Cucurbita Pepo L. -siementen etanoliuute muokkaa kroonisesti stressaantuneiden rottien neuroendokriinisia häiriöitä sekä tulehdusmerkkiaineiden ja HSP70:n lisämunuaisen ilmentymistä

1 Perustieteiden laitos, College of Medicine, Princess Nourah Bint Abdulrahman University (PNU), Riyadh, Saudi-Arabia,

2 Lääketieteellisen histologian ja solubiologian laitos, Lääketieteellinen tiedekunta, Mansoura University, Mansoura, Egypti,

3 Histologian laitos, Lääketieteellinen tiedekunta, Menoufifia University, Shebin ElKoum, Egypti,

4 Lääketieteen perustieteiden laitos, Unaizah College of Medicine and Medical Sciences, Qassim University, Buraydah, Saudi-Arabia,

5 Biologian laitos, luonnontieteiden tiedekunta, King Abdulazizin yliopisto, Jeddah, Saudi-Arabia,

6 Lääketieteellisen laboratoriotekniikan laitos, lääketieteellinen tiedekunta, Tabukin yliopisto, Tabuk, Saudi-Arabia,

7 Biokemian laitos, luonnontieteellinen tiedekunta, King Abdulazizin yliopisto, Jeddah, Saudi-Arabia,

8 Histologian ja solubiologian laitos, lääketieteellinen tiedekunta, Assuit University, Asyut, Egypti,

9Yousef Abdullatif Jameel Profeettaisten lääketieteellisten sovellusten katedraali (YAJCPMA), lääketieteellinen tiedekunta, King Abdulazizin yliopisto, Jedda, Saudi-Arabia,

10 Hematologian/lastenonkologian osasto, King Abdulazizin yliopistollinen sairaala (KAUH), lääketieteellinen tiedekunta, King Abdulazizin yliopisto, Jeddah, Saudi-Arabia,

11 Lääketieteellisen histologian laitos, Lääketieteellinen tiedekunta, Damietta University, Damietta, Egypti

Lisätietoja: ali.ma@wecistanche.com

Tausta:Kurpitsoilla (Cucurbita pepo L.) kuvattiin olevan antioksidanttisia, anti-inflammatorisia, väsymystä ja masennuslääkkeiden kaltaisia ​​vaikutuksia. Thelisämunuainenon tärkeä stressiin reagoiva elin, joka ylläpitää homeostaasia stressin aikana.

Tavoitteet:Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida Cucurbitan annon tehoapepo L. (CP) -uute lievittää käyttäytymis-, biokemiallisia ja rakenteellisia muutoksialisämunuainenaltistuminen krooniselle ennakoimattomalle lievälle stressille (CUMS) ja tutkia tämän vaikutuksen taustalla olevaa mekanismia. Materiaalit ja menetelmät: 40 urospuolista albiinorottaa jaettiin 4 ryhmään (n-10): kontrolli-, CUMS-, fluoksetiinilla käsitellyt ja CP-käsitellyt ryhmät. Kokeen lopussa seerumissa arvioitiin käyttäytymismuutokset, kortikosteronitaso, tulehdusta edistävät sytokiinit TNF- ja IL-6 sekä hapetin/antioksidanttiprofiili.Lisämunuainenrauhaset käsiteltiin histopatologista ja immunohistokemiallista arviointia varten. Kaspaasin-3 ja Ki67:n ja lämpösokkiproteiinin 70 (HSP70) geeniekspressio arvioitiin lisämunuaisissa käyttämällä RT-PCR:ää.

Tulokset:CP-uute alensi merkittävästi kortikosteronitasoa (p < 0,001),liikkumattomuusaika (p < 0,001)="" ja="" cums:n="" aiheuttamaan="" masennukseen="" liittyvät="" tulehdukselliset="" ja="" oksidatiiviset="" muutokset="" verrattuna="" hoitamattomaan="" ryhmään.="" cp-uute="" lievitti="">lisämunuainenhistopatologiset muutokset ja merkitsevästi vähentynyt apoptoosi (p < 0,001) ja merkittävästi lisääntyneet seerumin antioksidanttipitoisuudet.

Avainsanat:kurpitsa, stressi, masennus, kaspaasi-3, ki67, Hsp70, apoptoosi

Napsauta nähdäksesi lisämunuaisen lisämunuaisen tubulosa-annoksen

JOHDANTO

Yli 264 miljoonaa kaiken ikäistä ihmistä kärsii masennuksesta kaikkialla maailmassa (WHO, 2020). Masentuneen henkilön suorituskyky on yleensä huono koulussa, työssä ja perheessä. Masennus voi johtaa itsemurhaan; joten sitä pidetään toiseksi yleisimpänä kuolinsyynä 15-–29--vuotiaiden välillä (WHO, 2020). Nisäkkäät voivat selviytyä stressaavista tapahtumista aktivoimalla asianmukaiset fysiologiset vasteet näihin tapahtumiin. Lisämunuainen on osa hypotalamus-aivolisäke-lisämunuaiskuoren (HPA) -akselia ja sympatia-adrenomedullaari-akselia, joka ylläpitää homeostaasia stressin aikana (Ulrich-Lai et al., 2006). On raportoitu, että altistuminen lämpöstressille johtaa HSP70:n nopeaan ilmentymiseen lisämunuaiskuoressa (Huang et ai., 2001). Näillä proteiineilla on yhteistä solunsisäistä liikennöintiä, antigeenien esittelyä, apoptoosia ja monia muita vaikutuksia (Khar et ai., 2001). On kuvattu, että eksogeenisilla hormoneilla tai endogeenisten hormonien häiriöillä voi kriittisten kehitysjaksojen aikana olla pysyviä vaikutuksia hypotalamuksen neuroendokriinisten piirien säätelemiin fysiologisiin ja käyttäytymisreitteihin (Gore ja Patisaul, 2010). Neuroendokriiniset häiriöt kuvattiin myös laajentamaan endokriinisen häiriön käsite kattamaan integratiivisen fysiologian koko laajuuden; siksi se on enemmän kuin hormonaalista häiriötä (Waye ja Trudeau, 2011). Neuroendokriinisen säätelyn, aineenvaihdunnan ja ruokavalion/mikrobiotan muutosten katsotaan laukaisevan tulehdusta ja alttiutta masennuksen kehittymiselle (Huang et al., 2019). Oletuksena oli, että masennuksella - yksi neuropsykiatrisista häiriöistä - ja tulehduksella on kaksisuuntainen suhde. Vaikka masennus edistää tulehdusreaktioita, tulehdus edistää neuropsykiatrisia häiriöitä, mukaan lukien masennus (Bauer ja Teixeira, 2019). Fluoksetiini, klassinen masennuslääke, on yksi markkinoilla olevista masennuksen hoitoon tarkoitetuista lääkkeistä. Sitä pidetään nyt nousevana neuroendokriinisena häiriötekijänä.

Tämä fluoksetiinin vaikutus on sivuvaikutus eikä pääasiallinen terapeuttinen kohde nisäkkäillä (León-Olea et al., 2014). Siksi tarvitaan turvallisempia masennuslääkkeitä, joilla ei ole sivuvaikutuksia neuroendokriiniseen tilaan. Kurpitsat (Cucurbita pepo L.) ovat taloudellisesti tärkeitä lajeja, joita viljellään maailmanlaajuisesti. Niillä on ravitsemuksellisia ja terveydellisiä etuja, koska ne sisältävät runsaasti fenoleja, flavonoideja, aminohappoja, hiilihydraatteja ja vitamiineja (Wang et al., 2002). Useat tutkimukset paljastivat, että kurpitsalla on laajaa bioaktiivisuutta, kuten diabetesta, syöpää, antioksidantteja, tulehdusta, väsymystä ja masennuslääkettä muistuttavia vaikutuksia (Wang et al., 2012; Zhang et al., 2012; Nawirska-Olszańska et. al., 2013; Kim Nr et ai., 2016). Perinteinen lääketiede pääasiassa Ayurveda-järjestelmät ja kiinalainen lääketiede ovat käyttäneet kurpitsan eri osia, mukaan lukien hedelmien ja siementen lihaa (Perez Gutierrez, 2016). Sweetme Sweet Pumpkinin (SSP) ja Cucurbita moschata Duchin masennuslääketehoa testattiin aiemmin in vivo -tutkimuksessa, jossa käytettiin pakkouintitestin (FST) aiheuttamaa masennuksen eläinmallia, ja sitä verrattiin fluoksetiiniin (Kim Nr et al., 2016). . Yksi suhteellisen tuoreista katsauksista tiivisti, että masennuslääkkeiden, kuten kurpitsansiementen, masennuslääkkeiden pistemäärä on 47 prosenttia, mikä tarjoaa sen masennuslääkettä muistuttavan vaikutuksen (Lachance ja Ramsey, 2018). Äskettäin Dotto ja Chacha tukivat enemmän eläin- ja kliinisiin kokeisiin perustuvia tutkimuksia vahvistaakseen kurpitsansiementen parantavaa vaikutusta masennukseen (Dotto ja Chacha, 2020). Nämä raportit rohkaisivat testaamaan kurpitsan tehoa kroonisen stressin lisämunuaisiin kohdistuvan vaikutuksen lievittämisessä. Siksi tämä tutkimus suoritettiin arvioidakseen Cucurbita pepo L. (CP) -uutteen oraalisen annon vaikutusta kroonisen arvaamattoman lievän stressin (CUMS) aiheuttaman käyttäytymis-, biokemiallisen ja lisämunuaisen rakenteen lievittämiseen ja tämän vaikutuksen taustalla olevan mekanismin tutkimiseksi. .

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Kurpitsan uuttaminen ja annostelu

Cucurbita pepo L. (kupongimalli: AQJ_95) ostettiin paikallisilta markkinoilta Jeddasta, Saudi-Arabiasta. Ne tunnistettiin kuningas Abdulazizin yliopiston herbaariossa käyttämällä herbaarionäytteitä ja KSA:n kasvistoa (Chaudhary, 2001). Lahjakorttinäytteet talletettiin herbaarioon. Kirjoittajat tunnistivat CP:n, ja sen vahvisti kuningas Abdulazizin yliopiston luonnontieteiden tiedekunnan kasvitieteilijä. CP:n uuttaminen tehtiin aikaisempien tutkimusten mukaisesti (Wang et al., 2012). Raa'at hedelmät kuorineen leikattiin viipalointikoneella ja kuivattiin lyofilisaattorilla (FD5508; ilShinBioBase Co., Ltd., Korea) ja murskattiin sitten sähköhiomakoneella. Jauhe seulottiin 40-verkkoseulan läpi hienoksi jauheeksi ja varastoitiin ilmatiiviiseen astiaan. Kuivattu jauhe (50 g) sekoitettiin 450 ml:aan 80-prosenttista etanolia ja jätettiin 1 päiväksi 37 °C:seen ravistimeen (JSSI-100T; JS Research Inc., Compact Shaking Incubator., Korea) ja suodatettiin sitten puuvillalla ja suodatinpaperilla toisena päivänä. Tämä uuttoprosessi toistettiin kahdesti 37 asteessa etanoliuutteen saamiseksi.

CP:n ainesosien tunnistaminen

PE:n kemiallinen koostumus analysoitiin käyttämällä kaasukromatografiaa GC-TSQ Evo 8000 massaspektrometriä (Thermo Scientific, Austin, TX, Yhdysvallat) suoralla kapillaarikolonnilla TG-5MS ( 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm kalvonpaksuus). Pylväsuunin lämpötila asetettiin aluksi 50 asteeseen ja nostettiin sitten 5 asteella C/min 250 celsiusasteeseen ja pidettiin 2 minuuttia ja nostettiin sitten lopulliseen lämpötilaan 300 astetta 25 astetta/min ja pidettiin 2 minuuttia. Injektorin ja MS-siirtolinjan lämpötilat pidettiin 270 ja 260 °C:ssa, vastaavasti; heliumia käytettiin kantajakaasuna vakiovirtausnopeudella 1 ml/min. Liuottimen viive oli 4 minuuttia, ja laimennetut 3 ul:n näytteet injektoitiin automaattisesti käyttämällä Autosampler AS1300 -laitetta, joka oli kytketty GC:hen jaetussa tilassa PTV-injektorissa. EI-massaspektrit kerättiin 70 eV:n ionisaatiojännitteillä alueella m/z 50–650 täydessä pyyhkäisytilassa. Ionilähteen lämpötila asetettiin 250 asteeseen. Komponentit tunnistettiin vertaamalla niiden massaspektrejä WILEY 09- ja NIST 14 -massaspektritietokannan massaspektreihin, joita käytetään tunnistamaan ja tutkimaan tuntemattomien komponenttien kemiallista koostumusta missä tahansa uutteessa (Wiley, 2006; Mikaia et al., 2014). Analyysi oli tehty kvalitatiivisella tyypiltään Thermo Scientifific™ Xcalibur™ 2.2 -ohjelmistolla ja kaikki arvot on raportoitu suhteellisissa prosenteissa (Abd El-Kareem et al., 2016).

Kokeellinen suunnittelu

Tämän tutkimuksen hyväksyi biolääketieteellisen tutkimuksen eettinen komitea King Abdulazizin yliopiston lääketieteellisessä tiedekunnassa Jeddahissa, KSA:ssa (viitenumero {{0}}). Tässä tutkimuksessa neljäkymmentä urospuolista albiinorottaa, jotka painoivat 150–200 g ja olivat iältään 2–3 kuukautta, hankittiin King Fahd Medical Research Centeristä (KFMRC). Ennen kokeen aloittamista rottien annettiin tottua laboratorio-olosuhteisiin 1 viikon ajan. Kymmenen rottaa määritettiin kontrolliryhmäksi, joka jätettiin altistamatta CUMS:lle. Muut kolmekymmentä rottaa altistettiin CUMS-menettelylle 4 viikon ajan, joka sisälsi erityyppisiä stressitekijöitä eri aikoina vuorokauden aikana stressiin tottumisen estämiseksi. CUMS-menettely kuvattiin täydellisesti aikaisemmissa töissä (Ayuob et al., 2016; Ali et al., 2017) ja se on esitetty taulukossa 1. CUMS:lle altistetut rotat jaettiin 3 ryhmään (n 10). Käsittelemätön ryhmä (CUMS) sai vehikkeliä 0,03 % karboksimetyyliselluloosaa (CMC-Na) letkuruokinnalla 2 viikon ajan. FLU:lla hoidettu ryhmä sai FLU:ta (Dar Al Dawa Pharmaceuticals Co., Ltd., Amman, Jordania), masennuslääkettä, jota käytettiin farmakologiseen validointiin, liuotettuna 0,03 % CMC-Na:hon annoksena 20 mg/kg mahaletkulla (Li) et ai., 2014). CP-käsitelty ryhmä sai CP-uutetta liuotettuna tislattuun veteen annoksella 100 mg/kg letkulla 2 viikon ajan Wang et ai. (2012).

Käyttäytymismuutosten arviointi

FST suoritettiin 4 viikon kuluttua CUMS:n vaikutuksen vahvistamiseksi rotille (Ali et al., 2017). Tämän testin aikana jokainen rotta asetettiin lasimaiseen lieriömäiseen astiaan (korkeus 20 cm, halkaisija 14 cm), jossa oli 15 cm vettä 25 ± 2 °C:ssa. Rotta videoitiin 6 minuutin ajan käyttäytymisohjelmistolla (Noldus Information Technology, EthoVision). XT®), ja koeryhmille sokea teknikko mittasi 6 minuutin aikana liikkumattomana vietetyn kokonaisajan. Kokonaisaika sekunteina, jonka rotat viettivät ilman raajan liikettä, lukuun ottamatta pientä liikettä, joka oli tarpeen hiiren pinnalla pitämiseksi, "liikkumattomuusaika" 6 minuutin aikana määritettiin.

Biokemialliset tekniikat

Kaksikymmentäneljä tuntia käyttäytymistestin päättymisen jälkeen otettiin verinäytteet rottien silmäkuopan poskiontelosta sen jälkeen, kun ne oli nukutettu 4-prosenttisella isofluraanilla (SEDICO Pharmaceuticals Company, Kairo, Egypti) 100-prosenttisessa hapessa. Sen jälkeen rotat lopetettiin kohdunkaulan dislokaatiolla. Verinäytteitä sentrifugoitiin nopeudella 3, 000 rpm 15 minuuttia 4 °C:ssa seerumin saamiseksi ja pidettiin -18 °C:ssa biokemiallista arviointia varten. Kortikosteronin taso (ALPCO Diagnostics, Orangeburg, NY, Yhdysvallat) arvioitiin käyttämällä entsyymi-immunosorbenttimäärityspakkauksia valmistajan ohjeiden mukaisesti. Valmistajan ohjeiden mukaan TNF- ja IL-6 (Quantakin R&D system, USA Kit) arvioitiin käyttämällä entsyymi-immunosorbenttimääritystä. Kunkin näytteen optinen tiheys määritettiin kahtena rinnakkaisena mikrolevy-ELISA-lukijalla, joka oli asetettu 450 nm:iin. Tiobarbituurihapporeaktiivisten aineiden (TBARS) määrityspakkausta (Biodiagnostic; Egypti) käytettiin malondialdehydin (MDA) tason mittaamiseen spektrofotometrisesti 535 nm:ssä (Gamal et al., 2018). Superoksididismutaasin (SOD) taso mitattiin käyttämällä SOD-määrityssarjaa (Biodiagnostic; Egypti) (Packer, 2002). Glutationiperoksidaasin (GPX) tason arviointi suoritettiin käyttämällä GPX-sarjaa (Randox Labs, Crumlin, Yhdistynyt kuningaskunta). Katalaasin (CAT) aktiivisuuden kvantifiointia varten luotiin kalibrointikäyrä määritykselle ja kaikille näytteille käyttämällä määrityssarjoja (Biodiagnostic; Egypti). Menetelmä on kuvattu aiemmin (Gamal et al., 2018).

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

RNA:n uuttaminen kudosnäytteistä tehtiin käyttämällä TriFast™-reagenssia (PeqLab, Saksa, luettelonumero: {{0}}), kuten valmistajan protokollassa on kuvattu. Puhdistetun RNA:n pitoisuus arvioitiin käyttämällä NanoDrop 2000c spektrofotometriä (Thermo Scientific, Yhdysvallat). Kustakin näytteestä uutettu RNA käänteistranskriptoitiin käyttämällä SensiFAST™ cDNA-synteesisarjaa RT-qPCR:lle (Bioline USA Inc., Yhdysvallat, luettelonumero: BIO-65053) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Syntetisoitu cDNA säilytettiin -80 asteessa qRT-PCR:ään asti. QRT-PCR-reaktiot suoritettiin käyttämällä SensiFAST™ SYBR Lo-ROX -sarjaa (Bioline USA Inc., Yhdysvallat, luettelonumero: BIO-94002) ​​Applied Biosystems 7500 -reaaliaikaisessa PCR-ilmaisujärjestelmässä (Life Technology). , Yhdysvallat). Tässä tutkimuksessa käytetyt geenispesifiset alukkeet rotille suunniteltiin Primer3-ohjelmistolla (v.0.4.0), ja niiden spesifisyys tarkistettiin NCBI/Primer-BLAST-ohjelmalla. Alukkeet ostettiin sitten Willowfort™:lta (Yhdistynyt kuningaskunta). Alukkeet olivat GAPDH (5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′, 5′-GGC ATGGACTGTGGTCATGAG-3′), kaspaasi-3 (eteenpäin 5- TGT ATGCCTACCTA}{{225} käänteinen 5-GCGCAAAGT GACTGGATGAACC-3), HSP70 (5′-ACGAGGGTCTCAAGG GCAAG-3′, 5′-CTCTTTCTCAGCCAGCGTGTTAG-3′). Ki67 (eteenpäin 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA-3, taaksepäin 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA 3). PCR-seos valmistettiin seuraavasti: 10 µl SensiFASTTM SYBR Lo-ROX -seosta, 0,8 µl eteenpäin-aluketta, 0,8 µl käänteisaluketta, 2 µl templaatti-cDNA:ta ja 6,4 µl nukleaasivapaata vettä. Reaktioseos siirrettiin lämpökiertolaitteeseen, joka oli aiemmin ohjelmoitu pitämään 95 astetta 2 minuuttia, mitä seurasi 40 sykliä 95 astetta 15 s ja sitten 60 astetta 30 s. Jokaisessa kokeessa ajettiin negatiivinen kontrollireaktio, joka ei sisältänyt templaattia. Sulamiskäyräanalyysi suoritettiin PCR-tuotteiden spesifisyyden osoittamiseksi, ja kunkin reaktion Ct-arvo saatiin amplifikaatiokaavioista. Kunkin geenin ilmentymisen suhteellinen kvantifiointi kudosnäytteissä laskettiin käyttämällä vertailevaa kynnys (ΔΔCt) menetelmää GAPDH:n ollessa sisäisenä kontrolligeeninä. Kokonaiskertymän muutosta varten se laskettiin ja linearisoitiin 2-ΔΔCt aritmeettisella kaavalla.

Histologiset tekniikat

Kokeen lopussa ja sen jälkeen, kun rotat oli nukutettu, vatsa avattiin ja oikea lisämunuainen leikattiin pois. Parafiinilohkojen saamiseksi suoritettiin lisämunuaisen kiinnitys 10-prosenttisessa neutraalissa puskuroidussa formaliinissa ja lisäprosesseja. Valmistettiin 4-μm paksuiset parafiinileikkeet ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H&E). Lisäksi muut parafiinileikkeet värjättiin immunohistokemiallisesti käyttämällä streptavidiini-biotiini-peroksidaasitekniikkaa. Objektilaseja inkuboitiin yön yli 4 asteessa, ja sitten niitä inkuboitiin monoklonaalisen anti-Ki67:n kanssa (Dako Cytomation, Yhdysvallat, laimennos 1:1, 000) ​​solujen lisääntymisen osoittamiseksi. Lisäksi apoptoosin havaitsemiseen käytettiin polyklonaalista anti-kaspaasi{10}}-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Yhdysvallat, laimennussuhde 1:1,{13}}). Käytettiin myös polyklonaalista vasta-ainetta lämpösokkiproteiinia -70 (HSP70) vastaan ​​(Dako, Carpinteria, CA, Yhdysvallat, laimennussuhteessa 1:1,000). Käytettiin vastaavaa biotinyloitua konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta Dako-värjäysjärjestelmästä. Ainoastaan ​​sekundaarisella vasta-aineella värjättyjä objektilaseja käytettiin negatiivisina kontrolleina. Tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä. Ruskeaa sytoplasmista värjäytymistä pidettiin positiivisena reaktiona. Värjätty osat tutkittiin ja valokuvattiin Olympus Microscope BX-51 -laitteella (Olympus), joka oli kytketty digitaalikameraan ja tietokoneeseen. Vasta-aineen immunoreaktiivisuuden semikvantitatiivinen analyysi tehtiin Pro Plus -kuvaanalyysiohjelmistolla. Immunopositiivisen reaktion prosentuaalinen pinta-ala arvioitiin 30 kentässä × 400 suurennuksella. Positiiviset solut laskettiin 1,0 mm2:n pinta-alaa kohti, kuten Zhou et ai. (2016). Jokaisesta objektilasista tutkittiin vähintään viisi kenttää, ja keskiarvo laskettiin kullekin eläimelle. Morfometristä analyysiä varten kustakin eläimestä tutkittiin neljä leikettä (suurennus x 100). Lisämunuaisen eri vyöhykkeiden paksuus mitattiin mikrometreinä. Lisämunuaiskuoren paksuus saatiin mittaamalla ytimen ja lisämunuaisen kapselin välinen etäisyys suoraviivaisesti, yksi mittaus tehdään jokaisesta lisämunuaiskuoren kvadrantista.

Tilastollinen analyysi

TULOKSET

Käyttäytymistulokset

CP-uutteen analyysin tulokset GC-MS:llä

Biokemiallinen arviointi

Kortikosteronitaso seerumissa

Kortikosteronitaso nousi merkitsevästi (p < {0}},001) CUMS:lle altistuneilla hoitamattomilla rotilla verrattuna kontrollirottiin, kun taas FLU:lla ja CP:llä hoidetuilla rotilla oli merkittävä lasku (p < 0,001) seerumin kortikosteronitasossa.

TNF- ja IL-6-tasot seerumissa

MDA-, SOD-, GPX- ja CAT-tasot seerumissa

Ki67:n, kaspaasin-3 ja HSP70:n geeniekspressio

RT-PCR paljasti merkityksettömän korkean Ki67-geenin ilmentymisen CUMS-ryhmän lisämunuaisissa verrattuna kontrolliryhmään, kun taas FLU- ja CP-käsiteltyjen ryhmien ekspressio oli merkitsevästi korkea verrattuna CUMS-altistetun ryhmän ilmentymiseen (kuva 3E). . Mitä tulee kaspaasiin-3, sen geeniekspressio lisääntyi merkittävästi (p < 0.001)="" cums-ryhmän="" lisämunuaisissa="" verrattuna="" kontrolliryhmään,="" kun="" taas="" flu-="" ja="" cp-käsitellyt="" ryhmät="" osoittivat="" merkittävää="" laskua="" verrattuna="" cums-altistettuun="" ryhmään="" (kuvio="" 3f="" hsp70-geenin="" ilmentymisen="" osalta="" se="" kirjasi="" merkittävästi="" korkeammat="" (p="">< 0,001)="" tasot="" cums-ryhmän="" lisämunuaisissa="" kuin="" cums-ryhmän="" lisämunuaisissa.="" kontrolliryhmässä,="" kun="" taas="" flu-="" ja="" cp-käsiteltyjen="" ryhmien="" ryhmä="" osoitti="" merkityksetöntä="" laskua="" verrattuna="" cums-altistettuun="" ryhmään="" (kuva="">

Histopatologinen arviointi

KESKUSTELU

Nyky-yhteiskunta on ilmeisesti täynnä stressiä, joka voi johtua päivittäisistä ongelmista, terveydenhuollosta ja työhön liittyvistä ongelmista. Nämä stressitekijät voivat aiheuttaa niin sanottuja stressiin liittyviä häiriöitä (Clayton ja McCance, 2014). Tässä tutkimuksessa Cucurbita pepo L.:n lihasta ja kuoresta saatua etanoliuutetta käytettiin tutkimaan sen potentiaalia CUMS:n aiheuttaman masennuskäyttäytymisen lievittämisessä ja sen vaikutusta lisämunuaiseen. Tämän todisti a

seerumin kortikosteronitason merkittävä nousu, mikä vahvistettiin pidennetyllä liikkumattomuudella FST:n aikana. Nämä havainnot olivat yhdenmukaisia ​​aiemmin raportoitujen kanssa (Tang et al., 2015). Sekä TNF- että IL-6 raportoitiin osallistuvan masennuksen patogeneesiin (Taraz et al., 2015; Pedraz-Petrozzi et al., 2020). On raportoitu, että hiiret, joista puuttuu IL-6 tai TNF-reseptori, ovat vastustuskykyisiä masennuskäyttäytymiselle (Viana et al., 2010). Siksi ne arvioitiin tässä tutkimuksessa, ja havaittiin, että sekä TNF- että IL{10}} lisääntyivät merkittävästi CUMS:lle neljän viikon ajan altistuneiden rottien seerumissa, mikä osoittaa, että ne olivat masentuneita. Tätä havaintoa tukivat Numakawa et ai. (2014) hiirillä, joilla on epätoivon käyttäytyminen, ja Taraz et al. (2015) masennuspotilailla. Tässä tutkimuksessa kurpitsauutteen antaminen liittyi masennuskäyttäytymisen paranemiseen, mikä ilmeni FST:n liikkumattomuusajan merkittävänä lyhentymisenä ja vahvistui kortikosteronin ja tulehdussytokiinien TNF- ja IL-6 merkittävänä vähenemisenä seerumi. Näitä havaintoja tukivat Kim Nr et ai. (2016), jotka raportoivat, että SSP 28 päivän ajan alensi tulehduksellisten sytokiinien tasoa masentuneilla rotilla.

Kurpitsan anti-inflammatorinen vaikutus saattaa johtua kurpitsan aktiivisista yhdisteistä, kuten öljy- ja palmitiinihapoista ja estradiolista. Öljyhapon, palmitiinihapon ja linolihapon säätelyä on kuvattu masennuksessa (Conklin et al., 2010; Martín et al., 2010). On raportoitu, että öljyhappovälitteinen hermosuojaus liittyy sen tulehdusta estävään vaikutukseen, jota välittää peroksisomiproliferaattorin aktivoima reseptori gamma (PPAR-) aktivaatio (Song et al., 2019). Lisäksi palmitiinihapon raportoitiin estävän fosfolipaasi A(2) ja siksi sitä pidettiin anti-inflammatorisena yhdisteenä (Aparna et al., 2012). Estradioli oli yksi tässä tutkimuksessa havaituista kurpitsan yhdisteistä. Estradiolin on raportoitu aiheuttavan tulehdusta ehkäisevää vaikutusta ja sen jälkeen lievittävän masennuskäyttäytymistä (Xu et al., 2015). Toinen mekanismi, jolla estradioli voi indusoida masennuslääkevaikutuksen, on aivoperäisen neurotrofisen tekijän (BDNF) ilmentymisen ja ERK:n fosforylaation lisääntyminen aktivoimalla ER- aivoissa (Yang et al., 2010). Tässä tutkimuksessa seerumin MDA-taso nousi, kun taas SOD-, GPX- ja CAT-tasot laskivat CUMS-altistuneissa rotissa. Samanlaisia ​​muutoksia dokumentoitiin aiemmissa tutkimuksissa CUMS-altistuksen jälkeen, ja ne lisäsivät, että nämä biokemialliset muutokset johtivat oksidatiiviseen stressiin ja HPA:n heikkenemiseen (Nabavi et al., 2015). Liu T. et ai. (2015) raportoivat myös, että masennuksen kehittyminen voi johtua kehon alhaisesta antioksidanttipitoisuudesta.

Kurpitsan hedelmäuutteen antioksidanttisia ominaisuuksia on raportoitu usein (Bahramsoltani et al., 2017). Lisäksi Cucurbita pepo L.:n lihan ja kuoren raportoitiin prosessoivan korkeampaa antioksidanttiaktiivisuutta kuin muilla osilla, esimerkiksi siemenillä (Oyeleke et al., 2019). Kurpitsauutteen antaminen monissa aiemmissa tutkimuksissa nosti merkittävästi SOD- ja GPX-tasoja ja vähensi MDA:ta hiirten seerumissa (Guo-Hua et al., 2000; Dang, 2004), ja tämä vaikutus dokumentoitiin myös tässä tutkimuksessa. Siksi kurpitsan antioksidanttinen aktiivisuus saattaa olla sen tässä tutkimuksessa ilmeisen masennuslääkkeen vaikutuksen takana. Tämä on linjassa Kim Nrin et al. (2016). On raportoitu, että luonnollisilla tuotteilla, joilla on anti-inflammatorisia, antioksidanttisia ja väsymystä ehkäiseviä vaikutuksia, on myös masennuslääkkeen kaltainen vaikutus (Jeong et al., 2015). Kaikki nämä aiemmat toiminnot todistettiin kurpitsoissa. Lisämunuaiskuoren solujen lisääntynyt sytoplasminen vakuolaatio, joka havaittiin tässä tutkimuksessa CUMS-ryhmässä, saattaa johtua lipidien kasvavasta kysynnästä, jotka muodostavat kortisolin synteesin kulmakiven. Cigankova et ai. (2005) havaitsivat, että pitkäkestoinen kokeellinen hyperdynamiikka johti useiden aivokuoren solujen sytoplasmisten lipidipisaroiden yhteensulautumiseen. Nämä lipidipisarat sisältävät kolesterolia, joka on steroidihormonien synteesin pääasiallinen esiaste.

Koldysheva ja Lushnikova (2008) raportoivat kuitenkin, että stressi johti lipidipisaroiden merkittävään vähenemiseen lisämunuaiskuoren soluissa, erityisesti ZF:ssä (Koldysheva ja Lushnikova, 2008). Kuvattiin, että fyysiselle rasitukselle altistuessaan kipuärsykkeet välittyvät hypotalamukseen, mikä johtaa CRH:n erittymiseen hypofyysiseen portaalijärjestelmään, mikä lisää ACTH:n eritystä ja stimuloi sen reseptoreita ZF:ssä ja ZR:ssä lisäämään kortisolin eritystä (Patti et al. , 2018). CUMS:lle altistuneilla rotilla havaittu paksuuntunut lisämunuaisen kapseli ja trabekulaatit raportoitiin aiemmin (El-Desouki et al., 2011; Altayeb ja Salem, 2017) fibroblastien lisääntyneen kollageenisynteesin seurauksena immobilisaatiostressille altistuessa. Monet solut CUMS-altistuneiden rottien lisämunuaisissa osoittivat syvästi värjäytyneitä ytimiä, mikä osoitti, että ne kävivät läpi apoptoosin, joka vahvistettiin kaspaasi-3-immunohistokemiallisella värjäyksellä. Samanlaisen havainnon raportoivat Altayeb ja Salem (2017), kun he tutkivat immobilisaatiostressin vaikutusta rottien lisämunuaisiin. Liu Q. et ai. (2015) raportoivat, että liiallinen oksidatiivinen stressi, joka ilmeni tässä tutkimuksessa CUMS-altistuksen jälkeen, muuttaa "apoptoosiin liittyvien geenien" ilmentymistasoja ja indusoi solujen apoptoosia ja rappeutumista Bcl-2-, Bax- ja kaspaasin signalointireittien kautta. -3. Tämä mekanismi vahvistettiin tässä tutkimuksessa RT-PCR:llä, joka paljasti kaspaasi-3-geenin ilmentymisen merkittävän lisääntymisen.

Kirjallisuuden tarkastelun perusteella Cucurbita pepolla ei ollut suoraa vaikutusta kaspaasi{0}}-välitteiseen apoptoosiin eri kudoksissa. Näyttää siltä, ​​että lisämunuaisissa havaittu kaspaasi-3-positiivisten apoptoottisten solujen väheneminen johtui tässä tutkimuksessa dokumentoidusta Cucurbita pepon antioksidanttisesta vaikutuksesta. Tätä tukevat monet aiemmat tutkimukset, jotka on tehty muista kasveista ja yrteistä, joilla on merkittäviä antioksidanttisia vaikutuksia (Banagozar Mohammadi et al., 2019; Ghazizadeh et al., 2020). Tämä tutkimus osoitti, että altistuminen CUMS:lle lisäsi Ki67--positiivisten solujen määrää lisämunuaiskuoressa, mikä oli selvästi ilmeistä ZF:ssä, mikä osoitti lisääntyneiden solujen määrän lisääntymistä, ja tämän seurauksena tämän kerroksen paksuus kasvoi merkittävästi. Toisaalta Ki67-positiivisten lisääntyvien solujen määrä väheni merkityksettömästi ytimessä vasteena CUMS:lle. Nämä havainnot olivat linjassa Ulrich-Lain et al. (2006), jotka raportoivat Ki67-positiivisten soluytimien lisääntymisestä vain ulommassa ZF:ssä krooniselle vaihtelevalle stressille altistumisen jälkeen, kun taas ydin osoitti solujen liikakasvua eikä hyperplasiaa. Lisäksi Laborie et al., (2003) raportoivat yleistyneestä medullaarisen toiminnan lisääntymisestä krooniselle stressille altistumisen jälkeen,

viittaa siihen, että krooninen stressi voi johtaa medullarin hypertrofiaan. Tässä tutkimuksessa kurpitsauutteen antaminen lisäsi merkittävästi solujen lisääntymistä, mikä käy ilmi Ki67-geenin lisääntyneestä säätelystä ja immuuniekspressiosta lähes kaikilla lisämunuaisen alueilla ja ytimessä verrattuna CUMS:ään. Tämä selitti tässä tutkimuksessa kirjattujen rauhasalueiden lisääntyneen paksuuden. Se voi myös kompensoida CUMS-altistuksen aiheuttamaa apoptoottista vaikutusta. Tätä havaintoa tukevat Kim Hy et ai. (2016), jotka raportoivat Ki67:n mRNA:n ilmentymisen merkittävästä lisääntymisestä ja BALB/c-hiirten pernasta eristettyjen pernasolujen lisääntymisestä SSP:llä, suoratoistolla ja Cucurbita moschata Duchilla ja sen pääkomponentilla, karoteenilla. Tässä tutkimuksessa altistuminen CUMS:lle lisäsi merkittävästi HSP70:n geeniekspressiota ja immuuniekspressiota kaikilla lisämunuaisen alueilla. Tämän mukaisesti Zheng et ai. (2008) osoittivat myös, että lisääntynyt HSP70:n ilmentyminen stressaaville olosuhteille altistumisen jälkeen moduloi tulehdusvasteita estämällä tulehduksellisen transkriptiotekijän, ydintekijä-kappa B:n (NF-kappaB) aktivoitumisen. Lisäksi HSP70 voi suoraan häiritä apoptoosia ja nekroosia (Yenari et ai., 2005). Viime aikoina Li et ai. (2019) raportoivat HSP70:n ilmentymisen voimistumisesta sian lisämunuaiskudoksessa lämpöstressille altistumisen jälkeen, mikä osoittaa HSP70:n roolin lisämunuaisen vauriossa ja korostaa sen merkitystä tulehdusreaktioissa.

HSP70:n nopeaa induktiota vasteena stressiin pidetään välttämättömänä solujen suojausprosessille. Tutkimuksessamme CUMS-altistuneiden rottien hoito kurpitsoilla liittyi HSP70:n ilmentymisen merkityksettömään vähenemiseen, mikä liittyi vähentyneeseen apoptoosiin ja tulehdusvasteisiin. Tämä saattaa viitata sekä FLU:n että CP:n indusoiman suhteellisen korkean HSP70-tason suotuisaan vaikutukseen, koska se johti kaspaasi-3-välitteisen apoptoosin vähenemiseen ja tulehduksellisten sytokiinien vapautumiseen. Vaikka kurpitsan vaikutusta lämpösokkiproteiiniperheeseen ei ole aiemmin kuvattu, öljyhapon, joka edustaa tässä tutkimuksessa käytettyjen kurpitsoiden pääainesosia, kuvattiin säätelevän HSP60:n ilmentymistä ihmisen T-lymfosyyttisolulinjassa (Martins De Lima). et al., 2004), mikä tukee tutkimustuloksiamme. Cucurbita pepon ehdotettu vaikutusmekanismi masennuslääkettä muistuttavana aineena on esitetty yhteenvetona kuvassa 7. Tämän tutkimuksen rajoitusten joukossa oli kyvyttömyys tutkia CP:n masennuslääkevaikutuksen perusteellista mekanismia, ja siksi lisätutkimus on rohkaistaan ​​siihen. Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus tarjoaa tieteellistä näyttöä Cucurbita pepo L. -uutteen tehosta lievittää CUMS:n aiheuttamia käyttäytymis- ja biokemiallisia muutoksia sekä histopatologista vaikutusta lisämunuaisiin. Nämä vaikutukset olivat ilmeisiä apoptoosin ja HSP70:n ilmentymisen vaimenemisen kautta ja näyttivät välittyvän Cucurbita pepo L. -uutteen antioksidanttisen ja tulehdusta ehkäisevän vaikutuksen kautta. Vaikka tämä tutkimus ja eräät muut viimeaikaiset tutkimukset ovat dokumentoineet Cucurbita pepon masennuslääkettä muistuttavan vaikutuksen ja tutkineet sen mekanismia, lisätutkimuksia, mukaan lukien kliiniset tutkimukset, tarvitaan tämän vaikutuksen vahvistamiseksi ihmisillä.

Tämä on väsymystä ehkäisevä tuotteemme! Klikkaa kuvaa saadaksesi lisätietoja!

VIITTEET

Abd-El-Kareem, MSMA, Rabbih, MAEF, Selim, ETM, Elsherbiny, EAE-M. ja El-Khateeb, AY (2016). GC/EIMS:n soveltaminen yhdessä puoliempiiristen laskelmien kanssa joidenkin basilikan eteerisen öljyn haihtuvien komponenttien tunnistamiseen ja tutkimiseen.

Altayeb, Z. ja Salem, M. (2017). Valo- ja elektronimikroskooppinen tutkimus immobilisaatiostressin vaikutuksesta aikuisten rottien lisämunuaiskuoreen ja EJ-vitamiinin mahdollisesta parantavasta roolista. Histology 1, 44–56.

Aparna, V., Dileep, KV, Mandal, PK, Karthe, P., Sadasivan, C. ja Haridas, M. (2012). N-heksadekaanihapon tulehdusta estävä ominaisuus: rakenteelliset todisteet ja kineettinen arviointi. Chem. Biol. Drug Des. 80, 434–439.

Bahramsoltani, R., Farzaei, MH, Abdolghaffari, AH, Rahimi, R., Samadi, N., Heidari, M., et ai. (2017). Cucurbita Moschata Duchesne -hedelmäkuoren fytokemikaalien, antioksidanttien ja palovammoja parantavien toimintojen arviointi. Iran J. Basic Med. Sci. 20, 798–805. doi:10.22038/ IJBMS.2017.9015

Banagozar Mohammadi, A., Torbati, M., Farajdokht, F., Sadigh-Eteghad, S., Fazljou, SMB, Vatandoust, SM, et ai. (2019). Serisiini lievittää pidättymisstressin aiheuttamaa masennusta ja ahdistuneisuutta muistuttavaa käyttäytymistä moduloimalla oksidatiivista stressiä, hermoston tulehdusta ja apoptoosia prefrontaalisessa aivokuoressa ja aivotursossa.

Bauer, ME ja Teixeira, AL (2019). Tulehdus psykiatrisissa häiriöissä: mikä tulee ensin? Ann. N.Y Acad. Sci. 1437, 57–67.

Chaudhary, S. (2001). Saudi-Arabian kuningaskunnan kasvisto: Kuvitettu Riad: Maatalous- ja vesiministeriö, kansallinen herbaario, kansallinen maatalous- ja vesitutkimuskeskus, 2. Riad: Anatomia ja morfologia.

Cigankova, V., Zibrin, M., Bod A, K. ja Holovska, K. (2005). Pitkän aikavälin kokeellisen hypodynamian vaikutus japanilaisten viiriäisten lisämunuaisiin: ja ultrarakennetutkimus. BULLETIN-ELÄINLÄÄKELAITOS PULAWY 49, 449.

Clayton, M. ja Mcccance, K. (2014). "Stressi ja sairaudet", Patofysiologiassa aikuisten ja lasten sairauksien biologinen perusta. Toimittajat K. McCance, S. Huether, V. Brashers ja N. Rote. 7. painos (USA: Canada Elsevier).

Conklin, SM, Runyan, CA, Leonard, S., Reddy, RD, Muldoon, MF ja Yao, JK (2010). Monityydyttymättömien N-3- ja N-6-rasvahappojen ikään liittyvät muutokset vakavasta masennushäiriöstä kärsivien henkilöiden etukuoressa. Prostaglandiinit Leukot. Essent. Rasvahapot 82, 111-119.

Doron, R., Lotan, D., Versano, Z., Benatav, L., Franko, M., Armoza, S., et ai. (2014). Essitalopraami tai uudet yrttiseokset stressille altistumisen aikana tai sen jälkeen vähentävät ahdistuneisuutta muistuttavaa käyttäytymistä kortikosteroni- ja BDNF-muokkauksilla.

Dotto, JM ja Chacha, JS (2020). Kurpitsansiementen potentiaali toiminnallisena ruoan ainesosana: katsaus. Tieteellinen Afr. 10, e00575.

Duke, JA (1992). GRAS-yrttien ja muiden talouskasvien fytokemiallisten aineosien käsikirja. [Verkossa]. Boca Raton: FL: CRC Press.

El-Desouki, N., El-Refaiy, A., Abdel-Azeem, H. ja El-Baely, M. (2011). Histologiset ja ultrastrukturaaliset tutkimukset immobilisaation vaikutuksesta

Stressi Albino Ratin lisämunuaiskuoreen ja diatsepaamin parantava rooli. J. Egypti. Ger. Soc. Eläin 62, 25–45. Gamal, M., Moawad, J., Rashed, L., Morcos, MA ja Sharawy, N. (2018).

Tetrahydrobiopteriinin mahdollinen osallistuminen sepsiksen redox-homeostaasin häiriöihin - aiheutettu aivojen toimintahäiriö. Brain Res. 1685, 19–28.

Gore, AC ja Patisaul, HB (2010). Neuroendokriiniset häiriöt: historialliset juuret, nykyinen edistys, tulevaisuuden kysymyksiä. Edessä. Neuroendokrinoli. 31, 395–399.

Guo-Hua, X., Zhi-Hong, H. ja Yong-Fangl, W. (2000). Tutkimus kurpitsan polysakkaridin mahdollisesta kasvainten vastaisesta vaikutuksesta ja immuunivasteesta. J. Wuhan Prof. Med. Coll. 28, 1-4.

Hema, R., Kumaravel, S. ja Alagusundaram, K. (2011). Murraya Koenigiin bioaktiivisten komponenttien GC/MS-määritys. J. Am. Sci. 7, 80–83. Huang, L., Mivechi, NF ja Moskophidis, D. (2001). Näkemyksiä suuren stressin aiheuttaman Hsp70-molekyylin säätelystä ja toiminnasta

Chaperone In Vivo: Analyysi hiiristä, joilla on hsp70.1- tai hsp70.3-geenin kohdennettu geenihäiriö. Mol. Cel, Biol. 21, 8575–8591.

Huang, Q., Liu, H., Suzuki, K., Ma, S. ja Liu, C. (2019). Syömisemme yhdistäminen mielialaamme: Ruokavalion, ravinnon antioksidanttien ja masennuksen katsaus. Antioksidantit 8, 376. doi: 10,3390/antiox8090376

Jeong, HJ, Kim, JH, Kim, NR, Yoou, MS, Nam, SY, Kim, KY jne. (2015). Stillenin masennuslääkevaikutus. Kaari. Pharm. Res. 38, 1223–1231.

Jonnalagadda, SC, Suman, P., Morgan, DC ja Seay, JN (2017). "Luku 2 - Viimeaikainen kehitys betuliinin ja betuliinihappojohdannaisten synteesistä ja sovelluksista terapeuttisina aineina", julkaisussa Studies in Natural Products Chemistry. Toimittaja R. Atta Ur (Elsevier). Khar, A., Ali, AM, Pardhasaradhi, BY, Varalakshmi, CH, Anjum, R. ja Kumari, AL (2001). Stressivasteen induktio tekee ihmisen kasvainsoluista

Kurkumiinin välittämää apoptoosia kestävät linjat: Reaktiivisten happivälituotteiden rooli. Cell Stress Chaperones 6, 368-376. doi:10.1379/1466-1268(2001) 006<0368:iosrrh>2.0.co;2 Kikuchi, T., Ando, ​​H., Maekawa, KI, Arie, H., Yamada, T. ja Tanaka, R. (2015). Kaksi uutta Ent-kaurane-tyyppistä diterpeeniglykosidia kesäkurpitsan (Cucurbita Pepo L.) siemenistä. Fitoterapia 107, 69–76. doi:10.1016/j.fifitote.2015.09.019 Kim, HY, Nam, SY, Yang, SY, Kim, HM ja Jeong, HJ (2016a). Cucurbita

Moschata Duch. Ja sen aktiivinen komponentti, karoteeni, edistää tehokkaasti immuunivasteita pernasolujen ja makrofagien aktivoinnin kautta. Immunopharmacol. Immunotoksikoli. 38, 319–326.

Koldysheva, EV, ja Lushnikova, EL (2008). Rotan lisämunuaiskuoren ultrastrukturaalinen uudelleenjärjestely koko kehon hypertermian jälkeen. Sonni. Exp. Biol. Med. 145, 650–655.

Metyraponin aiheuttama glukokortikoidihäviö moduloi tyrosiinihydroksylaasi- ja fenyylietanoliamiini-N-metyylitransferaasigeenin ilmentymistä rotan lisämunuaisessa ei-kolinergisen transsynaptisen aktivaation avulla. J. Neuroendocrinol. 15, 15-23.

Lachance, LR ja Ramsey, D. (2018). Masennuslääkkeet: todisteisiin perustuva ravintoaineiden profilointijärjestelmä masennukselle. World J. Psychiatry 8, 97–104.