Cucurbita Pepo L. -siementen etanoliuute muokkaa kroonisesti stressaantuneiden rottien neuroendokriinisia häiriöitä sekä tulehdusmerkkiaineiden ja HSP70:n lisämunuaisen ilmentymistä

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Hailah M. Almohaimeed1, Shereen Hamed2, Hanan S. Seleem3,4, Ashwaq H. Batawi 5, Zuhair M. Mohammedsaleh6, Maha Jameal Balgoon7, Soad S. Ali 8,9, Soad Al Jaouni 9,10 ja Nasra Ayuob11*

Tausta: Kurpitsat(Cucurbita pepo L.) kuvattiin olevanantioksidantti,anti-inflammatorisia, väsymystä ja masennuslääkkeiden kaltaisia ​​vaikutuksia. Lisämunuainen on tärkeä stressiin reagoiva elin, joka ylläpitää homeostaasia stressin aikana.

Tavoitteet:Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida Cucurbitapepo L. (CP) -uutteen antamisen tehokkuutta lievittää krooniselle ennakoimattomalle lievälle stressille (CUMS) altistumisen aiheuttamia käyttäytymis-, biokemiallisia ja rakenteellisia muutoksia lisämunuaisessa ja tutkia tämän vaikutuksen taustalla olevaa mekanismia.

Materiaalit ja menetelmät:Neljäkymmentä urospuolista albiinorottaa jaettiin 4 ryhmään (n=10): kontrolli-, CUMS-, fluoksetiini- ja CP-käsitellyt ryhmät. Muutokset käyttäytymisessä, kortikosteronitaso, tulehdusta edistävät sytokiinit TNF- ja IL-6 sekä hapetin/antioksidanttiprofiili arvioitiin seerumissa kokeen lopussa. Lisämunuaiset käsiteltiin histopatologista ja immunohistokemiallista arviointia varten. Kaspaasin-3 ja Ki67:n ja lämpösokkiproteiinin 70 (HSP70) geeniekspressio arvioitiin lisämunuaisissa RT-PCR:llä.

Tulokset:CP-uute vähensi merkittävästi kortikosteronitasoa (p < {0}},001),="" liikkumattomuusaikaa="" (p="">< 0,001)="" sekä="" cums:n="" aiheuttamaan="" masennukseen="" liittyviä="" tulehduksellisia="" ja="" oksidatiivisia="" muutoksia="" verrattuna="" hoitamattomaan="" ryhmään.="" cp-uute="" lievitti="" cums:n="" aiheuttamia="" lisämunuaisen="" histopatologisia="" muutoksia="" ja="" vähensi="">apoptoosi(p < 0.001) ja huomattavasti ylöspäinantioksidanttitasot seerumissa.

Johtopäätös:Cucurbita pepo L. paransi tehokkaasti kroonisen stressin aiheuttamia käyttäytymis-, biokemiallisia ja lisämunuaisen rakenteellisia muutoksia lähinnä sen kautta.antioksidanttija tulehdusta estäviä vaikutuksia.

Avainsanat: kurpitsa, stressi, masennus, kaspaasi-3, ki67, Hsp70,apoptoosi

Cistanchella, kiinalaisella yrtillä, on antioksidanttitoiminto.

JOHDANTO

Yli 264 miljoonaa kaiken ikäistä ihmistä kärsii masennuksesta kaikkialla maailmassa (WHO, 2020). Masentuneen henkilön suorituskyky on yleensä huono koulussa, työssä ja perheessä. Masennus voi johtaa itsemurhaan; joten sitä pidetään toiseksi yleisimpänä kuolinsyynä 15-–29--vuotiaiden välillä (WHO, 2020). Nisäkkäät voivat selviytyä stressaavista tapahtumista aktivoimalla asianmukaiset fysiologiset vasteet näihin tapahtumiin. Lisämunuainen on osa hypotalamus-aivolisäke-lisämunuaiskuoren (HPA)-akselia ja sympatia-adrenomedullaari-akselia, joka ylläpitää homeostaasia stressin aikana (Ulrich-Lai et al., 2006). On raportoitu, että altistuminen lämpörasitukselle johtaa HSP70:n nopeaan ilmentymiseen lisämunuaiskuoressa (Huang et ai., 2001). Nämä proteiinit jakavat solunsisäisen kuljetuksen, antigeenin esittelyn,apoptoosija monia muita toimia (Khar et al., 2001). On kuvattu, että eksogeenisilla hormoneilla tai endogeenisten hormonien häiriöillä kriittisten kehityskausien aikana voi olla pysyviä vaikutuksia hypotalamuksen neuroendokriinisten kiertojen säätelemiin fysiologisiin ja käyttäytymisreitteihin (Gore ja Patisaul, 2010). Neuroendokriinisen häiriön kuvattiin myös laajentavan endokriinisen häiriön käsitettä. sisältää integratiivisen fysiologian täyden laajuuden; siksi se on enemmän kuin hormonaalista häirintää (Waye ja Trudeau, 2011).

Neuroendokriinisen säätelyn, aineenvaihdunnan ja ruokavalion/mikrobiotan muutosten katsotaan laukaisevan tulehdusta ja taipumusta masennuksen kehittymiseen (Huang et al., 2019). Oletuksena oli, että masennuksella – yhdellä neuropsykiatrisista häiriöistä – ja tulehduksella on kaksisuuntainen suhde. Vaikka masennus edistää tulehdusreaktioita, tulehdus edistää neuropsykiatrisia häiriöitä, mukaan lukien masennusta (Bauer ja Teixeira, 2019).

Fluoksetiini, klassinen masennuslääke, on yksi markkinoilla olevista masennuksen hoitoon tarkoitetuista lääkkeistä. Sitä pidetään nykyään nousevana neuroendokriinisena aineena. Tämä fluoksetiinin vaikutus on pikemminkin sivuvaikutus kuin nisäkkäiden tärkein terapeuttinen kohde (León-Olea et al., 2014). Siksi tarvitaan turvallisempia masennuslääkkeitä, joilla ei ole sivuvaikutuksia sitten euroendokriiniseen tilaan.

Kurpitsat(Cucurbita pepo L.) ovat taloudellisesti tärkeitä lajeja, joita viljellään maailmanlaajuisesti. Niillä on ravitsemuksellisia ja terveydellisiä etuja, koska ne sisältävät runsaasti fenoleja, flavonoideja, aminohappoja, hiilihydraatteja ja vitamiineja (Wang et al., 2002). Useat tutkimukset paljastivat, että kurpitsoilla on laaja biologinen aktiivisuus, kuten diabeteslääke, syöpää,antioksidantti, tulehdusta, väsymystä ja masennuslääkettä muistuttavia vaikutuksia (Wang et al., 2012; Zhanget al., 2012; Nawirska-Olszańska et al., 2013; Kim Nr et al., 2016). Perinteinen lääketiede on pääasiassa ayurvedaa järjestelmät ja kiinalainen lääketiede ovat käyttäneet kurpitsan eri osia, mukaan lukien hedelmien ja siementen lihaa (Perez Gutierrez, 2016). Sweetme Sweet Pumpkinin (SSP) ja Cucurbita moschata Duchin masennuslääketehoa testattiin aiemmin in vivos -tutkimuksessa pakkouintitestillä (FST) indusoidulla masennuksen eläinmallilla ja sitä verrattiin fluoksetiiniin (Kim Nr et al., 2016). Yhdessä suhteellisen äskettäin tehdyssä katsauksessa tiivistettiin, että masennuslääkkeiden, kuten kurpitsansiementen, masennuslääkkeiden pistemäärä oli 47 prosenttia, mikä tarjosi sen masennuslääkkeen kaltaisen vaikutuksen (Lachance ja Ramsey, 2018). Äskettäin Dotto ja Chacha tukivat enemmän eläin- ja kliinisiin kokeisiin perustuvia tutkimuksia vahvistaakseen kurpitsansiementen parantavaa vaikutusta masennukseen (Dotto ja Chacha, 2020).

Nämä raportit rohkaisivat testaamaan tuotteen tehokkuuttakurpitsatlievittää kroonisen stressin vaikutuksia lisämunuaisiin. Siksi tämä tutkimus suoritettiin, jotta voidaan arvioida Cucurbita pepo L. (CP) -uutteen oraalisen annon vaikutusta kroonisen arvaamattoman lievän stressin (CUMS) aiheuttaman käyttäytymis-, biokemiallisen ja lisämunuaisen rakenteen lievittämiseen ja tämän vaikutuksen taustalla olevan mekanismin tutkimiseksi.

aavikon sistansiuute: Antioksidantti

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Kurpitsan uuttaminen ja annostelu

Cucurbita pepo L. (kuponginäyte: AQJ_95) ostettiin paikallisilta markkinoilta Jeddasta, Saudi-Arabiasta. Ne tunnistettiin King Abdulazizin yliopistoherbariumissa käyttämällä herbaarionäytteitä ja KSA:n kasvistoa (Chaudhary, 2001). Lahjakorttinäytteet talletettiin herbaarioon. Kirjoittajat tunnistivat CP:n ja sen vahvisti kasvitieteilijä KingAbdulazizin yliopiston luonnontieteellisestä tiedekunnasta.

CP:n uuttaminen tehtiin aikaisempien tutkimusten mukaan (Wang et al., 2012). Raa'at hedelmät kuorineen leikattiin viipaloijalla ja kuivattiin kylmäkuivaimella (FD5508; ilShinBioBase Co.,Ltd., Korea) ja murskattiin sitten sähköisellä hiomakoneella. Jauhe seulottiin 40-verkkoseulan läpi hienoksi jauheeksi ja varastoitiin ilmatiiviiseen astiaan. Kuivattu jauhe (50 g) sekoitettiin 450 ml:aan 80-prosenttista etanolia ja jätettiin 1 päiväksi 37 asteeseen ravistimessa (JSSI-100T; JS Research Inc., Compact ShakingIncubator., Korea) ja sitten suodatettiin. puuvillalla ja suodatinpaperilla toisena päivänä. Tämä uuttoprosessi toistettiin kahdesti 37 asteessa etanoliuutteen saamiseksi.

CP:n ainesosien tunnistaminen

PE:n kemiallinen koostumus analysoitiin käyttämällä kaasukromatografiaa GC-TSQ evo 8000 massaspektrometriä (ThermoScientific, Austin, TX, Yhdysvallat) suoralla kapillaarikolonnilla TG-5MS (30 m × kalvon paksuus 0,25 mm × 0,25 µm). Kolonniuunin lämpötila asetettiin aluksi 50 asteeseen ja nostettiin sitten 5 astetta/min 250 asteeseen ja pidettiin 2 minuuttia ja nostettiin sitten lopulliseen lämpötilaan 300 astetta 25 astetta/min ja pidettiin 2 minuuttia. Injektorin ja MS-siirtolinjan lämpötilat pidettiin 270 ja 260 asteessa, vastaavasti; heliumia käytettiin kantokaasuna vakiovirtausnopeudella 1 ml/min. Liuottimen viive oli 4 minuuttia, ja laimennetut 3 ul:n näytteet injektoitiin automaattisesti käyttämällä Autosampler AS1300 -laitetta, joka oli kytketty GC:hen splitless-tilassa PTV-injektorissa. EI-massaspektrit kerättiin 70 eVionisaatiojännitteellä alueella m/z 50–650 täydessä skannaustilassa. Ionilähteen lämpötila asetettiin 250 asteeseen. Komponentit tunnistettiin vertaamalla niiden massaspektrejä WILEY 09:n ja NIST 14:n massaspektritietokannan massaspektreihin, joita käytetään tunnistamaan ja tutkimaan tuntemattomien komponenttien kemiallista koostumusta missä tahansa uutteessa (Wiley, 2006; Mikaia et al., 2014). Analyysi oli tehty epäkvalitatiivisesti käyttäen Thermo Scientific™ Xcalibur™ 2.2 -ohjelmistoa, ja kaikki arvot on raportoitu suhteellisissa prosenteissa (Abd El-Kareem et al., 2016).

Kokeellinen suunnittelu

Tämän tutkimuksen hyväksyi Biomedical Research Ethics Committee lääketieteellisessä tiedekunnassa, King Abdulaziz University, Jeddah, KSA (viitenumero {{0}}). Tässä tutkimuksessa 40 urospuolista albiinorottaa, jotka painoivat 150–200 g ja olivat iältään 2–3 kuukautta, hankittiin King Fahd MedicalResearch Centeristä (KFMRC). Ennen kokeen aloittamista rottien annettiin tottua laboratorio-olosuhteisiin viikon ajan. Kymmenen rottaa nimettiin kontrolliryhmäksi, jotka jätettiin altistamatta CUMS:lle. Muut kolmekymmentä rottaa altistettiin CUMS-menettelylle 4 viikon ajan, joka sisälsi erityyppisiä stressitekijöitä eri aikoina vuorokauden aikana stressiin tottumisen estämiseksi. CUMS-menettely on kuvattu täydellisesti aiemmissa töissä (Ayuob et al., 2016; Ali et al., 2017) ja se on esitetty taulukossa 1. CUMS:lle altistetut rotat jaettiin 3 ryhmään (n 10). Käsittelemätön ryhmä (CUMS) sai vehikkeliä 0,03 % karboksimetyyliselluloosaa (CMC-Na) letkuruokinnalla 2 viikon ajan. FLU:lla hoidettu ryhmä sai FLU:ta (Dar Al Dawa Pharmaceuticals Co., Ltd., Amman, Jordania), masennuslääkettä, jota käytettiin farmakologiseen validointiin, liuotettuna 0,03-prosenttiseen CMC-Na-annokseen 20 mg/kg mahaletkulla (Li et ai. , 2014). CP-käsitelty ryhmä sai CP-uutetta tislattuun veteen liuotettuna annoksella 100 mg/kg letkuruokinnalla 2 viikon ajan Wang et ai. (2012).

Käyttäytymismuutosten arviointi

FST suoritettiin 4 viikon kuluttua CUMS:n vaikutuksen vahvistamiseksi rotille (Ali et al., 2017). Tämän testin aikana jokainen rotta laitettiin lasimaiseen sylinterimäiseen astiaan (korkeus 20 cm, halkaisija 14 cm), jossa oli 15 cm vettä 25 ± 2 asteessa. Rotta videoitiin 6 minuuttia käyttämällä käyttäytymisohjelmistoa (Noldus InformationTechnology, EthoVision XT®), ja koeryhmille sokea teknikko mittasi 6 minuutin aikana liikkumattomana vietetyn kokonaisajan. Kokonaisaika sekunteina, jonka rotat viettivät ilman raajan liikettä, lukuun ottamatta pientä liikettä, joka oli tarpeen hiiren pitämiseksi pinnalla "liikkumattomuusaika" 6 minuutin aikana.

Biokemialliset tekniikat

Kaksikymmentäneljä tuntia käyttäytymistestin päättymisen jälkeen otettiin verinäytteitä rottien silmäkuopan poskiontelosta sen jälkeen, kun ne oli nukutettu 4-prosenttisella isofluraanilla (SEDICO PharmaceuticalsCompany, Kairo, Egypti) 100-prosenttisessa hapessa. Sen jälkeen rotat lopetettiin kohdunkaulan dislokaatiolla. Verinäytteitä sentrifugoitiin nopeudella 3, 000 rpm 15 minuuttia 4 asteessa seerumin saamiseksi ja pidettiin -18 asteessa biokemiallista arviointia varten.

Kortikosteronin taso (ALPCO Diagnostics, Orangeburg, NY, Yhdysvallat) arvioitiin käyttämällä entsyymi-immunosorbenttimäärityspakkauksia valmistajan ohjeiden mukaisesti. Valmistajan ohjeiden mukaan TNF- ja IL-6 (Quantakin R&D system, USA Kit) arvioitiin käyttämällä entsyymi-immunosorbenttimääritystä. Kunkin näytteen optinen tiheys määritettiin kahtena rinnakkaisena mikrolevy-ELISA-lukijalla, joka oli asetettu 450 nm:iin.

Tiobarbituurihapporeaktiivisten aineiden (TBARS) määrityssarjaa (Biodiagnostic; Egypti) käytettiin malondialdehydin (MDA) tason mittaamiseen spektrofotometrisesti 535 nm:ssä (Gamal et al., 2018). Superoksididismutaasin (SOD) taso mitattiin käyttämällä SOD-määrityssarjaa (Biodiagnostic; Egypti) (Packer, 2002). Glutationiperoksidaasin (GPX) tason arviointi suoritettiin käyttämällä GPX-sarjaa (Randox Labs, Crumlin, Yhdistynyt kuningaskunta). Katalaasin (CAT) aktiivisuuden kvantifioimiseksi määrityksiä ja kaikkia näytteitä varten luotiin kalibrointikäyrä käyttämällä määrityssarjoja (Biodiagnostic; Egypti). Menetelmä on kuvattu aiemmin (Gamal et al., 2018).

autiomaahansikkauutteen edut: tulehdusta ehkäisevä

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

RNA:n uuttaminen kudosnäytteistä tehtiin käyttämällä TriFast™-reagenssia (PeqLab, Saksa, luettelonumero: 30-2010), kuten valmistajan protokollassa on kuvattu. Puhdistetun RNA:n pitoisuus arvioitiin käyttämällä NanoDrop 2000 -spektrofotometriä (Thermo Scientific, Yhdysvallat). Kustakin näytteestä uutettu RNA käänteistranskriptoitiin SensiFAST™ cDNA-synteesisarjalla RT-qPCR:ää varten (Bioline USA Inc., Yhdysvallat, luettelonumero: BIO-65053) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Syntetisoitu cDNA säilytettiin -80 asteessa qRT-PCR:ään asti.

QRT-PCR-reaktiot suoritettiin käyttämällä SensiFAST™ SYBR Lo-ROX -pakkausta (Bioline USA Inc., Yhdysvallat, luettelonumero: BIO-94002) Applied Biosystems 7500realissa. -time-PCR-tunnistusjärjestelmä (Life Technology, Yhdysvallat). Tässä tutkimuksessa käytetyt geenispesifiset alukkeet rotille suunniteltiin Primer3-ohjelmistolla (v.0.4.0), ja niiden spesifisyys tarkistettiin NCBI/Primer-BLAST-ohjelmalla. Pohjusteet ostettiin sitten Willowfort™:lta (Yhdistynyt kuningaskunta). Alukkeet olivat GAPDH (5′-TGCACCACCACTGCTTAGC-3′, 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′), kaspaasi-3 (eteenpäin 5- TGTATG} {{1CCTACCTTAG{19CCCTACCTAG{10} 20}}GCGCAAAGTGACTGGATGAACC-3), HSP70 (5′-ACGAGGGTCTCAAGGGCAAG-3′, 5′-CTCTTTCTCAGCCAGCGTGTTAG-3′).

Ki67 (eteenpäin 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA-3, taaksepäin 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA 3). PCR-seos valmistettiin seuraavasti: 10 µl SensiFASTTM SYBRLo-ROX -seosta, 0,8 µl eteenpäin-aluketta, 0,8 µl käänteisaluketta, 2 µl templaatti-cDNA:ta ja 6,4 µl nukleaasivapaata vettä. Reaktioseos siirrettiin lämpökiertolaitteeseen, joka oli aiemmin ohjelmoitu pitämään 95 astetta 2 minuuttia, mitä seurasi 40 sykliä 95 astetta 15 s ja sitten 60 astetta 30 s. Jokaisessa kokeessa ajettiin negatiivinen kontrollireaktio, joka ei sisältänyt templaattia.

Sulamiskäyräanalyysi suoritettiin PCR-tuotteiden spesifisyyden osoittamiseksi, ja kunkin reaktion Ct-arvo saatiin amplifikaatiokaavioista. Suhteellinen kvantifiointi kullekin geeniekspressiolle kudosnäytteissä laskettiin käyttämällä vertailevaa kynnys (ΔΔCt) menetelmää GAPDH:n ollessa sisäisenä kontrolligeeninä. Kokonaiskerroinmuutosta varten se laskettiin ja linearisoitiin 2-ΔΔCt aritmeettisella kaavalla.

Histologiset tekniikat

Kokeen lopussa ja sen jälkeen, kun rotat oli nukutettu, vatsa avattiin ja oikea lisämunuainen leikattiin pois. Parafiinilohkojen saamiseksi suoritettiin lisämunuaisen kiinnitys 10-prosenttisessa neutraalissa puskuroidussa formaliinissa ja lisäprosesseja. Valmistettiin 4-μm paksut parafiinileikkeet ja värjättiin hematoksyliini-eosiinilla (H&E). Lisäksi muut parafiinileikkeet värjättiin immunohistokemiallisesti käyttämällä streptavidiini-biotiini-peroksidaasitekniikkaa. Objektilaseja inkuboitiin yön yli 4 asteessa, ja sitten niitä inkuboitiin monoklonaalisen anti-Ki67:n kanssa (Dako Cytomation, Yhdysvallat, laimennussuhteessa 1:1, 000) ​​solujen lisääntymisen osoittamiseksi. Lisäksi polyklonaalista anti-kaspaasi{10}}-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Yhdysvallat, laimennussuhteessa 1:1,000) käytettiin havaitsemaanapoptoosi. Lämpösokkiproteiinia -70 (HSP70) (Dako, Carpinteria, CA, Yhdysvallat, laimennussuhteessa 1:1,000) vastaan ​​tarkoitettua polyklonaalista ainetta käytettiin myös. Käytettiin vastaavaa biotinyloitua konjugoitua sekundaarivasta-ainetta Dako-värjäysjärjestelmästä. Ainoastaan ​​sekundaarisella vasta-aineella värjättyjä objektilaseja käytettiin negatiivisina kontrolleina.

Tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä. Brownsytoplasmista värjäystä pidettiin positiivisena reaktiona. Värjättyjä leikkeitä tutkittiin ja valokuvattiin käyttämällä Olympus Microscope BX{{0}} -laitetta (Olympus), joka oli yhdistetty digitaalikameraan ja tietokoneeseen. Vasta-aineimmunoreaktiivisuuden semikvantitatiivinen analyysi suoritettiin Pro Plus -kuvaanalyysiohjelmistolla. Immunopositiivisen reaktion prosenttiosuus arvioitiin 30 kentässä × 400 suurennuksella. Positiiviset solut laskettiin 1,0 mm2 pinta-alaa kohti, kuten Zhou et ai. (2016). Jokaisesta objektilasista tutkittiin vähintään viisi kenttää, ja keskiarvo laskettiin kullekin eläimelle.

Morfometristä analyysiä varten jokaisesta eläimestä tutkittiin neljä leikettä (suurennus x 100). Lisämunuaisen eri vyöhykkeiden paksuus mitattiin mikrometreinä. Lisämunuaiskuoren paksuus saatiin mittaamalla ytimen ja lisämunuaisen kapselin välinen etäisyys suorassa linjassa, yksi mittaus tehdään jokaisesta lisämunuaiskuoren kvadrantista.

Tilastollinen analyysi

Käyttäytymis-, biokemialliset ja immunohistokemialliset tiedot analysoitiin Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) -versiolla 16. Tutkimusmuuttujiin vaikutti kaksi riippumatonta tekijää: stressialtistus ja hoito. Siksi suoritettiin analyysi käyttämällä sekamallin kaksisuuntaista ANOVAa, joka perustui Bonferroniin post hoc. Tilastollinen merkitsevyys otettiin huomioon p <>

autiomaavesisäiliön edut: ikääntymistä estävä

TULOKSET

Käyttäytymistulokset

Liikkumattomuusaika FST:n aikana oli merkittävästi korkeampi (p{0}}.03) CUMS-ryhmässä kuin kontrolliryhmässä, kun taas se oli merkittävästi pienempi (p=0.01, p{4}}.001) FLU- ja CP-käsitellyissä ryhmissä kuin CUMS-ryhmässä (kuva 1A).

CP-uutteen analyysin tulokset GC-MS:llä

Pääasiallisia CP:ssä havaittuja yhdisteitä ovat pääasiassa öljyhappo (noin 56 prosenttia), palmitiinihappo (noin 8,9 prosenttia), linoleenihappo 3,5 prosenttia ja linolihappo 2,8 prosenttia monien muiden yhdisteiden lisäksi (taulukko 2; kuva 2). CP:n yhdisteistä, joilla on raportoitu olevan anti-inflammatorinen vaikutus, ovat öljyhappo, palmitiinihappo, linoleenihappo, betuliini ja linolihappo, kun taas ne, joilla onantioksidanttivaikutus ovat palmitiinihappo, 10-oktadekeenihappo ja metyyliesteri.

Biokemiallinen arviointi

Kortikosteronitaso seerumissa

Kortikosteronitaso nousi merkitsevästi (p < {0}},001) hoitamattomilla CUMS:lle altistuneilla rotilla verrokkirottia vastaan, kun taas FLU:lla ja CP:llä hoidetuilla seerumin kortikosteronitaso oli alentunut merkittävästi (p < 0,001). CUMS:lle altistuneiden hoitamattomien rottien tasoon verrattuna (kuvio 1B).

TNF- ja IL-6-tasot seerumissa

Kokeen lopussa seerumin TNF- ja IL-6-arvojen arviointi osoitti, että ne olivat merkittävästi koholla (p < 0,001) CUMS-ryhmässä, kun taas ne osoittivat merkittävää laskua (p< 0.001)="" in="" flu-="" and="" cp-treated="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" rats="" exposed="" to="" cums="" (figures="" 1c,="">

MDA-, SOD-, GPX- ja CAT-tasot seerumissa

Havaittiin, että seerumin MDA-taso oli merkitsevästi korkeampi (p < {0}},001)="" cums-ryhmässä="" kuin="" kontrollirotissa,="" kun="" taas="" cp-käsitellyissä="" ryhmissä="" oli="" merkittävästi="" alhaisempi="" (p="" 0,003).="" kuin="" hoitamattomilla="" cums:lle="" altistetuilla="" rotilla.="" flu:n="" antaminen="" ei="" voinut="" merkittävästi="" vähentää="" cums:lle="" altistuneiden="" rottien="" mda-tasoa="" (kuvio="">

Sitä vastoin SOD-, GPX- ja CAT-tasot CUMS-ryhmän seerumissa olivat merkittävästi alhaisemmat (p < {0}}.001,="" p="">< 0,001,="" p="0" 0,002)="" kuin="" kontrolliryhmän="" seerumissa,="" kun="" taas="" niiden="" tasot="" osoittivat="" merkittävää="" nousua="" (p="0,01," p="0,003," p="" 0,03)="" cp:llä="" hoidetussa="" ryhmässä="" verrattuna="" niihin.="" cums-exposed-ryhmässä.="" flu-annostelu="" ei="" voinut="" merkittävästi="" lisätä="" sod:ta,="" gpx:ää="" ja="" cat:tä="" rotilla,="" jotka="" altistettiin="" cums:lle="" (kuvat="">

Ki67:n, kaspaasin-3 ja HSP70:n geeniekspressio

RT-PCR paljasti merkityksettömän korkean Ki67-geenin ilmentymisen (p=0.14) CUMS-ryhmän lisämunuaisissa verrattuna kontrolliryhmään, kun taas FLU- ja CP-käsiteltyjen ryhmien ekspressio oli merkitsevästi korkea (p {{6). }}.02, p 0.01) verrattuna CUMS-altistetun ryhmän ryhmään (kuva 3E). Kaspaasin-3 geeniekspressio lisääntyi merkittävästi (p < 0,001) CUMS-ryhmän lisämunuaisissa verrokkiryhmään verrattuna, kun taas FLU- ja CP-hoidetuissa ryhmissä osoitti merkittävää laskua (p=0,03, p=0,04) verrattuna CUMS-altistetun ryhmän vastaavaan (kuva 3F). Mitä tulee HSP70-geenin ilmentymiseen, se kirjasi merkittävästi korkeampia (p < 0,001) tasoja CUMS-ryhmän lisämunuaisissa kuin kontrolliryhmässä, kun taas FLU- ja CP-käsitellyt ryhmät osoittivat merkityksetöntä laskua (p=0,07, p=0,08) verrattuna CUMS-altistettuun ryhmään (kuva 3G).

Histopatologinen arviointi

Kontrollirottien lisämunuaisissa on ehjä rakenne, ja aivokuoren arkkitehtuuri on säilynyt, mukaan lukien zona glomerulosa, zona fasciculata ja zona reticularis sekä ydin (kuvio 4). CUMS-altistuneiden rottien lisämunuaiset osoittivat monia soluja ZG-, ZF- ja ZR-soluissa, joissa oli ilmeistä tyhjiötä ja rappeutuneita ytimiä ja joskus syvälle värjäytyneitä ytimiä, joissa kapselissa ja sidekudostrabeculeissa oli kohtalaista paksuuntumista. Monet ZR:n solut näyttivät tummilta ruskealipofuskiinipigmenttien kanssa. Toisaalta CP-käsiteltyjen rottien lisämunuaisissa oli vähemmän selvästi vakuoloituneita soluja ja syvään värjäytyneitä ytimiä ZG:ssä, ja ZF ja ZR paljastivat vähän tummia soluja.

Morfometriset mittaukset osoittivat, että ZG:n ja ZR:n paksuus osoitti merkityksetöntä lisäystä CUMS-altistuksen jälkeen, kun taas ne lisääntyivät merkittävästi FLU- (p 0.01,p 0.02) ja CP-käsitellyt ryhmät (p=0.02, p=0.001), vastaavasti. Mitä tulee ZF:n paksuuteen, se kasvoi merkittävästi (p 0,02) CUMS:lle altistuneessa ryhmässä, ja se kasvoi edelleen, mutta merkityksettömästi, FLU- ja CP-käsitellyissä ryhmissä verrattuna käsittelemättömään CUMS-ryhmään.

Sen määrittämiseksi, rajoittuiko solujen hyperplasia lisämunuaisen tiettyyn osa-alueeseen, käytettiin Ki67:n (jakautuvan solun merkki) immunohistokemiallista leimaamista. Ki67-positiivisesti lisääntyvien solujen määrä lisääntyi merkitsevästi (p < 0.001)="" zf:ssä="" cums-altistuksen="" jälkeen,="" kun="" taas="" flu-="" ja="" cp-hoito="" lisääntyi="" merkittävästi="" verrattuna="" käsittelemättömään="" cums-ryhmään.="" vaikka="" proliferoituvien="" solujen="" määrä="" lisääntyi="" merkityksettömästi="" zg:ssä="" ja="" zr:ssä="" ja="" väheni="" merkityksettömästi="" cums-ryhmän="" ydinytimessä="" verrattuna="" kontrolliryhmään,="" flu-="" ja="" cp-hoito="" lisäsi="" merkittävästi="" lisääntyvien="" solujen="" määrää="" zg:ssä="" (p="0.001)." ,="" p="0.003)," zr="" (p="">< 0.001)="" ja="" ydin="" (p="0.004," p="0.003)" verrattuna="" käsittelemättömään="" cums-ryhmään="" (kuvat="" 4,="">

Arviointia varten suoritettiin immunohistokemiallinen värjäys kaspaasilla-3apoptoosi(Kuva 6). Havaittiin, että kaspaasin-3 ilmentymisen prosentuaalinen pinta-ala kasvoi merkittävästi (p < 0.001)="" kaikilla="" rauhasen="" alueilla="" cums-altistuksen="" jälkeen="" 4="" viikon="" ajan="" vuonna="" verrattuna="" kontrolliryhmään.="" cp:llä="" hoidetussa="" ryhmässä="" kaspaasin="" -3ekspressio="" väheni="" merkittävästi="" zg:ssä="" (p="">< 0,001),="" zf:ssä="" (p="">< 0,001),="" zr:ssä="">< 0.001,="" p=""
="" 0.005),="" and="" medulla="" (p="0.004," p="0.001)," in="" comparison="" to="" that="" of="" the="" cums="" group="" (figures="">

HSP70:n ilmentymisen pinta-alaprosentti nousi merkitsevästi (p < 0,001) CUMS-ryhmän kaikilla aivokuoren vyöhykkeillä sekä lisämunuaisen ytimessä verrattuna kontrolliryhmään, kun taas se pieneni merkityksettömästi kaikki FLU- ja CP-käsiteltyjen ryhmien vyöhykkeet ja ydin verrattuna CUMS-ryhmään (kuvat 5).

Kuivatut Cistanche tubulosa -viipaleet

KESKUSTELU

Moderni yhteiskunta on ilmeisesti täynnä stressiä, joka voi johtua päivittäisistä ongelmista, terveydenhuollosta ja työhön liittyvistä ongelmista. Nämä stressitekijät voivat aiheuttaa niin kutsuttuja stressiin liittyviä häiriöitä (Clayton jaMccance, 2014). Tässä tutkimuksessa Cucurbita pepo L.:n lihasta ja kuoresta saatua etanoliuutetta käytettiin tutkimaan sen potentiaalia CUMS:n aiheuttaman masennuskäyttäytymisen lievittämisessä ja sen vaikutusta lisämunuaiseen. Tämän todisti seerumin kortikosteronitason merkittävä nousu ja pitkittynyt liikkumattomuusaika FST:n aikana. Nämä havainnot olivat yhdenmukaisia ​​aiemmin raportoitujen kanssa (Tang et al., 2015).

Sekä TNF- että IL-6 raportoitiin osallistuvan masennuksen patogeneesiin (Taraz et al., 2015; Pedraz-Petrozziet al., 2020). On raportoitu, että hiiret, joista puuttuu IL-6 tai TNF-reseptoreita, ovat resistenttejä masennuskäyttäytymiselle (Viana et al., 2010). Siksi niitä arvioitiin tässä tutkimuksessa ja havaittiin, että sekä TNF- että IL{ {9}} lisääntyivät merkittävästi näissä rotissa, jotka altistettiin CUMS:lle 4 viikon ajan, mikä osoitti, että ne olivat masentuneita. Tätä havaintoa tukivat Numakawa et ai. (2014) käyttäytymishäiriöstä kärsivillä hiirillä ja Taraz et al. (2015) masennuspotilailla.

Tässä tutkimuksessa kurpitsauutteen antaminen yhdistettiin masennuskäyttäytymisen paranemiseen, mikä kävi ilmi FST:n liikkumattomuuden ajan merkittävästä lyhenemisestä ja vahvistui inkortikosteronin ja tulehduksellisten sytokiinien TNF- ja IL-6 merkittävänä vähenemisenä seerumissa. Näitä havaintoja tukivat Kim Nr et ai. (2016), joka raportoi, että SSP 28 päivän ajan alensi tulehduksellisten sytokiinien tasoa masentuneilla rotilla. Anti-inflammatorinen aktiivisuuskurpitsavoidaan johtua kurpitsan aktiivisista yhdisteistä, kuten öljy- ja palmitiinihapoista ja estradiolista.

Öljyhapon, palmitiinihapon ja linolihapon säätelyä on kuvattu masennuksessa (Conklin et al., 2010; Martín et al., 2010). On raportoitu, että öljyhappovälitteinen neuroprotektio liittyy sen anti-inflammatoriseen vaikutukseen, jota välittää peroksisomiproliferaattorilla aktivoitu gamma-reseptori (PPAR-) aktivaatio (Song et al., 2019). Tämän lisäksi palmitiinihapon raportoitiin inhiboivan fosfolipaasi A(2):ta ja siksi. pidetään anti-inflammatorisena yhdisteenä (Aparna et al., 2012). Estradioli oli yksi tässä tutkimuksessa havaituista kurpitsan yhdisteistä. Estradiolin on raportoitu aiheuttavan anti-inflammatorista vaikutusta ja myöhemmin lievittävän masennuskäyttäytymistä (Xu et al., 2015). Toinen mekanismi, jolla estradioli voi aiheuttaa masennusta lievittävän vaikutuksen, on masennusta ehkäisevä vaikutus. aivoista peräisin olevan neurotrofisen tekijän (BDNF) ilmentyminen ja ERK-fosforylaatio aktivoimalla ER- aivoissa (Yang et al., 2010).

Tässä tutkimuksessa seerumin MDA-taso nousi, kun taas SOD-, GPX- ja CAT-tasot laskivat CUMS-altistuneilla. Samanlaisia ​​muutoksia dokumentoitiin aiemmissa tutkimuksissa CUMS-altistuksen jälkeen, ja ne lisäsivät, että nämä biokemialliset muutokset johtivat oksidatiiviseen stressiin ja HPA:n heikkenemiseen (Nabavi et al., 2015). Liu T. et ai. (2015) raportoivat myös, että masennuksen kehittyminen saattaa johtua kehon alhaisesta antioksidanttipitoisuudesta. Sen antioksidanttiset ominaisuudetkurpitsahedelmäuutteita on raportoitu usein (Bahramsoltani et al., 2017). Lisäksi Cucurbita pepo L.:n lihankuoren raportoitiin prosessoivan korkeampaa antioksidanttiaktiivisuutta kuin muilla osilla, esimerkiksi siemenillä (Oyeleke et al., 2019). Kurpitsauutteen antaminen, useat aiemmat tutkimukset, nosti merkittävästi SOD- ja GPX-tasoja ja vähensi MDA:ta hiirten seerumissa (Guo-Huaet al., 2000; Dang, 2004), ja tämä vaikutus dokumentoitiin myös tässä tutkimuksessa. SiksiantioksidanttiKurpitsan aktiivisuus saattaa olla sen masennuslääkevaikutuksen takana, joka on ilmeinen tässä tutkimuksessa. Tämä on linjassa Kim Nrin et al. (2016). On raportoitu, että luonnolliset tuotteet, joilla on tulehdusta estävät,antioksidantti, ja väsymystä ehkäisevillä vaikutuksilla on myös masennuslääkkeen kaltainen vaikutus (Jeong et al., 2015). Kaikki nämä aiemmat toiminnot todistettiin vuonnakurpitsat.

Cistanchella on ikääntymistä estävä vaikutus

Lisämunuaiskuoren solujen lisääntynyt sytoplasminen vakuolaatio, joka havaittiin CUMS-ryhmässä tässä tutkimuksessa, saattaa johtua lipidien kasvavasta kysynnästä, jotka muodostavat kortisolin synteesin kulmakiven. Cigankova et ai. (2005) havaitsivat, että pitkäkestoinen kokeellinen hyperdynamiikka johti useiden aivokuoren solujen sytoplasmisten lipidipisaroiden yhteensulautumiseen. Nämä lipidipisarat sisältävät kolesterolia, joka on steroidihormonien synteesin pääasiallinen esiaste. Koldysheva ja Lushnikova (2008) raportoivat kuitenkin, että stressi johti lipidipisaroiden merkittävään vähenemiseen lisämunuaiskuoren soluissa, erityisesti ZF:ssä (Koldysheva ja Lushnikova, 2008). Kuvattiin, että fyysiselle rasitukselle altistuessaan kipuärsykkeet välittyvät hypotalamukseen, mikä johtaa CRH:n erittymiseen hypofyysiseen portaalijärjestelmään, mikä lisää ACTH:n eritystä ja stimuloi sen reseptoreita ZF:ssä ja ZR:ssä lisäämään kortisolin eritystä (Patti et al., 2018). CUMS:lle altistuneissa rotissa havaittu paksuuntunut lisämunuaiskupseli ja trabekulit raportoitiin aiemmin (El-Desouki et al., 2011; Altayeb ja Salem, 2017) fibroblastien lisääntyneen kollageenisynteesin seurauksena altistuessaan immobilisaatiostressille.

Monissa CUMS-altistuneiden rottien lisämunuaisten soluissa oli syvästi värjäytyneitä ytimiä, mikä osoitti, että niissä tapahtui apoptoosi, joka vahvistettiin kaspaasi-3-immunohistokemiallisella värjäyksellä. Samanlaisen havainnon raportoivat Altayeb ja Salem (2017), kun he tutkivat immobilisaatiostressin vaikutusta rottien lisämunuaisiin. Liu Q. et ai. (2015) raportoivat, että liiallinen oksidatiivinen stressi, joka on ilmeinen CUMS-altistuksen jälkeen tässä tutkimuksessa, muuttaa "apoptoosi-sukuisia geenejä" ja indusoi solujen apoptoosia ja degeneraatiota Bcl-2-, Bax- ja kaspaasi-3-signalointireittien kautta. Tämä mekanismi vahvistettiin tässä tutkimuksessa RT-PCR:llä, joka paljasti kaspaasi-3-geenin merkittävän lisääntymisen. Kirjallisuutta tarkasteltaessa Cucurbita pepolla ei ollut suoraa vaikutusta kaspaasi-3-välitteiseen apoptoosiin eri kudoksissa. Näyttää siltä, ​​että lisämunuaisissa havaittujen kaspaasi-3-positiivisten apoptoottisten solujen väheneminen johtuiantioksidanttiCucurbita pepon vaikutus on dokumentoitu tässä tutkimuksessa. Tätä tukevat monet aiemmat tutkimukset, jotka on tehty muista kasveista ja yrteistä, joilla on merkittäviä antioksidanttisia vaikutuksia (Banagozar Mohammadi et al., 2019; Ghazizadeh et al., 2020).

Tämä tutkimus osoitti, että altistuminen CUMS:lle lisäsi Ki67-positiivisten solujen määrää lisämunuaiskuoressa, mikä oli selvästi ilmeistä ZF:ssä, mikä osoitti lisääntyneiden solujen lukumäärän lisääntymistä, ja tämän seurauksena tämän kerroksen paksuus kasvoi merkittävästi. toisaalta Ki67-positiivisten lisääntyvien solujen määrä väheni merkityksettömästi ytimessä vasteena CUMS:lle. Nämä havainnot olivat linjassa Ulrich-Lain et al.:n (2006) havaintojen kanssa, jotka raportoivat Ki{{:n lisääntymisestä. 4}}positiiviset soluytimet vain ulommassa ZF:ssä krooniselle vaihtelevalle stressille altistumisen jälkeen, kun taas teemamedulla osoitti solujen liikakasvua eikä hyperplasiaa. Lisäksi Laborie et al., (2003) raportoivat yleisestä medullaarisen toiminnan lisääntymisestä krooniselle stressille altistumisen jälkeen, mikä viittaa siihen, että krooninen stressi voi johtaa medullarin liikakasvuun. Tässä tutkimuksessakurpitsauute lisäsi merkittävästi solujen lisääntymistä, mikä ilmenee Ki67-geenin lisääntymisestä ja immuuniekspressiosta lähes kaikilla lisämunuaisen alueilla ja ytimen CUMS:ään verrattuna. Tämä selitti tässä tutkimuksessa kirjattujen rauhasalueiden lisääntyneen paksuuden. Se voi myös kompensoida CUMS-altistuksen aiheuttamaa apoptoottista vaikutusta. Tätä havaintoa tukevat Kim Hy et ai. (2016) jotka raportoivat Ki67:n mRNA:n ilmentymisen merkittävästä lisääntymisestä ja BALB/c-hiirten pernasta eristettyjen pernasolujen lisääntymisen SSP:llä, streamedillä ja Cucurbita moschataDuchilla ja sen pääkomponentilla, karoteenilla.

Tässä tutkimuksessa altistuminen CUMS:lle lisäsi merkittävästi HSP70:n geenin ilmentymistä ja immuuniekspressiota kaikilla lisämunuaisen alueilla. Tämän mukaisesti Zheng et ai. (2008) osoittivat myös, että lisääntynyt HSP70:n ilmentyminen stressaaville olosuhteille altistumisen jälkeen moduloi tulehdusvasteita estämällä tulehduksellisen transkriptiotekijän, ydintekijä-kappa B:n (NF-kappaB) aktivoitumista. Lisäksi HSP70 voi suoraan häiritä apoptoosia ja nekroosia (Yenari et al., 2005). Viime aikoina Liet al. (2019) raportoivat HSP70:n ilmentymisen voimistumisesta sian lisämunuaiskudoksessa lämpöstressille altistumisen jälkeen, mikä osoittaa HSP70:n roolin lisämunuaisen vauriossa ja korostaa sen merkitystä tulehdusreaktioissa. HSP70:n nopeaa induktiota vasteena stressiin pidetään välttämättömänä solun suojaprosessille.

Tutkimuksessamme hoidettiin CUMS-altistuneita rottiakurpitsatliittyi HSP70:n ilmentymisen merkityksettömään vähenemiseen, joka liittyi vähentyneeseen apoptoosiin ja tulehdusvasteisiin. Tämä saattaa viitata sekä FLU:n että CP:n indusoiman suhteellisen korkean HSP70-tason suotuisaan vaikutukseen, mikä johti kaspaasin -3-välitteiseen vähenemiseen.apoptoosija tulehduksellisten sytokiinien vapautuminen. Vaikka kurpitsan vaikutusta lämpösokkiproteiiniperheeseen ei ole aiemmin kuvattu, öljyhappo, joka edustaa pääainesosiakurpitsatTässä tutkimuksessa käytettyjen aineiden kuvattiin alentavan HSP60:n ilmentymistä ihmisen T-lymfosyyttisolulinjassa (Martins De Lima et al., 2004), mikä tukee tutkimustuloksiamme. Cucurbita pepon masennuslääkettä muistuttavana aineena ehdotettu vaikutusmekanismi on esitetty yhteenvetona kuvassa 7. Tämän tutkimuksen rajoituksiin kuului kyvyttömyys tutkia CP:n masennuslääkevaikutuksen perusteellista mekanismia, ja siksi lisätutkimukset rohkaisivat tekemään niin. .

Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus tarjoaa tieteellistä näyttöä Cucurbita pepo L. -uutteen tehosta lievittää CUMS:n aiheuttamia käyttäytymis- ja biokemiallisia muutoksia sekä histopatologista vaikutusta lisämunuaisiin. Nämä vaikutukset ilmenivät alasääntelyn kauttaapoptoosija HSP70:n ilmentyminen ja näytti välittyvän sen kauttaantioksidanttija Cucurbita pepoL:n tulehdusta estävä vaikutus. ottaa talteen. Vaikka tämä tutkimus ja jotkut muut viimeaikaiset tutkimukset ovat dokumentoineet Cucurbita pepon masennuslääkettä muistuttavan vaikutuksen ja tutkineet sen mekanismia, tarvitaan lisätutkimuksia, mukaan lukien kliiniset tutkimukset, tämän vaikutuksen vahvistamiseksi ihmisillä.

Cistanche-rakeet