloids-analyysi perinteisessä prosessoidussa Coptis Chinensis Franchissa. Evid Based Complement Alternat Med 2012: 942384. [PMC:n ilmainen artikkeli] [PubMed] [Google Scholar]

22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013) Prosessointiteknologian tutkimus Loquat (Eriobotrya japonica) Leaf ultra-Performance Liquid Chromatography - Quadrupole Time-of-Flight massaspektrometria yhdistettynä Chemometrics. PLoS ONE 8: e64178. [PMC-ilmainen artikkeli] [PubMed] [Google Scholar]

23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Viivakoodaus eläinten elämää: sytokromi c oksidaasin alayksikön 1 ero lähisukulaisten lajien välillä. Proc. R. Soc. Lontoo. B. 270 Suppl 1S96–99. [PMC-ilmainen artikkeli] [PubMed] [Google Scholar]

24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Biologiset tunnistukset DNA-viivakoodien avulla. Proc Biol Sci., 270 313: 321. [PMC:n ilmainen artikkeli] [PubMed] [Google Scholar]

25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) DNA-viivakoodien käyttö kukkivien kasvien tunnistamiseen. Proc Natl Acad Sci. 102: 8369–8374. [PMC-ilmainen artikkeli] [PubMed] [Google Scholar]

26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, et ai. (2010) ITS2-alueen validointi uudeksi DNA-viivakoodiksi lääkekasvilajien tunnistamiseen. PLoS One 5: e8613. [PMC-ilmainen artikkeli] [PubMed] [Google Scholar]

27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, et ai. (2011) MEGA5: Molecular EvolutionaryGenetiikkaAnalyysi käyttämällä suurimman todennäköisyyden, evolutionaarisen etäisyyden ja maksimaalisen parsimonisuuden menetelmiä. Mol Biol Evol 28: 2731-2739. [PMC-ilmainen artikkeli] [PubMed] [Google Scholar]

28. Meyer CP, Paulay G (2005) DNA-viivakoodaus: virheprosentit kattavaan näytteenottoon perustuvat. PLoS Biol 3: e422. [PMC-ilmainen artikkeli] [PubMed] [Google Scholar]

29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studies on Constituents Cistanchis Herba. IV. Kahden uuden fenyylipropanoidiglykosidin, Cistanosides C ja D, eristäminen ja rakenteet. Chem Pharm Bull 32: 3880-3885. [Google tutkija]

30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on Constituents of Cistanchis Herba. VI. Uuden iridoidiglykosidin, 6-deoksieatalpolin, eristäminen ja rakenteet. Chem Pharm Bull 33: 3645-3650. [Google tutkija]

31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) Differentiation of HerbaCistanchessormenjäljellä korkean suorituskyvyn nestekromatografialla - diodirivitunnistus - massaspektrometria. Journal of Chromatography A 1216: 2156–2162. [PubMed] [Google Scholar]

32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W, et ai. (2012) Cistanches deserticola YC Ma:n fenyylietanoidiglykosidien rakenteellinen karakterisointi ja tunnistaminen UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Phytochem Anal. 23: 668-676. [PubMed] [Google Scholar]

33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC, et ai. (2008) Cistanche deserticolan fenyylietanoidiglykosidien eristäminen ja puhdistus nopealla vastavirtakromatografialla. Food Chemistry 108: 702-710. [PubMed] [Google Scholar]

34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S, et ai. (2013) Kvantitatiivinen analyysiCistanchesHerba käyttää korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa yhdistettynä diodirivitunnistukseen ja korkearesoluutioiseen massaspektrometriaan yhdistettynä kemometrisiin menetelmiin. J Sep Sci 26: 1945–1952. [PubMed] [Google Scholar]

35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on Constituents Cistanchis Herba. V. Kahden uuden fenyylipropanoidiglykosidin, Cistanoside E ja F. Chem Pharm Bull 33: 1452–1457, eristäminen ja rakenteet. [Google tutkija]

36. Jiang Y, Tu PF (2009) Analyys ofkemiallinenCistanche-lajin ainesosat. J Chromatogr A 1216: 1970–1979. [PubMed] [Google Scholar]

37. Massart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) Tieteen ja teknologian tiedonkäsittely. Kemometria: oppikirja.

38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014) Ecotypes ofCistanchedeserticola perustuukemiallinenkoostumus ja molekyyliominaisuudet. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328. [Google tutkija]

39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) yrttisäiliöiden tutkimus ja teollisuuskehitys. Journal of Chinese Medicine 46: 882–887. [Google tutkija]

40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A, et ai. (1987) Uusia fenyylietanoidiglykosideja alkaenCistanchetubulosa (SCHRENK) Koukku. f. I. Chem Pharm Bull 35: 3309-3314. [Google tutkija]

41. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Tutkimukset Cistanchis herba III:n ainesosista. Chem Pharm Bull 32: 3009-3014. [Google tutkija]

42. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Tutkimukset Cistanchis herba IV:n ainesosista. Chem Pharm Bull 32: 3880-3885. [Google tutkija]

43. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Tutkimukset Cistanchis herba VI:n ainesosista. Chem Pharm Bull 33: 3645-3650. [Google tutkija]

44. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T, et ai. (1995) Cistanchis Herban (I) farmakognostiset tutkimukset. Nat Med 49: 383-393. [Google tutkija]

45. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T, et ai. (1995) Cistanchis Herban (II) famakognostiset tutkimukset. Nat Med 49: 394-400. [Google tutkija]

46. ​​Liu XM, Jiang Y, Sun YQ, Xu XW, Tu PF (2011) TutkimuskemiallinenaineosatCistanchedeserticola. Chin Pharm J 46: 1053–1058. [Google tutkija]

47. Gu XY, Wang X (2013) RouCongRongin ja Confused Varitiesin alkuperäisten kasvien tunnistaminen. Western Journal of Traditional Chinese Medicine 26: 17–18. [Google tutkija]

48. Zhang HJ, Ding XF Cistanche deserticolan ja hajotusaineiden tunnistus. Shizhen Medicine and Materia Research, 183.

49. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, et ai. (2013) kolmen erityyppisen Cistanchen mikroskooppinen tunnistustutkimus on peräisin Xinjiangin maakunnasta. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883. [Google tutkija]

50. Huang M, Liu G (2004) Identification research ofCistanchedeserticola ja Cynomorium songaricum. HuBei perinteisen kiinalaisen lääketieteen lehti. 26: 54–55. [Google tutkija]

51. Liu YG, Xu R, Wang W, Liu TN, Chen J (2009) Tutkimuksen edistyminen Cistanche deserticola YC Ma:n laadunvalvonnassa ja arvioinnissa. Maailman tiede ja teknologia - perinteisen kiinalaisen lääketieteen modernisointi. 11: 439–444. [Google tutkija]

52. Ma ZG (2011) Prosessoitujen Cistanche Sinensis G.Beckin ja Herba Cistanchesin erottelu HPLC-sormenjälkien avulla. Leuka. Pharm J. 46: 899–902. [Google tutkija]

53. Huang LX, Wang YE, Shi MH, Jia XG, Xie X, et ai. (2011) HPLC-sormenjälkien tutkimusCistanchetubulosa. Xinjiangin perinteisen kiinalaisen lääketieteen lehti. 29: 54–56. [Google tutkija]

54. Chen P, Guo YH, Wang BM, Zhai ZX (2006) SDS-PAGE liukoisista proteiineista neljässä Cistanche Hoffingin kasvissa. Et Link. Kiinan perinteiset ja yrttilääkkeet 37: 1399–1402. [Google tutkija]

55. Xu R, Chen J, Chen SL, Liu TN, Na R (2007) AFLP-analyysi viljellyn ja luonnonvaraisen Cistanche deserticolan ituplasmaresurssien monimuotoisuudesta. Perinteiset kiinalaiset ja yrttilääkkeet 38: 1703–1707. [Google tutkija]

56. Gan XY, Li M, Ma HA, Song YX (2011) Tutkimus lajin sisäisestä vaihtelustaCistanchedeserticola YCMa käyttämällä AFLP-molekyylimarkkereita. Pohjoisen puutarhanhoito, 141–143.

PLoS ONEen artikkelit ovat täällä Public Library of Sciencen luvalla

PLoS One. 2014; 9(5): e98061.

Julkaistu verkossa 2014 22. toukokuuta. doi: 10.1371/journal.pone.0098061

PMCID: PMC4031141

PMID: 24854031