Ikääntyminen ja pitkäikäisyys ovat aina olleet vietteleviä aiheita organismeille. Eräänä aikuisen kantasoluna, jolla on kyky uusiutua

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Abstrakti:Mesenkymaalisten kantasolujen (MSC) vanheneminen ei ainoastaan ​​estä MSC:iden käyttöä regeneratiivisessa lääketieteessä, vaan se korreloi myös läheisesti biologisen ikääntymisen ja rappeuttavien sairauksien kehittymisen kanssa. Tässä tutkimuksessa tutkimme kurkumiinin (Cur) ikääntymistä estäviä vaikutuksia koiran luuytimestä peräisin oleviin MSC:ihin (cBMSC) ja selvensimme edelleen mahdollista vaikutusmekanismia, joka perustuu autofagian modulaatioon. cBMSC:t laajennettiin in vitro standardimenetelmillä ennenaikaisen vanhenemisen solumallin rakentamiseksi.cistanche annostus redditTodisteemme osoittavat, että verrattuna cBMSC:iden kolmanteen kulkuun, monia tyypillisiä vanhenemiseen liittyviä fenotyyppejä havaittiin cBMSC:iden kuudennessa siirrossa. Cur-hoito voi parantaa cBMSC:n eloonjäämistä ja hidastaa cBMSC:n vanhenemista havaintojen mukaan, että Cur(1 uM) -hoito voi parantaa pesäkkeitä muodostavien yksikköfibroblastien (CFU-Fs) tehokkuutta ja lisätä pluripotenttien transkriptiotekijöiden (SOX{{5}) mRNA-ilmentymistä. } ja Nanog), sekä estämällä vanhenemiseen liittyvien beeta-galaktosidaasi (SA- -gal) aktiivisuutta ja ikääntymiseen liittyvien markkerien (pl6 ja p21) ja tulehdusta edistävien molekyylien (kasvainnekroositekijä- (TNF-a) ja interleukiini-6(IL-6)). Lisäksi Cur（0.1 uM~10 µM）:n havaittiin lisäävän autofagista aktiivisuutta, mikä tunnistettiin mikrotubuluksiin liittyvän proteiinin 1 kevytketjun 3 (LC3) ylössäätelyn perusteella, kuten autofagiaa aktivoivan kinaasin -1 (ULK1), autofagiaan liittyvä geeni (Atg)7 ja Atg12 sekä kevytketjun 3 (LC3-II) tyypin II synnyttäminen, mikä lisää autofagisia vakuoleja ja happamia vesikulaarisia organelleja, kuten sekä aiheuttaa merkittävän laskun p62-proteiinitasossa. Lisäksi autofagian aktivaattorin rapamysiinin (RAP) ja Curin havaittiin osittain parantavan cBMSC:n vanhenevia piirteitä, kun taas autofagian estäjän 3-metyyliadeniini (3-MA) todettiin pahentavan cBMSC:n vanhenemista ja Cur-hoito oli pystyy palauttamaan tukahdutetun autofagian ja estämään 3-MA:n aiheuttaman cBMSC:n vanhenemisen. Siksi tutkimuksemme korostaa Cur-indusoidun autofagian tärkeää roolia ja sen vaikutuksia cBMSC:n vanhenemisen parantamiseen ja tarjoaa uutta tietoa vanhenemisen viivyttämisestä ja MSC:iden terapeuttisen potentiaalin parantamisesta.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Avainsanat:kurkumiini;vanheneminen; autofagia; koiran luuytimestä peräisin olevat mesenkymaaliset kantasolut

1. Esittely

Ikääntyminen ja pitkäikäisyys ovat aina olleet vietteleviä aiheita organismeille. Aikuisten kantasolujen tyyppinä, jolla on kyky uusiutua, immunosuppressiota, erilaistumista ja migraatiota, mesenkymaalisia kantasoluja (MSC) on laajalti useissa kudoksissa ja elimissä, kuten luuytimessä, rasvakudoksessa, lapsivedessä, istukassa, napakalvossa. napanuorasta ja lihasta [1,2], ja niillä on olennainen rooli kudosten homeostaasin ylläpitämisessä koko organismin elinkaaren ajan [3,4]. Kertyvä näyttö on paljastanut, että biologinen ikääntyminen ja monien rappeuttavien sairauksien kehittyminen voivat johtua MSC:n vanhenemisesta [5,6]. Lisäksi MSC:t ovat lupaavia solupohjaisen regeneratiivisen hoidon lähteitä, mutta niitä on yleensä laajennettava in vitro, jotta saavutettaisiin hoitojen vähimmäissiirtojen määrä (20-100 miljoonaa) [7]. In vitro -viljelmä ei kuitenkaan pysty täysin simuloimaan MSC:iden mikroympäristöä in vivo, ja se laukaisee väistämättä solujen vanhenemisen [8,9] Vanheneminen mitoottisissa soluissa tapahtuu vasteena erilaisille stressitekijöille, kuten telomeerien toimintahäiriöille [10], DNA:lle. vaurioita [11], oksidatiivista stressiä [12] ja onkogeenin aktivaatiota [13], ja lopulta johtaa solunjakautumisen lopettamiseen. Lisäksi vanhenevat MSC:t vaikuttavat negatiivisesti biologisiin toimintoihin, mukaan lukien immunomodulaatio, erilaistuminen ja migraatio [14]. Paljon työtä on yritetty luoda tehokkaita strategioita vanhenemisen hidastamiseksi MSC: issä. Viime aikoina useiden yrttiperäisten tuotteiden on ehdotettu edistävän organismin terveyttä ja pitkäikäisyyttä, ja ne voivat olla lupaavia työkaluja MSC:n vanhenemisen viivyttämiseen [15].

Cistanche voi estää ikääntymistä

Kurkumiini(Cur), hydrofobinen polyfenoli, joka on uutettu perinteisestä kiinalaisen lääketieteen kurkumasta, on herättänyt suurta huomiota sen anti-inflammatoristen, antioksidanttisten, apoptoottisten, kasvaimia ja ikääntymistä ehkäisevien vaikutusten ansiosta kudossoluissa ja joissakin sairausmalleissa [{ {4}}]. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että Curilla on terveyteen liittyviä etuja ikään liittyvissä sairauksissa, mukaan lukien nivel-, neurologiset, lisääntymis- ja sydän- ja verisuonitaudit [20-24]. Ikääntyminen liittyy tuki- ja liikuntaelinten muutoksiin sekä nivelsairauksien alkamiseen ja etenemiseen. Curilla tehdyn kroonisen ruokavalion todettiin parantavan käsien ja sormien motorista toimintaa keski-ikäisillä apinoilla ja sillä oli suotuisia vaikutuksia ikääntyneisiin luustolihaksiin [25,26]. Buhrmannin ja kollegoiden saatavilla olevat tiedot ovat paljastaneet, että Cur voi heikentää ympäristöstä johtuvaa nivelrikkoa tasapainottamalla kondrosyyttien eloonjäämistä ja tulehdusvasteita [27,28]. Lisäksi Curilla on neuroprotektiivisia vaikutuksia välittämällä autofagiaa ja tulehdusta, ja se voi siksi olla tehokas hoito potilaille, joilla on hermostoa rappeuttavia sairauksia, kuten Alexanderin tauti, Alzheimerin tauti ja Parkinsonin tauti [29,30].

Itse asiassa sen tosiasian, että Curilla on pleiotrooppista aktiivisuutta, voidaan katsoa johtuvan niiden aktivointi- ja suojavaikutuksista MSC:issä [31,32]. Useat tutkimukset ovat vahvistaneet, että Cur osallistuu immunomodulatoristen kykyjen säätelyyn; MSC:iden erilainen potentiaali eri solulinjoille (neurosyyttien, kondrosyyttien, rasvasolujen ja osteoblastien) ja useiden signalointimekanismeihin liittyy tähän prosessiin [2831, 33-35]. Lisäksi Curia pidetään myös hyvänä antioksidanttina, joka parantaa rotan rasvakudoksesta peräisin olevien mesenkymaalisten kantasolujen (ADSC) elinikää telomeraasikäänteisen transkriptaasin (TERT) geenin ilmentymisen lisääntymisen vuoksi [36]. Äskettäinen tutkimus osoitti, että p65:n esto Cur voi estää solujen vanhenemisen ja tulehdusaktivaation ihmisen napanuorasta peräisin olevissa MSC:issä [37].cistanche-uutteen edutIlmeisesti enemmän huomiota on kiinnitetty Curin ikääntymistä ehkäiseviin vaikutuksiin MSC:issä niiden valtavan terapeuttisen potentiaalin vuoksi, mutta tämän vaikutuksen taustalla olevat mekanismit ovat edelleen epäselviä. Jotkut in vitro -tutkimuksista saadut todisteet ovat vahvistaneet, että Curin suotuisat vaikutukset johtuvat sen autofagian moduloinnista [29, 38-41]. Han ja kollegat osoittivat, että Cur voi suojata ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC:t) H2O2--indusoidulta oksidatiiviselta vauriolta ja että positiivisia vaikutuksia ilmenee autofagian voimistuessa fosfatidyyli-inositoli-{5}}kinaasin (PI3K)/Akt/ avulla. nisäkäskohde rapamysiinin (mTOR) estämiselle [40]. Toinen tutkimus osoitti, että Cur pystyy edistämään solujen eloonjäämistä estämällä hypoksian/uudelleenhapetuksen (H/R) aiheuttamaa apoptoosia ja liiallista autofagiaa kardiomyosyyttien keskuudessa [41]. Siksi se, toimiiko Cur autofagian positiivisena vai negatiivisena säätelijänä, riippuu stressiä tuottavasta ärsykkeestä ja soluasetuksista, ja tarvitaan lisätietoja sen määrittämiseksi, onko Curin autofagian modulointi tehokas strategia MSC:n vanhenemisen viivyttämiseen. Solunsisäisten aineiden hajoamis- ja kierrätysreitin periaatteena autofagialla on ratkaiseva rooli solujen homeostaasin ylläpitämisessä ja ympäristön paineen kestämisessä, ja sillä on ollut valtava potentiaali hidastaa solujen vanhenemista ja hoitaa ikään liittyviä sairauksia. Organellien toimintahäiriö ja toksisten aineenvaihduntatuotteiden kertyminen ovat ikääntyvien MSC:iden [42] avainominaisuuksia, mikä viittaa mahdolliseen yhteyteen autofagian ja vanhenemisen välillä. Ma ja kollegat havaitsivat, että ikääntyneiden BMSC-solujen autofaginen aktiivisuus oli heikentynyt verrattuna nuoriin BMSC-soluihin ja että autofagian estäjä 3-metyyliadeniini (3-MA) saattoi nopeuttaa vanhenemista nuorilla MSC:illä; Sitä vastoin he havaitsivat, että autofagiaaktivaattori rapamysiini (RAP) voisi osittain palauttaa ikääntyneiden BMSC:iden biologiset ominaisuudet [5]. Äskettäisessä tutkimuksessa tutkittiin moduloidun autofagian roolia käyttämällä RAP:ia ja 3-MA:ta D-galaktoosin (D-gal) indusoimassa MSC:n vanhenemisessa ja osoitti, että RAP lievitti huomattavasti MSC:n vanhenemista [43]. Mielenkiintoista on, että useat tutkimukset ovat osoittaneet, että autofagian lisääntyminen havaitaan vanhenevissa MSC:issä ja että autofagia on välttämätön MSC-vanhenemisprosessien ylläpitämiseksi [44,45]. Siksi, voidaanko autofagiaa pitää positiivisena vai negatiivisena vanhenemisen säätelijänä MSC:issä, on edelleen ristiriitaista ja epäselvää. Näin ollen olisi mielenkiintoista tutkia autofagian, MSC-vanhenemisen ja Curin välistä suhdetta, mikä voisi tarjota laajemman näkökulman vanhenemisen viivyttämiseen ja MSC:iden terapeuttisen potentiaalin parantamiseen.

Tässä tutkimuksessa ensisijaisena tarkoituksenamme oli selvittää, voisiko Cur-hoito viivyttää koiran luuytimestä peräisin olevaa MSC (cBMSC) vanhenemista ja korreloiko taustalla oleva mekanismi autofagian modulaatioon. Tätä tarkoitusta varten arvioimme fenotyyppisen karakterisoinnin, autofagisen aktiivisuuden ja geenin ilmentymisen Cur-altistuksen jälkeen vanhenevissa cBMSC-soluissa sekä onko autofagian ja sen vaikutusten välinen suhde cBMSC:n vanhenemiseen määritetty käyttämällä 3-MA:ta ja RAP:ia. .

2. Tulokset

2.1. cBMSC:iden ominaisuudet

cBMSC:t laajennettiin in vitro tavanomaisilla menetelmillä, ja niiden osoitettiin olevan stabiilisti siirrostettu yhdeksän sukupolven aikana (tietoja ei esitetty). cBMSC:t osoittivat muoviin tarttuvan ja fibroblastin kaltaisen ulkonäön koko viljelyprosessin ajan (kuva 1A). cBMSC:iden erilaistumiskyky vahvistettiin adipogeenisellä ja osteogeenisellä induktiolla (kuvio 1B, C). cBMSC:iden immunofenotyyppi arvioitiin käyttämällä virtaussytometriaa. Tulokset osoittivat, että solupopulaatio ekspressoi positiivisesti CD90:tä, CD105:tä ja ITGB1:tä ja negatiivisesti CD31:tä, CD34:ää ja CD45:tä, mikä viittaa niiden mesenkymaaliseen eikä hematopoieettiseen alkuperään (kuvio 1 ja taulukko 1).

2.2.cBMSC:t näyttävät asteittain vanhenevia ominaisuuksia in vitro -laajennuksen myötä

Varhaisen läpikulun cBMSC:t (P1 ja P3) näyttävät pitkän fusiformin tai kolmion muodon, ja ne on järjestetty pyörteeseen kasvatuksen jälkeen in vitro (kuvio 2A). Tämän jälkeen cBMSC:t osoittivat vähitellen vanhenemiseen liittyviä fenotyyppejä pitkän aikavälin in vitro -viljelyn aikana, joille oli tunnusomaista laajentunut ja tasainen morfologia ja lisääntymisen väheneminen (kuvio 2A, B). Lisäksi pesäkkeitä muodostavan yksikkö-fibroblasti (CFU-F) -määrityksen tulokset osoittivat, että sekä CFU-F:n lukumäärä että pesäkkeiden koko pienenivät merkittävästi viljelyjaksojen myötä (kuvio 2C), mikä on yhdenmukainen alentuneen mRNA:n kanssa. pluripotenttien transkriptiotekijöiden Nanog ja SOX{13}} ilmentyminen 6. ja 9. siirrossa (kuva 2G).

Vanhenemiseen liittyvä -galaktosidaasi (SA- -gal) on lysosomaalinen entsyymi, jonka aktiivisuus korreloi voimakkaasti solun vanhenemisen kanssa [46]. SA- -gal-värjäyksen tulokset osoittivat, että SA- -gal-positiivisten solujen määrä kasvoi 7,5±2,4 prosentista (P3) 65:een.0 ±5.0 prosenttia (P6) ja 87,3 ± 3,3 prosenttia (P9), vastaavasti (kuva 2D).cistanche Tšingis-khaaniLisäksi havaittiin lisääntynyttä solusyklin kinaasiestäjien (p21 ja p16) ja tulehdusta edistävien molekyylien (TNF- ja IL-6), jotka toimivat ikääntymiseen liittyvän sekretorisen fenotyypin (SASP) komponentteina. 6. ja 9. kohdassa (kuva 2E, F). Siksi cBMSC:t osoittavat siirrosta riippuvaa kasvua vanhenevissa fenotyypeissä ja lopettavat proliferaation 9. siirrossa.

2.3. Cur lievittää cBMSC:iden vanhenevaa tilaa

Kuudennen siirrostuksen cBMSC:itä inkuboitiin Curin puuttuessa tai läsnä ollessa annoksilla 0,1,0,5, 1,5 tai 10μmol/ml (μM) 12 h, 24 h, 48 h ja 72 h, ja niiden solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttämällä CCK-8. Tulokset osoittivat, että Cur (0.1-10 uM) ei aiheuta myrkyllistä vaikutusta cBMSC:issä ja sillä on tuntuvia vaikutuksia cBMSC:iden elinkelpoisuuden lisäämiseen 24 tunnin hoidon jälkeen (kuva 3A). Curin vaikutuksen arvioimiseksi solujen vanhenemiseen cBMSC:t altistettiin erilaisille Cur-pitoisuuksille (0,1, 1 ja 10 uM) 24 tunnin ajan. Tulos osoitti, että SA- -gal-positiivisten solujen määrä väheni merkittävästi cBMSC-soluissa Cur-käsittelyn jälkeen (1 µM ja 10 uM) verrattuna kontrolliryhmään (kuva 3B). CFU-F-määrityksiä oli käytetty arvioimaan Cur:n vaikutuksia cBMSC:iden (P6) itseuudistumistehokkuuteen. 1 uM Cur:n annoksen havaittiin olevan tehokkain pitoisuus cBMSC:iden CFU-F:n tehokkuuden parantamiseksi. 10 μM Cur:n annoksella oli kuitenkin haitallisia vaikutuksia cBMSC:iden itsensä uusiutumisen tehokkuuteen (kuva 3C). Lisäksi Curin vanhenemista lieventävä vaikutus havaittiin annoksella 1 μM, mikä ilmeni p16:n heikentymisenä, IL-6 ja TNF- sekä Nanog- ja SOX-2-ekspression lisääntyminen (kuva 3D-F).vesisäiliön käyttöiän pidentäminenYhdessä nämä tulokset osoittavat, että Cur annoksella 1 uM voi tehokkaasti aiheuttaa sytoprotektiivisia vaikutuksia vanheneviin cBMSC:ihin.

2.4. Cur Treatment Enhanced Autophagic Activity cBMSCs

Lysosomien toiminnallisella aktivaatiolla on kriittinen rooli autofagian kulussa, ja lysosomaalisen happamoitumisen häiriöt ovat haitallisia lysosomin hajoamistoiminnalle [38]. Siksi autofaginen aktiivisuus havaittiin ensin LysoTracker-värjäyksellä, joka voi seurata lysosomaalista happamoitumista. Tulos osoitti, että esikäsittely Cur:lla lisäsi annoksesta riippuen punaisen fluoresenssin voimakkuutta cBMSC:issä, mikä viittasi lysosomien happamoitumisen lisääntymiseen (kuvio 4D).

Arvioidaksemme edelleen Curin vaikutuksia cBMSC:iden autofagiaan käytimme autofagosomimarkkereita mikrotubuluksiin liittyvää proteiinia 1A/1Belight chain 3 (LC3) ja p62/SQSTM1, jotka ovat keskeisiä markkereita autofagivuon arvioinnissa[47,48 ]. Lisääntynyt autofaginen aktiivisuus havaittiin cBMSC:issä Cur-altistuksen jälkeen, mikä näkyy annoksesta riippuvana lisääntymisenä LC{{10}}I:n konversiossa LC3-II:ksi kiihtyvän p62:n ohella. hajoaminen (kuvio 4A). Lisäksi ATG7:n, ATG12.LC3:n mRNA-ilmentyminen. ja ULK1 lisääntyivät Cur-hoidon jälkeen (kuvio 4B). cBMSC:iden ultrarakennetta tutkittiin transmissioelektronimikroskoopilla. Sitten havaitsimme autofagosomien ja autolysosomien muodostumisen lisääntymisen cBMSC:issä Cur-hoidon jälkeen annoksilla 0,1, 1 ja 10 μM 24 tunnin ajan (Kuva 4C).cistanche nzImmunofluoresenssivärjäys osoitti myös, että Cur-käsittely lisäsi merkittävästi LC3:n tyypillisten pistemäisten fluoresoivien pisteiden lukumäärää (kuvio 4E). Nämä tulokset osoittivat, että Cur voi edistää lysosomaalista happamoitumista ja autofagian aktivoitumista annoksesta riippuvaisella tavalla.

Tämä artikkeli on poimittu Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms