Hengitysteitse kuljetettava lyhytketjuinen rasvahappoasetaatti tehostaa virusten vastaista immuniteettia rinovirusinfektion aikana

Tausta: 

Mikrobiotalla tiedetään olevan tärkeä rooli immuniteetin säätelyssä immunomoduloivien metaboliittien, kuten lyhytketjuisten rasvahappojen (SCFA) vapautumisen kautta. Rinovirukset (RV:t) aiheuttavat ylempien hengitysteiden sairauksia ja aiheuttavat astman ja kroonisen obstruktiivisen keuhkosairauden pahenemista huonosti ymmärrettävien mekanismien kautta. Paikallisia vuorovaikutuksia SCFA:iden ja antiviraalisten immuunivasteiden välillä hengitysteissä ei ole aiemmin tutkittu.

Lyhytketjuiset rasvahapot (SCFA:t) ovat orgaanisia happoja, joita tuotetaan selluloosan ja muiden ravintokuitujen käymisessä suolistossa olevien hyödyllisten bakteerien toimesta. Tutkimukset ovat osoittaneet, että SCFA:illa on tärkeä vaikutus ihmisen immuunijärjestelmään.

Ensinnäkin SCFA:t voivat edistää suolen limakalvoesteen eheyttä ja parantaa suoliston estetoimintoa. Suolistoeste on ensimmäinen puolustuslinja suoliston ympäristön suojelemiseksi. Jos suolistoeste vaurioituu, haitalliset aineet voivat päästä suolen seinämän kautta verenkiertoon aiheuttaen tulehdusta ja epänormaalia immuunijärjestelmää. Tutkimuksissa on havaittu, että SCFA:t voivat parantaa suoliston esteen eheyttä ja vähentää suoliston tulehduksen riskiä edistämällä limakalvosolujen erilaistumista ja proliferaatiota, lisäämällä limakalvon paksuutta ja liman tuotantoa.

Toiseksi SCFA:illa on immuunisolujen säätelytehtävä. Tutkimukset ovat osoittaneet, että SCFA:t voivat edistää immuunisolujen erilaistumista ja lisääntymistä ja säädellä immuunisolujen toimintaa. SCFA:t voivat myös vähentää tulehduksellisten sytokiinien tuotantoa ja estää immuunisolujen toimintaa, mikä suojaa ihmisen immuunijärjestelmää. Muissa tutkimuksissa on myös havaittu, että SCFA:t voivat säädellä T-solujen toimintaa, lisätä autoimmuunitoimintaa ja olla tietyssä roolissa autoimmuunisairauksien ehkäisyssä ja hoidossa.

Lyhyesti sanottuna lyhytketjuisilla rasvahapoilla on tärkeä rooli ihmisen immuunijärjestelmän normaalissa toiminnassa. Meidän tulee kiinnittää huomiota kohtuulliseen ravinnon rakenteen yhdistelmään, jossa on runsaasti ravintokuitua, jotta voidaan lisätä hyödyllisten bakteerien määrää ja monimuotoisuutta suolistossa, mikä edistää SCFA:iden tuotantoa ja ylläpitää ihmisen immuunijärjestelmän vakautta ja terveyttä. Tästä näkökulmasta meidän on parannettava vastustuskykyämme. Cistanche voi parantaa merkittävästi vastustuskykyä, koska Cistanche on runsaasti erilaisia ​​antioksidantteja, kuten C-vitamiinia, C-vitamiinia, karotenoideja jne. Nämä ainesosat voivat poistaa vapaita radikaaleja ja vähentää oksidatiivista stressiä. Stimuloi ja parantaa immuunijärjestelmän vastustuskykyä.

Napsauta cistanche tubulosa -etuja

Tavoite:

Pyrimme tutkimaan, voiko keuhkojen metaboliitin manipulointi SCFA:iden keuhkoihin antamisen avulla moduloida antiviraalista immuniteettia RV-infektiota vastaan.

Menetelmät:

Tutkimme SCFA-asetaatin, butyraatin ja propionaatin intranasaalisen antamisen vaikutuksia antiviraalisten allekirjoitusten perusilmentymiseen ja asetaatin RV-infektion hiirimallissa ja RV-infektoituneissa keuhkojen epiteelisolulinjoissa. Arvioimme lisäksi asetaatin, butyraatin ja propionaatin vaikutukset RV-infektioon ihmisen erilaistuneissa primaarisissa keuhkoputkien epiteelisoluissa.

Tulokset:

Intranasaalinen asetaatin anto aiheutti IFN-b:n perussäätelyn, jota ei havaittu muilla SCFA:illa. Butyraatin aiheuttama RIG-I-ekspressio. Hiirten intranasaalinen asetaattihoito lisäsi interferonin stimuloimaa geeniä ja IFN-l:n ilmentymistä RV-infektion aikana ja vähensi keuhkojen viruskuormia 8 tunnin kuluttua infektiosta. Asetaatti paransi viruksen indusoimia proinflammatorisia vasteita heikennetyllä keuhkomusiinin ja IL-6:n ilmentymisellä, joka havaittiin päivänä 4 ja 6 infektion jälkeen. Tämä asetaatin interferonia tehostava vaikutus vahvistettiin ihmisen keuhkoputkien ja alveolaaristen epiteelisolulinjojen osalta. Erilaistuneissa primaarisissa keuhkoputkien epiteelisoluissa butyraattihoito moduloi paremmin IFN-b- ja IFN-l-geenin ilmentymistä RV-infektion aikana.

Johtopäätökset:

SCFA:t lisäävät antiviraalista immuniteettia ja vähentävät viruskuormaa ja proinflammatorisia vasteita RV-infektion aikana. (J Allergy Clin Immunol 2023; 151:447-57.)

Limakalvopinnoilla (mikrobiota) olevilla bakteeriyhteisöillä on keskeinen rooli immuunijärjestelmän homeostaasissa ja säätelemässä vastetta tulehduksellisiin ja tarttuviin tiloihin, mukaan lukien astma, paksusuolitulehdus sekä bakteeri- ja virusinfektiot.{0}} Bakteerien aineenvaihduntatuotteet, kuten lyhytketjuiset aineet. rasvahapot (SCFA), pääasiassa asetaatti, butyraatti ja propionaatti, ovat nyt hyvin tunnistettu linkki suoliston mikrobiston ja isäntäsolujen välillä.6,7 Näitä molekyylejä syntyy ravintokuitujen metabolian kautta suoliston mikrobiotan komponenttien toimesta. SCFA:illa on sekä paikallisia että systeemisiä vaikutuksia. Ne moduloivat immuunisolujen aktivaatiota ja toimintaa mekanismeilla, mukaan lukien G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (eli Gpr41, Gpr43 tai Gpr109a) aktivointi ja histonideasetylaasien estäminen, ja niiden on osoitettu edistävän limakalvojen homeostaasia ja suun sietokykyä. Äskettäin on kuvattu mikrobiotan olemassaoloa alemmissa hengitysteissä, ja uusia todisteita osoittavat, että hengityselinten kommensaalit ovat myös metabolisesti aktiivisia organismeja, jotka pystyvät tuottamaan metaboliitteja, joilla on immunomoduloivaa kykyä, kuten SCFA:ita.8 Siten SCFA:t joko vapautuvat paikallisesti keuhkojen mikrobiotosta tai suoliston mikrobiosta johdetuilla voi olla merkittävä rooli immuniteetin säätelyssä. SCFA:iden antiviraalinen vaikutus rinoviruksiin (RV:t) on kuitenkin tuntematon.

Matkailuautot ovat vastuussa valtavasta tartuntatautitaakasta maailmanlaajuisesti. Ne laukaisevat lieviä itsestään rajoittuvia vilustumista terveillä yksilöillä ja aiheuttavat pahenemisvaiheita henkilöillä, joilla on krooninen keuhkosairaus, kuten astma tai krooninen obstruktiivinen keuhkosairaus (COPD). Nämä sairaudet aiheuttavat huomattavia taloudellisia kustannuksia terveydenhuollon infrastruktuureille maailmanlaajuisesti. Tällä hetkellä ei ole olemassa tehokkaita hoitoja tai lisensoituja rokotteita retkeilytaudeille, koska serotyyppien/kantojen suuri kirjo on asettanut merkittäviä haasteita tutkimukselle.9 Siksi uusien ehkäisevien ja terapeuttisten lähestymistapojen kehittäminen RV-infektioihin on kiireellisesti tarpeen. Suoliston mikrobiomia voidaan manipuloida terapeuttisesti tarjoamaan kliinisiä etuja suoliston infektiosairauksille (esim. Clostridium difficile). Hengityselinten kommensaalien tai niihin liittyvien metaboliittien antamisen mahdollistamista keuhkojen antimikrobisen immuniteetin tehostamiseksi ei ole vielä tutkittu.10

Olemme aiemmin osoittaneet, että runsaskuituisen ruokavalion tai SCFA:iden asetaatti, butyraatti ja propionaatti antaminen suojasi hiiriä hengitysteiden synsyyttivirusinfektiolta (RSV).5 Asetaatin oraalinen antaminen indusoi IFN-b:n tuotantoa ja lisäsi interferonin stimuloimien geenien ilmentymistä ( ISG:t) keuhkoissa RSV-infektion aikana. Lisäksi havaitsimme, että suoraan hengitysteihin annettu asetaatti suojaa RSV-infektiolta lisäämällä ISG:iden ilmentymistä keuhkoissa.11 Siksi oletimme, että asetaatin suoralla antamisella hengitysteihin paikallisten mikrobien metaboliittipitoisuuksien lisäämiseksi olisi samanlainen suojaava vaikutus. vaikutuksia RV-infektioon. Tässä osoitamme, että asetaatin antaminen in vivo hiirillä lisää antiviraalisia tyypin I ja tyypin III interferoneja (IFN:itä), vähentää RV:n replikaatiota ja heikentää viruksen aiheuttamaa immunopatologiaa. Kun tarkastellaan tiettyjen solutyyppien in vitro antiviraalista vastetta laajemmalle SCFA-alueelle, havaitsemme, että nämä yhdisteet eivät vaikuta alveolaaristen makrofagien IFN-vasteisiin ja niillä on erilaiset vaikutukset epiteeliin, ja butyraatilla havaittiin näkyvämpi antiviraalista tehostava vaikutus. muiden SCFA:iden kanssa, mikä viittaa siihen, että in vivo -vaikutukset voivat johtua monimutkaisemmista solu-soluvuorovaikutuksista. Nämä tiedot viittaavat siihen, että keuhkojen mikrobien metaboliittiympäristön manipulointi voisi edustaa uutta lähestymistapaa hengitysteiden virusinfektioiden ehkäisyyn tai hoitoon.

MENETELMÄT

Eettinen lausunto

Kaikki eläinkokeet suoritettiin Animals Act 1986:n ja Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) -ohjeiden mukaisesti noudattaen Yhdistyneen kuningaskunnan sisäministeriön ohjeiden hyväksymää protokollaa (UK-projektilisenssi PPL nro P07D80C24).

RV:n leviäminen ja kvantifiointi

Hiiren ja ihmisen solulinjatutkimuksia varten pieni ryhmä RV-serotyyppi-A1 (RV-A1) kasvatettiin Ohion HeLa-soluissa (European Collection of Cell Cultures). Infektoituneet solut kerättiin 24 tunnin kuluttua, virus konsentroitiin ja puhdistettiin ja suoritettiin TCID50 (50 prosentin kudosviljelmän tarttuva annos) virustiitterin arvioimiseksi, kuten aiemmin on kuvattu.12 Ihmisen primaarisia keuhkoputken epiteelisoluja (BEC) koskevat tutkimukset RV-A1 lisääntyi RD-ICAM{11}}-solussa sisäisestä kannasta, joka oli eristetty kliinisistä näytteistä ja sekvensoitiin identiteetin varmistamiseksi. RV-A1 titrattiin infektoimalla RD-ICAM{16}}-solu sarjalaimennetulla RV-A1:llä, mitä seurasi sytopaattisten vaikutusten havainnot ja TCID50-määritys virustiitterin arvioimiseksi.

Hiiritutkimus

Kuuden viikon ikäiset naaraspuoliset BALB/c-hiiret ostettiin Harlan Laboratoriesilta (Derby, UK) ja niitä pidettiin spesifisissä patogeenittomissa olosuhteissa Imperial College Londonissa (UK). Hiiret esikäsiteltiin intranasaalisesti 50 ml:lla natriumasetaattia, butyraattia tai propionaattia (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) kevyessä isofluoraanipuudutuksessa. Joissakin kokeissa hiiret infektoitiin nenänsisäisesti 50 ml:lla RV:tä (5 3 106 TCID50) 24 tuntia myöhemmin. Asetaattihoitoannos oli 20 mM edellisen, samaa lähestymistapaa käyttävän tutkimuksemme mukaan.11 Asetaattihoitoa annettiin intranasaalisesti 24 tunnin välein tartunnan jälkeen.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA keuhkoista (100 mg keuhkokudosta) ja solulysaatti uutettiin käyttämällä RNeasy Mini -pakkausta (Qiagen, Hilden, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA syntetisoitiin käyttämällä satunnaisia ​​heksameerialukkeita (OmniscriptRT-pakkaus, Qiagen). Ensimmäisen juosteen cDNA:ta käytettiin IFN-b:n, IFN-l:n, Viperiinin, MuC5AC:n (hiiri ja ihminen), OAS1:n, RIG-I:n (Ddx58), MAVS:n, MDA-5 (hiiri) ja RV-kopioiden kvantifiointiin käyttämällä TaqMan-määritykset alukkeilla ja koettimilla, kuten aiemmin on raportoitu.13 Absoluuttista kvantifiointia varten kukin geeni normalisoitiin 18s rRNA:n tasolle, ja tarkat kopiot kiinnostavasta geenistä laskettiin käyttämällä standardikäyrää, joka luotiin plasmidi-DNA:n monistuksella. Vaihtoehtoisesti geeniekspression laskemiseen käytettiin 2-DDCt:tä (kertainen muutos). PCR-olosuhteet seurasivat TaqMan Universal PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass) protokollia. Geeniekspressiomääritys suoritettiin käyttämällä StepOnea (Applied Biosystems, Waltham, Mass).

Bronkoalveolaarinen huuhteluneste

Hiiret lopetettiin antamalla vatsaontelonsisäisesti yliannostus pentobarbitoniliuosta ja henkitorvet kanyloitiin. Keuhkot pestiin 3 kertaa steriilillä PBS:llä. Bronkoalveolaarinen huuhteluneste (BAL) sentrifugoitiin, supernatantti kerättiin kaksijuosteisen DNA:n mittausta varten ja pelletit suspendoitiin solujen kokonaismäärää ja differentiaalilukua varten. Differentiaalista solulaskentaa varten sytospin-levyt värjättiin MayGrunwald-Giemsalla, ja kokenut tutkija suoritti laskentamenettelyn sokeutetulla tavalla.

Kaksijuosteisen DNA:n mittaus

Kaksijuosteinen DNA mitattiin BAL-nesteestä käyttämällä Quant-iT PicoGreen -kaksijuosteista DNA-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia) valmistajan protokollan mukaisesti.

Histologinen analyysi

BAL:n jälkeen keuhkot perfusoitiin PBS:llä sydämen kautta ja täytettiin 4-prosenttisella paraformaldehydillä, ja sitten vasen keuhko kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä 24 tunnin ajan. Myöhemmin palat upotettiin parafiinilohkoihin ja leikattiin 5-mm:n paloiksi, värjättiin hematoksyliinilla ja eosiinilla. Tulehduksellinen infiltraatti mitattiin mikrometreinä ja suoritettiin 10 mittausta alkaen keuhkoputken tai verisuonen epiteelin päästä tulehduksellisen infiltraatin loppuun käyttämällä Olympus CellSens Standard -ohjelmistoa (Olympus Corporation, Tokio, Japani). Kaikki laskenta suoritettiin sokeasti koeolosuhteille.

Virtaussytometria

Solut eristettiin keuhkoista perfuusiolla PBS:llä ja digestoitiin sitten RPMI 1640 -elatusaineessa, johon oli lisätty 1 mg/ml kollagenaasi IV:tä (Invitrogen-Gibco, Waltham, Mass). Keuhkoista eristettyjä soluja ja BAL:ia inkuboitiin Mouse Fc Blockin (#553141 BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) kanssa 20 minuuttia. Solut pestiin ja värjättiin pintavasta-aineilla anti-CD45 (1:200, #557235, klooni 30-F11, BD Biosciences). Solunsisäistä värjäystä varten solut kiinnitettiin sytofixillä/sytoplasmalla (BD Biosciences) ja anti-RIG-I:llä (1:50, #35H2L48, ThermoFisher Scientific, Waltham, Mass) ja inkuboinnin jälkeen solut leimattiin sekundaarisella vasta-aineella vuohen antikanin IgG:llä. H&L Cy{18}}konjugoitu (1:1000, # ab97075, Abcam, Cambridge, Mass). Näytteet hankittiin virtaussytometrillä BD FACS Canto-II (BD Biosciences). Tiedot analysoitiin FlowJo-ohjelmistolla (versio 10, Tree Star, Inc, Ashland, Va).

In vitro -tutkimukset epiteelisolulinjoilla

Ihmisen BEC:t (BEAS-2B) ja ihmisen keuhkojen epiteelisolut (A549) ostettiin ATCC:ltä (Manassas, Va) ja niitä viljeltiin aiemmin kuvatulla tavalla.13 Solut kylvettiin yksitellen pitoisuudella 1.5 3 105 soluja/ml 12-kuoppalevyillä. 24 tuntia ymppäyksen jälkeen soluja käsiteltiin 400 mM natriumasetaatilla (Sigma-Aldrich) vielä 24 tuntia. Sen jälkeen solut infektoitiin RV-A1:llä (Multiplicity of Infection [MOI] 2) 1 tunnin ajan, minkä jälkeen virus poistettiin, solut pestiin ja lisättiin uutta elatusainetta, jota oli täydennetty 5 prosentilla FBS:llä. Lisää asetaattikäsittelyä (400 mM) lisättiin välittömästi infektion jälkeen ja joka 24. tunti solujen keräämiseen asti.

Ensisijaisten BEC-todistusten ja eettisten hyväksyntöjen kokoelma

Terveen tupakoimattoman BEC:t kerättiin keuhkoputkien harjauksista bronkoskopian aikana kirjallisella tietoisella suostumuksella. Kaikki kokeet suorittivat Hunter New England Area Health Service Ethics Committee (05/08/10/3.09) ja Newcastlen yliopiston turvallisuuskomitean (H-163-1205) hyväksynnät.

BEC:iden ja ilma-neste-rajapintaviljelmien ehdollinen uudelleenohjelmointi

BEC:t ohjelmoitiin ehdollisesti uudelleen rho-assosioituneella proteiinikinaasi-inhibiittorilla (lopullinen pitoisuus 10mM) ja yhdessä säteilytettyjen NIH-3T3-fibroblastien kanssa yksikerrosviljelmissä, kuten aiemmin on kuvattu.14,15 Ehdollisesti uudelleenohjelmoitu elatusaine koostui Dulbecco-modifioitua Eagle-elatusainetta (korkea glukoosinen 1 L-glutamiini)/Ham's F12:n suhde 1:2 täydennettynä 5 prosentilla FCS:llä, hydrokortisonia (400 ng/ml), insuliinilla (5mg/ml), rekombinantilla ihmisen epiteelin kasvutekijällä (10 ng) /ml), koleratoksiini (8,4 ng/ml), adeniini (23,9 mg/ml) ja 0,2 prosenttia penisilliini-streptomysiiniä.16 Laajennetut ehdollisesti uudelleen ohjelmoidut BEC:t vieroitettuna rho-assosioituneesta proteiinikinaasi-inhibiittorista ja kylvettiin {{24} }kuoppaisia ​​polyesteritranswell-kalvoja ja erilaistunut ilma-neste-rajapinnassa (ALI) 25 päivän ajan, kuten aiemmin on kuvattu.17 Kokeet suoritettiin n 5 4 bioteknisellä toistolla. Alcian-sininen, pH 2,5, ja jaksollinen happo-Schiff-värjäys suoritettiin 5- mm paksuisille ALI-leikkeille pseudostratifioituneen epiteelin visualisoimiseksi (katso kuva E1 tämän artikkelin online-varastossa osoitteessa www.jacionline.org).

SCFA-käsittely BEC-viljelmässä

Ennen tartuntaa ALI-viljelmiä käsiteltiin periaatteessa 100, 400 tai 1600 mM asetaatti-butyraattia. tai propionoi 24 tuntia 600 ml:ssa ALI:n lopullista alustaa, joka koostuu keuhkoputkien epiteelin peruselatusaineesta ja Dulbecco-modifioidusta Eagle-elatusaineesta (suhde 50:50), joka sisältää hydrokortisonia (0,1 prosenttia) , naudan insuliini (0,1 prosenttia), epinefriini (0,1 prosenttia), transferriini (0,1 prosenttia), naudan aivolisäkeuute (0,4 prosenttia) ja etanoliamiini (80 mM), MgCl2 (0,3 mM), MgSO4 (0,4 mM), BSA (0,5 mg) /ml), amfoterisiini B (250 mg/ml), all-trans-retinoiinihappo (30 ng/ml), penisilliini/streptomysiini (2 prosenttia) ja rekombinantti ihmisen epiteelin kasvutekijä (0,5 ng/ml). Infektiopäivänä peruselatusaine korvattiin uudella ALI-lopullisella elatusaineella ja SCFA-käsittelyllä, joka jätettiin päätepisteanalyysiin.

RV-infektio ja näytteenotto

ALI-BEC-viljelmät infektoitiin apikaalisesti RV-A1:llä. Aluksi RV-A1-kantaliuosta laimennettiin, jotta MOI-arvoksi saatiin 0,1, ja lisättiin viljelmien apikaaliselle pinnalle 2 tunnin ajaksi 50 ml:ssa keuhkoputken epiteelin perusalustaa, jossa oli lisäravinteita, 1 % insuliinia transferriini-seleeni ja 0,5 % linolihappo. Infektioelatusaine korvattiin sitten 500 ml:lla tuoretta keuhkoputken epiteelin peruselatusainetta (lisäaineineen) kokeen loppuosan ajaksi. Apikaalipesu (100 ml PBS) ja perusväliainenäytteet kerättiin 8- ja 48- tuntia infektion jälkeen ja säilytettiin 2808 C:ssa. Solut säilytettiin 350 ml:ssa RLT-puskuria (Qiagen), joka sisälsi 1 % 2-merkaptoetanolia 2808 °C:ssa geeniekspression analyyseja varten RT-kvantitatiivisella PCR:llä (kuvio E2, C).

Vahvistettujen antiviraalisten immuunivaikutusten mukaisesti asetaatilla oli taipumus vähentää viruksen RNA:n kopiomäärää (kuva E2, D) ja elävien virusten määrää (kuvio E2, E) 48 tuntia infektion jälkeen. BEAS2B-soluissa, BEC-linjassa, havaitsimme, että asetaattikäsittely lisäsi IFNB1-mRNA:n ilmentymistä 8 tuntia infektion jälkeen ja IFNL2-mRNA:n ilmentymistä 4 ja 8 tuntia infektion jälkeen (kuvio E2, F). Viperiinin ilmentymiseen ei ollut merkittävää vaikutusta (kuvio E2, F). Toisin kuin A459-soluissa havaitut vaikutukset viruskuormitukseen, asetaatilla ei ollut vaikutusta viruksen RNA:n tai TCID50:n kvantifiointiin BEAS2B-soluissa (kuvio E2, G ja H).

SCFA-hoidon vaikutus antiviraalisiin vasteisiin ALI-BEC-infektoituneissa viljelmissä

Havaittuamme asetaatin tehostavan vaikutuksen keuhkojen epiteelisolulinjoissa, pyrimme seuraavaksi arvioimaan vaikutuksia primaaristen epiteelisolujen mallissa, jotka erilaistuivat ALI:ssa (kokeellinen järjestelmä, joka kokoaa uskollisemmin yhteen in vivo -solut). Solujen erilaistuminen ja morfologia vahvistettiin pikarisolujen muodostumisella (jaksollinen happo-Schiff-värjäys) (kuvio E1).

Asetaatti lisäsi merkittävästi IFNB1- ja IFN12/3-arvoja (IL28) RV-infektoituneilla BEC-soluilla verrattuna infektoimattomiin soluihin (kuviot 3, B ja D), mutta eroa ei ollut verrattuna käsittelemättömiin RV-infektoituneisiin soluihin. Asetaatilla oli taipumus vähentää viruksen RNA:ta joko 8 tunnin tai 48 tunnin kohdalla RV-A1-infektion jälkeen (kuvio 3, A ja B). Koska asetaatilla oli vähemmän selkeitä tehostavia vaikutuksia tyypin I IFN-vasteiden RV-induktioon primaarisissa erilaistuneissa epiteelisoluissa, laajensimme tutkimuksiamme määrittääksemme, oliko butyraatilla tai propionaatilla havaittavia vaikutuksia. Butyraatti ja propionaatti lisäsivät myös IFNb-, IFN12/3- (IL28)- ja IFN11- (IL29)-geeniekspression mRNA-ilmentymistä verrattuna infektoimattomiin soluihin (kuvio 3, F, G, H ja L). Butyraattikäsittely lisäsi IFNB1:n, IL28:n ja IL29:n ilmentymistä 48 tuntia RV-infektion jälkeen verrattuna käsittelemättömiin RV-infektoituneisiin soluihin, vaikka tämä vaikutus ei riittänyt vaikuttamaan viruskuormaan (kuva 3, I, J, K, ja minä). Emme löytäneet suppressoivaa vaikutusta RV-indusoituun MUC5AC-ilmentymiseen millään SCFA-hoidon annoksella (katso kuva E3, AC, tämän artikkelin online-varastossa osoitteessa www.jacionline.org). Nämä tiedot osoittavat yhdessä, että toisin kuin hiirillä ja ihmissolulinjoilla saaduilla tiedoilla, SCFA:illa on rajoitetummat vaikutukset antiviraaliseen immuniteettiin erilaistuneissa primaarisissa epiteelisoluissa.

SCFA:illa ei ole vaikutusta tyypin I IFN-vasteisiin alveolaarisissa makrofageissa

Sen tutkimiseksi, johtuiko asetaatin ja/tai muiden SCFA:iden antiviraalinen vaikutus alveolaaristen makrofagien (tärkeä varhain reagoiva solu virusinfektioiden aikana ja keskeinen tyypin I IFN:n lähde) modulaatiosta, arvioimme SCFA:n antamisen vaikutusta ex vivo. antiviraaliset vasteet RVA1:llä stimuloiduissa makrofageissa. Havaitsimme, että SCFA:n antamisella ei ollut merkittävää vaikutusta Ifnb1:n, Viperiinin tai OAS1:n induktioon RV:llä, mikä osoittaa, että SCFA:iden immuunijärjestelmää vahvistavat vaikutukset eivät esiinny vaikutuksen kautta alveolaarisiin makrofageihin (katso kuva E4, AC, tämän artikkelin Online Arkisto osoitteessa www.jacionline.org).

Hengitysteiden kautta kuljetettu SCFA lisäsi IFN-b:tä ja viruksen tunnistavia reseptoreita ennen RV-infektiota

Saadaksemme mekaanista lisätietoa antiviraalisista reiteistä, jotka liittyvät tyypin I IFN:n tehostamiseen SCFA:illa, tutkimme seuraavaksi näiden yhdisteiden vaikutuksia antiviraalista reittiä tunnistaviin geeneihin. Annoimme jälleen intranasaalisesti 3 SCFA:ta (asetaatti, butyraatti ja propionaatti) 20 mM pitoisuuksina 24 tunnin ajan (kuvio 4, A). Emme löytäneet minkään SCFA:n vaikutusta sytosolisen viruksen RNA-sensorin MDA5 tai sen adapterimolekyylin MAVS:n ekspressioon (kuvat 4, B ja C). Sitä vastoin butyraatin antaminen (mutta ei muiden SCFA:iden) säätelee RIGI-mRNA:n ilmentymistä (kuvio 4, D). Butyraatin RIG-I:n ilmentymistä lisäävän vaikutuksen havaittiin olevan spesifisesti keuhkojen epiteelisoluissa/stromaalisoluissa (CD452), eikä vaikutusta havaittu hematopoieettisissa immuunisoluissa (CD451) (kuvio 4, EI). Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että erilaiset SCFA:t voivat toimia spesifisten antiviraalisen tunnistusreittien kautta säätelemään luontaista immuniteettia.

KESKUSTELU

Tämä tutkimus antaa uuden käsityksen mahdollisista eduista, joita mikrobien metaboliittien annostelu suoraan hengitysteihin parantaa keuhkojen synnynnäisen immuniteetin lisäämiseksi. Ravintokuidut ja suoliston mikrobiosta peräisin olevat SCFA:t on pitkään yhdistetty myönteisiin vaikutuksiin keuhkojen terveyteen. Satunnaistettu lumekontrolloitu tutkimus osoitti, että prebioottien (kuitujen) käyttö keskosilla esti RV-infektioita ensimmäisen elinvuoden aikana.20 Ravintokuidut ovat sulamattomia polysakkarideja, jotka voidaan hajottaa SCFA-yhdisteiksi mikrobifermentaation avulla. Tutkimuksissa on myös havaittu, että SCFA:t voivat muokata tervettä suoliston mikrobiotaa.21 Tutkimuksemme korostaa, että SCFA:iden hengitysteiden antamisella voi myös olla suoria paikallisia hyödyllisiä vaikutuksia isännän vasteisiin. Olemme tunnistaneet erillisen mekanismin ravinnon välitteisistä vaikutuksista mikrobiotaan, johon kuuluu synnynnäisen antiviraalisen immuniteetin suora keuhkostimulaatio SCFA:illa.

Tietomme osoittavat, että SCFA-asetaatin antaminen lisää antiviraalisten immuunivälittäjien perusekspressiota vakaassa tilassa. Tämä sopii käsitteellisesti asetaatin rooliin keuhkojen valmistuksessa IFN:ien tehokkaampaa varhaista vapautumista varten. Tätä tukivat havainnot, joiden mukaan asetaatin antaminen tehosti myös IFN:ien ja ISG:iden induktiota vasteena RV-infektiolle hiirillä. Tämä liittyi vähentyneeseen viruskuormitukseen ja myöhempään tulehdusreaktioiden ja liman tuotannon tukahduttamiseen. Kaikkien näiden vaikutusten katsottaisiin olevan hyödyllisiä akuutin virusinfektion yhteydessä. Tietomme sopivat yhteen kirjallisuuden kanssa, joka osoittaa, että asetaatilla on ollut mukana laaja-alaisia ​​terveyshyötyjä, kuten sydämen toiminnan parantaminen, punasolujen lisääntyminen ja immuunimuistin muodostuminen.22 Lisäksi asetaatti liittyy erilaisten immuunivasteen toiminnot23-25 ja hengityselinsairauksien hallinta.

Tutkimme myös asetaatin antamisen vaikutusta epiteelin RV-infektioon, koska se on viruksen alkuperäisen replikaation ensisijainen paikka. Löysimme samanlaisen asetaatin antiviraalista tehostavan vaikutuksen ihmisen keuhkosolulinjoissa, ja A549-soluissa havaittiin voimakkaampia vaikutuksia kuin BEAS-2B-soluissa (jonka tiedetään ilmentävän korkeampia IFN- ja ISG-perustasoja).27 ,28 Tämä voisi osittain selittää, miksi asetaattikäsittelyllä oli vähemmän vaikutuksia BEAS-2B-soluihin. Sitä vastoin havaitsimme, että ihmisen primaarisissa erilaistuneissa BEC:issä (ALI-BEC) asetaatilla ei ollut selvää vaikutusta tyypin I IFN-vasteisiin RV:lle. Lisäksi arvioimme myös asetaatin ja muiden SCFA:iden kykyä moduloida tyypin I IFN-vasteita alveolaarisissa makrofageissa, joita viljeltiin ex vivo, emmekä löytäneet vastaavasti vaikutusta. Tämä in vivo- ja in vitro -löydösten välinen ristiriita voi viitata siihen, että useat solutyypit ja solujen välinen kommunikaatio voivat olla vastuussa selkeästä in vivo havaitusta fenotyypistä, jolloin havaitaan vähemmän voimakas vaikutus, kun eristettyjä soluja käsitellään SCFA:illa.

Vaikka tutkimuksemme ensisijaisena painopisteenä oli arvioida SCFA:n vaikutuksia synnynnäiseen antiviraaliseen immuniteettiin, on mahdollista, että adaptiivisiin immuunivasteisiin saattaa ilmetä myöhempiä vaikutuksia, ja tulevat tutkimukset voivat keskittyä mahdollisiin vaikutuksiin T- ja B-lymfosyyttipopulaatioihin ja tuotantoon. neutraloivista vasta-aineista.

On myös huomattava, että käyttämämme hiirimalli on sellainen, jossa viruksen replikaatiota tapahtuu suhteellisen rajoitetusti (;{0}} tuntia), vaikka kaikki mitatut päätepisteet ovat replikaatiosta riippuvaisia.12,29 Lisätutkimukset, joissa käytetään hiireen mukautuneita viruskantoja jos viruksen replikaatio jatkuu, voi olla syvällisempiä ja jatkuvampia vaikutuksia. Lisäksi kokeemme suoritettiin yksinomaan naarashiirillä, ja lisätutkimusten pitäisi vahvistaa, esiintyykö samanlaisia ​​vaikutuksia miehillä.

Vaikka asetaatilla oli rajalliset vaikutukset ALI-BEC:issä, havaitsimme, että butyraatin antaminen voisi lisätä tyypin I IFN-vasteiden RV-induktiota. Nämä tiedot ovat ristiriidassa Chemudupatin et al.30 tutkimuksen kanssa, joka osoitti butyraatin estävän vaikutuksen tyypin I IFN-vasteisiin. Tässä tutkimuksessa käytettiin kuitenkin paljon suurempia butyraattipitoisuuksia ja keskityttiin myös erilaisiin hengitystieviruksiin.

Liman muodostuminen keuhkoissa on ominaisuus RV-infektiolle, joka johtaa astman ja keuhkoahtaumatautien kliinisen vaikeuden lisääntymiseen ja pahenemiseen,31,32 erityisesti hengitysteiden tulehduksen MUC5AC:n voimistuessa.33 Osoitimme, että asetaattihoito vähensi keuhkojen Muc5AC-ilmentymistä 4. ja 4. päivinä. 6 tartunnan jälkeen. Näin ollen SCFA:iden on osoitettu heikentävän liman tuotantoa keuhkoissa influenssainfektion34 ja allergisen hengitystietulehduksen aikana. 34, 35 ALI-BEC-soluissa asetaatti ei kuitenkaan moduloinut Muc5AC-geenin ilmentymistä, vaikka on huomattava, että myöhempiä ajankohtia ei tutkittu. Havaintomme vähentyneestä musiinin ilmentymisestä asetaatilla hoidetuilla ja viruksella infektoituneilla hiirillä on sopusoinnussa aiempien havaintojemme kanssa, jonka mukaan tyypin I IFN säätelee negatiivisesti hengitysteiden musiinin Muc5ac-ilmentymistä virusinfektion aikana.14 Molekyylimekanismit, joiden kautta tämä tapahtuu, ovat epäselviä. , vaikka aikaisemmat todisteet osoittavat, että IL-13-välitteinen tyypin 2 tulehdus voi olla tärkeä MUC5AC:n induktiossa.36,37 Lisätutkimuksissa tulisi pyrkiä ymmärtämään kattavammin, kuinka asetaatti voi vaikuttaa hengitysteiden liman tuotantoon.

Tutkiaksemme molekyylimekanismeja, joiden kautta SCFA:t indusoivat IFN:ää, mittasimme lisäksi antiviraalista reittiä tunnistavien geenien ilmentymistä. Havaitsimme, että butyraatti ja vähemmässä määrin asetaatti voivat indusoida RIG-I:n ilmentymisen naiivien hiirten keuhkojen epiteelisoluissa. Tietomme viittaavat siihen, että nämä SCFA:t lisäävät viruksen tunnistavaa vastetta ja valmistavat keuhkoja lisääntyneeseen synnynnäiseen vasteeseen virusinfektiota vastaan.

Hengitysteiden epiteelisoluissa on todettu heikentynyttä ex vivo tyypin I IFN:n tuotantoa RV-infektiolle sekä astmassa että COPD:ssä.38,39 Oletetaan, että tämä vika lisää näiden henkilöiden herkkyyttä viruksen aiheuttamille pahenemisvaiheille. Näitä vikoja aiheuttavia mekanismeja ei tunneta. Lisätyötä eläinmalleilla tai sairaiden solujen viljelyjärjestelmillä tarvitaan sen määrittämiseksi, johtaako astmassa ja keuhkoahtaumatautissa havaittu mikrobiaalinen dysbioosi asetaatin tai muiden SCFA-yhdisteiden suhteelliseen puutteeseen, joka voitaisiin korjata antamalla palauttaa heikentynyt antiviraalinen immuniteetti.

Yhteenvetona voidaan todeta, että SCFA:iden käyttö RV-infektion hoidossa liittyy tyypin I ja tyypin III IFN-tuotannon lisääntymiseen, jotka ovat keuhkojen antiviraalisen immuunivasteen keskeisiä komponentteja. Tämä tutkimus korostaa, että mikrobien metaboliittien, kuten SCFA:iden, antamisella hengitysteihin voi olla edullisia vaikutuksia antiviraaliseen immuniteettiin ja se saattaa mahdollisesti parantaa hengitysteiden virussairauksien vakavuutta.

VIITTEET

1. Trompette A, Gollwitzer ES, Yadava K, Sichelstiel AK, Sprenger N, Ngom-Bru C, et ai. Ravintokuidun suoliston mikrobiotan aineenvaihdunta vaikuttaa allergiseen hengitystiesairauksiin ja hematopoieesiin. Nat Med 2014;20:159-66.

2. Thorburn AN, McKenzie CI, Shen S, Stanley D, Macia L, Mason LJ, et ai. Todisteita siitä, että astma on kehitysperäinen sairaus, johon vaikuttavat äidin ruokavalio ja bakteerien aineenvaihduntatuotteet. Nat Commun 2015; 6:7320.

3. Rivera-Chavez F, Zhang LF, Faber F, Lopez CA, Byndloss MX, Olsan EE, et ai. Butyraattia tuottavien Clostridia-bakteerien häviäminen suoliston mikrobiotosta edistää salmonellan aerobista luminaalista laajenemista. Cell Host Microbe 2016;19:443-54.

4. Fachi JL, Secca C, Rodrigues PB, Mato FCP, Di Luccia B, Felipe JS, et ai. Asetaatti koordinoi neutrofiilien ja ILC3-vasteita C. difficileä vastaan ​​FFAR2:n kautta. J Exp Med 2020;217:jem.20190489.

5. Antunes KH, Fachi JL, de Paula R, da Silva EF, Pral LP, Dos Santos AA, et ai. Mikrobiotasta peräisin oleva asetaatti suojaa hengitysteiden synsyyttivirusinfektiolta GPR43-tyypin 1 interferonivasteen kautta. Nat Commun 2019;10:3273.

6. Correa-Oliveira R, Fachi JL, Vieira A, Sato FT, Vinolo MA. Immuunisolujen toiminnan säätely lyhytketjuisilla rasvahapoilla. Clin Transl Immunol 2016; 5:e73.

7. Koh A, De Vadder F, Kovatcheva-Datchary P, Backhed F. Ravintokuidusta isäntäfysiologiaan: lyhytketjuiset rasvahapot tärkeimpinä bakteerien metaboliitteina. Cell 2016;165: 1332-45.

8. Sulaiman I, Wu BG, Li Y, Tsay JC, Sauthoff M, Scott AS, et ai. Mikrobiomin toiminnallinen alempien hengitysteiden genominen profilointi aktiivisen mikrobiaineenvaihdunnan vangitsemiseksi. Eur Respir J 2021;58:2003434.

9. Glanville N, Johnston SL. Haasteita ristiserotyyppisen rinovirusrokotteen kehittämisessä. Curr Opin Virol 2015;11:83-8.

10. Spacova I, De Boeck I, Bron PA, Delputte P, Lebeer S. Paikalliset mikrobilääkkeet hengitysteiden virusinfektioita vastaan. Trends Mol Med 2021;27:538-53.

11. Antunes KH, Stein RT, Franceschina C, da Silva EF, de Freitas DN, Silveira J, et ai. Lyhytketjuinen rasvahappoasetaatti laukaisee RIG-I:n välittämän antiviraalisen vasteen imeväisten soluissa, joilla on hengitysteiden synsyyttiviruksen bronkioliitti. EBioMedicine 2022;77: 103891.

12. Bartlett NW, Walton RP, Edwards MR, Aniscenko J, Caramori G, Zhu J et ai. Hiirimallit rinoviruksen aiheuttamasta taudista ja allergisen hengitystietulehduksen pahenemisesta. Nat Med 2008;14:199-204.

13. Singanayagam A, Glanville N, Girkin JL, Ching YM, Marcellini A, Porter JD, et ai. Antiviraalisen immuniteetin kortikosteroidivaikutus lisää bakteerikuormitusta ja liman tuotantoa COPD:n pahenemisvaiheissa. Nat Commun 2018; 9:2229.

14. Gentzsch M, Boyles SE, Cheluvaraju C, Chaudhry IG, Quinney NL, Cho C, et ai. Ehdollisesti uudelleenohjelmoitujen kystisen fibroosin keuhkoputkien epiteelisolujen farmakologinen pelastus. Am J Respir Cell Mol Biol 2017;56:568-74.

15. Liu X, Ory V, Chapman S, Yuan H, Albanese C, Kallakury B, et ai. ROCK-inhibiittori- ja syöttösolut indusoivat epiteelisolujen ehdollisen uudelleenohjelmoinnin. Am J Pathol 2012; 180:599-607.

For more information:1950477648nn@gmail.com