Kversetiinin edullinen/epäsuotuisa vaikutus SK-N-SH-neuroblastoomasolujen kalvoihin, osa 2

Klikkaaoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

2.2.2. Kversetiinin antioksidanttiaktiivisuus

Kversetiinin tehokkuuden testaamiseksi kalvojen suojaamisessa oksidatiiviselta stressiltä suoritettiin kokeita, joissa kalvon lipidimallit altistettiin otsonille ilman (kuva 4a) ja kversetiinin läsnäoloa pitoisuutena 6,25 µM (kuva 4b).

Otsonin vaikutuksesta molempien riippuvuuksien eli π{{0}}f(A)- ja Cs-1=f(rn)-kulku muuttuu. Otsonia sisältävän alafaasin yksikerroksiselle leviämiselle saaduille isotermeille oli tunnusomaista pienempi kaltevuus ja siirtyminen pienempiä A-arvoja kohti. Lisäksi Cs-1-arvot laskivat otsonin vaikutuksesta. Nämä muutokset olivat suurimmat noin 0,4 ppm:n otsonipitoisuudella.cintancheOtsonipitoisuuden lisäys ei lisännyt yksikerroksisten ominaisuuksien muutoksia (kuva 4a).

Kuva 4. Alafaasille levinneen neuroblastoomakerrosten lipidimallin pintapaineisotermit ja vastaava puristuvuusmoduuli (inset) sisälsivät ilmoitetut puskuriin liuenneen otsonin pitoisuudet. Isotermit:(a)ilman antioksidantteja;(b)kversetiinin läsnä ollessa (6,25 μM) lisättynä otsonia sisältävään puskuriin.

Kun alafaasiin lisättiin kversetiiniä pitoisuutena 6,25 µM, otsoni ei vaikuttanut merkittävästi r(A)-isotermin kulumiseen; puristusmoduulin arvot kuitenkin muuttuivat otsonin läsnä ollessa samalla tavalla kuin kversetiinin puuttuessa (kuva 4b).

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Saatujen isotermien perusteella määritettyjä yksikerroksia kuvaavien parametrien numeeriset arvot on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3. Yksikerrosten pintaparametrit Alim ja Cs-I, jotka on laskettu alafaasille levinneen neuroblastoomakalvomallin yksikerroksisille kerroksille, sisälsivät ilmoitetut otsonin pitoisuudet puskuriin liuenneena kversetiinin poissa ollessa ja sen läsnä ollessa (6,25 uM). Tiedot edustavat kolmen kokeen keskiarvoa ± SD. Eri kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja (p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0.05).

Otsonin läsnäollessa havaitaan pinta-alan hienoinen pieneneminen molekyyliä kohden (Alim) tiheästi pakatuissa yksikerroksisissa kerroksissa. Tämän parametrin suurin vähennys on 3,2 prosenttia verrattuna kontrolliin (yksikerros puhtaalla puskurilla). Myös Cs-I-parametria pienennetään saavuttaen tasannearvot yli 0,6 ppm O:n otsonipitoisuuksilla. Tämän parametrin maksimivähennys on 24 prosenttia kontrolliin verrattuna.

Kun alifaasissa on kversetiiniä pitoisuutena 6,25 uM, Alim-arvot (1-2 prosenttia) laskevat hieman, kun taas Cs-1-arvon väheneminen on noin 27 prosenttia.

Alim-muutosten luonne otsonin läsnä ollessa ja otsonin yhdistelmä kversetiinin kanssa on erilainen. Noin 0,3 ppm:n otsonipitoisuudella kversetiinin puuttuessa tavoite laskee äkillisesti noin 88,3 A2:een. Sitten se saavuttaa minimitasannearvon, joka antaa tunnusomaisen S-muodon riippuvuuden (kuva 5a, punaiset pisteet). Kversetiinin läsnä ollessa Alim-arvo laskee hieman tasaisesti, monotonisesti saavuttaen korkeamman otsonipitoisuuden, tasannen noin 93,5 A2 (kuva 5a, vihreät pisteet).

Kuva 5. Pinta-alan riippuvuus molekyyliä kohti otsonipitoisuudesta (a) ja puristusmoduulin riippuvuus otsonikonsentraatiosta (b) neuroblastoomakalvolle alafaasissa: Ilman kversetiininpunaisia ​​pisteitä; kversetiininvihreillä pisteillä. Viivat eivät esitä mitään fyysistä mallia, ne sovitettiin matemaattisesti ja ne on piirretty parametrien muutosten seurannan helpottamiseksi. Maksimaaliset kerroksen puristusmoduuliarvot muuttuvat samalla tavalla otsonipitoisuuden mukaan molemmille: Kversetiinin puuttuessa ja läsnä ollessa (kuva 5b).

3. Keskustelu

Kversetiinin vaikutusmekanismia on tutkittu intensiivisesti useiden vuosien ajan, mutta kokeiden tulokset ovat usein ristiriitaisia ​​ja osoittavat, että joissakin olosuhteissa tämä yhdiste on hyödyllinen ja toisissa epäsuotuisa soluille. Saatavilla olevien tutkimusten analyysi osoittaa, että tämän yhdisteen vaikutus soluihin liittyy kahteen näkökohtaan, eli sen vuorovaikutukseen kalvojen kanssa ja antioksidanttiseen aktiivisuuteen. Soluissa ei kuitenkaan ole mahdollista erottaa näitä kahta kversetiinin vaikutustapaa ja arvioida tämän yhdisteen sopivuutta mahdolliseksi aineeksi, esim. jolla on kasvainten vastainen vaikutus. Tästä syystä kokeet on suunniteltu siten, että voidaan arvioida laadullisesti ja kvantitatiivisesti tämän yhdisteen vaikutusta kalvojen mekaanisiin ominaisuuksiin sekä sen antioksidanttista aktiivisuutta mallijärjestelmässä, mikä eliminoi muiden aineenvaihduntareittien aktiivisuus.

Suoritettujen kokeiden perusteella vahvistettiin, että kversetiini modifioi (kuten Alimvalue-arvon kasvu osoittaa) pienimmilläkin pitoisuuksilla mallin yksikerroksia jäljitellen neuroblastoomasolujen kalvon lipidiosaa. Se viittaa mahdollisuuteen, että kversetiinin vuorovaikutus näiden solujen kalvojen kanssa saavuttaa aivot, jopa pieninä pitoisuuksina. Tämä on erityisen tärkeää hermosoluille, joiden kalvot sisältävät suhteellisen suuria määriä lipidejä.

Cistanche voi parantaa immuniteettia

Lipidi-proteiinisuhde hermosoluille on 80:20 prosenttia ja esimerkiksi punasolukalvolle tämä suhde on 50:50 prosenttia [29]. Tällainen lipidien taso hermosolujen kalvossa liittyy näiden solujen rooliin sähköisten signaalien välittämisessä. Samaan aikaan pienetkin muutokset solukalvon fysikaalis-kemiallisissa ominaisuuksissa, kuten joustavuudessa ja jäykkyydessä, voivat merkittävästi häiritä tätä toimintaa.

Aktiopotentiaali siirtyy hermosolun kalvoa pitkin ionikanavien toiminnan ansiosta, ja sitten ionipumppujen toiminnan ansiosta lepopotentiaali palautuu. Näiden proteiinien asianmukainen toiminta (erityisesti niiden muodon mukaan) riippuu läheisesti lipidiympäristöstä. Lisäksi muutokset kalvon mekaanisissa ominaisuuksissa voivat häiritä sellaisten kanavien toimintaa, joiden porttimekanismi riippuu juuri kalvon mekaanisista ominaisuuksista.

Nämä väitteet vahvistavat tutkimukset, jotka osoittivat, että kversetiinin vaikutus solukalvoon liittyy muun muassa Ca2 plus -ionien ja/tai Ca2 plus aineenvaihduntaan [30,31]. Siten kversetiinimolekyylien viemisellä kalvon ympäristöön (erityisesti hermosoluihin) voi olla merkittäviä seurauksia niiden toimintaan.

Sen tarkistamiseksi, onko mallijärjestelmissä määritetyllä kversetiinilla hyödyllistä vai epäsuotuisaa roolia soluissa, mallikalvoille saatuja tuloksia verrattiin tämän yhdisteen vaikutukseen kokonaisiin neuroblastoomasoluihin. SK-N-SH-soluille tehtiin MTT-testi,Cistanche-uute Alzheimerin vastainenantaa tietoa solujen elinkelpoisuudesta, mikä puolestaan ​​on suoraan verrannollinen mitokondrioiden dehydrogenaasientsyymeihin.

Saadut tulokset osoittivat, että kversetiinin läsnäolo pitoisuuksina 100 ja 200 uM lisäsi elävien solujen määrää. Samanlaisia ​​tuloksia saivat Bao et ai. [32], joka tutkii kversetiinin vaikutusta PC-12-soluihin. Samoilla kversetiinitasoilla tutkittiin myös LDH:n vuotoa solunulkoiseen ympäristöön, joka antaa tietoa solukalvon hajoamisesta. Saadut tulokset osoittivat, että testattujen solujen kalvot eivät vaurioituneet tällaisissa olosuhteissa. Boots et ai. [2], tutkiessaan kversetiinin vaikutuksia keuhkojen epiteelisoluihin, havaitsi samanlaisia ​​tuloksia. Tästä syystä voidaan päätellä, että näillä pitoisuuksilla kversetiinillä on positiivinen vaikutus soluihin, mikä lisää niiden elinkelpoisuutta.

Toinen tärkeä näkökohta kversetiinin vaikutusmekanismissa liittyy sen antioksidanttisiin ominaisuuksiin. Tutkitun polyfenolin vaikutuksen arvioimiseksi suoritettiin kokeita, joissa tarkistettiin, onko kversetiinillä suojaava rooli soluissa, jotka ovat alttiina oksidatiiviselle stressille. Oksidatiivinen stressi synnytettiin tuomalla H, O2 soluympäristöön.Cistanche muistin parantamiseenKuten tässä tutkimuksessa osoitettiin, vetyperoksidi aiheuttaa merkittävää solukuolleisuutta, ilmaistuna mitokondrioiden vaurioina.

Kun SK-N-SH-soluja viljeltiin 3 tuntia väliaineessa, joka sisälsi 3 ja 5 mM H202:ta, solujen elinkelpoisuus laski noin 44 prosenttiin käsittelemättömien solujen elinkelpoisuudesta (MTT-määritys). Tutkimukset osoittivat, että solujen 24 tunnin esikäsittely kversetiinillä lisää elävien solujen määrää H2O2:lla käsiteltyihin soluihin verrattuna. Suematsu et ai. [13] raportoi samankaltaisista vaikutuksista.

Mittasimme myös MDA:n tason, joka on hapettumisstressin biomarkkeri lipidiperoksidaation lopputuotteena[33]. Solujen esikäsittely korkeilla kversetiinipitoisuuksilla, jota seurasi vetyperoksidin lisääminen, johti MDA-pitoisuuden lievään nousuun verrattuna soluihin, jotka altistettiin yksinään HO:lle. Tämä voi johtua siitä, että kversetiini (korkeammilla pitoisuuksilla) voi myös läpikäydä oksideja pelkistävän aktivaation ja olla redox-kierron kohteena, jolloin syntyy solunsisäisesti reaktiivisia happilajeja [34].

Kversetiinillä ja H2O2:lla käsiteltyjen solujen kalvon tuhoutumisessa (kuten muuttumaton LDH-taso osoittaa) ei tapahtunut merkittäviä muutoksia verrattuna tapaukseen, jossa solut altistettiin vain oksidatiiviselle stressille. Siksi voidaan päätellä, että huolimatta lipidiperoksidaation lisääntymisestä (korkeilla kversetiinipitoisuuksilla), tämä ei ollut tarpeeksi merkittävää tuhoamaan kalvoja ja häiritsemään niiden jatkuvuutta.

Natiivijärjestelmälle saadut havainnot kohtasivat mallijärjestelmästä saadut havainnot, joissa on mahdollista kontrolloida tarkasti sekä kversetiinin pitoisuutta että stressitasoa. Tarkastettiin, kuinka neuroblastoomakalvon lipidiosa kestää oksidatiivista stressiä. Stressiolosuhteet luotiin lisäämällä puskuriin otsonia, jossa vesiympäristön otsonissa tapahtuu hajoamisreaktioita muodostaen oksidatiivisia radikaaleja, muun muassa hydroksyyliradikaaleja ja superoksidianioniradikaaleja [35]. Saatu reaktiivisten happilajien seos vastaa soluissa luonnostaan ​​esiintyviä, johtuen redox-tilan häiriön epätasapainosta [36-38].

Stressin vaikutuksesta isotermien muoto muuttui, mikä osoittaa, että tiheästi pakattu yksikerroksinen pinta-ala yksittäistä molekyyliä kohden pieneni merkittävästi. Tällaiset muutokset tapahtuivat rasvahappoketjujen tyydyttymättömien sidosten hapettumisen vuoksi. Tämä vaikutus lisääntyi otsonipitoisuuden noustessa noin {{0}},3 ppm:iin, ja sitten tämä isotermiparametri pysyi samalla tasolla huolimatta ROS:n kasvusta. Tämä tarkoittaa, että noin 0,3 ppm:n otsonipitoisuudessa kaikki yksikerroksisessa kerroksessa olevat tyydyttymättömät rasvahapot hapettuivat (neuroblastoomamallissa tyydyttymättömien rasvahappojen kokonaismäärä oli 52 prosenttia).

Hapetetuilla yksikerroksisilla kerroksilla on huomattava jäykkyys,cistanche kiinaksikuten Cs-1-arvo edustaa (mitä suurempi tämän parametrin arvo on, sitä suurempi on kerroksen jäykkyys). Kversetiinin läsnä ollessa, jopa alhaisella pitoisuudella (6,25 μM), otsonille altistetun kalvon modifikaatiot, jotka näkyivät Alim-arvon muutoksilla, vähenivät merkittävästi (kuva 5a), mikä todistaa tämän yhdisteen antioksidanttisen vaikutuksen. . On kuitenkin syytä huomata, että vaikka kversetiini pyyhkäisi radikaalit ja suojeli tyydyttymättömiä rasvahappoja hapettumiselta, se ei kääntänyt kalvon jäykkyyden muutoksia (kuva 5b).

Siten on osoitettu, että kversetiinillä on antioksidanttivaikutus, mutta sen pelkkä läsnäolo lipidimolekyylien välillä vaikuttaa (määrittelee) laverin parametreihin, eli huolimatta rasvahappoketjujen suojauksesta hapettumista vastaan, kalvon jäykkyys laski merkittävästi (Cs- Arvostan noin 25 prosenttia vertailua alhaisemmaksi).

Nämä tulokset osoittavat, että kalvon muutos on tärkein tekijä kversetiinin läsnäolosta johtuvissa soluvaikutuksissa. Kuitenkin tämän muutoksen seuraukset (signaloinnin muutos, kuljetus) vaihtelevat riippuen polyfenolimolekyylien lukumäärästä, kalvon alkuperäisestä koostumuksesta ja solun toiminnasta. Tämä selittää, miksi kversetiinillä on eri olosuhteissa ja eri tutkimuksissa suojaava vaikutus, kun taas toisissa päinvastoin.

Korkean oksidatiivisen stressin tilanteessa antioksidanttivaikutus auttaa solua suojaamalla sen komponentteja vaurioilta. Jos kalvoja kuitenkin modifioidaan merkittävästi sijoittamalla tämä yhdiste ympäristöönsä, mikä johtaa signalointi- tai kuljetusreittien jakautumiseen muuttuneen kalvon jäykkyyden vuoksi, tämä voi johtaa epäsuotuisiin vaikutuksiin. On myös muistettava, että solussa tapahtuu samanaikaisesti monia prosesseja, sekä kalvoihin liittyviä että oksidatiivista stressiä aiheuttavia. Vaikutus, joka voidaan havaita ja mitata määrittämällä tiettyjen tunnuslukujen taso, on aina kokonaisvaltainen. Tästä syystä on tilanteita, joissa kversetiinin vaikutus koetaan suotuisaksi ja epäsuotuisaksi.

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Materiaalit

Neuroblastoomasolujen kalvon lipidiosan mallin koostumus määritettiin julkaisun [39-41] tekijöiden työn perusteella. Fosfolipidit: 1-oleoyyli-2-palmitoyyli-sn-glyseroli-3-fosfokoliini; 1-heksakosanoyyli-d4-2-hydroksi-sn-glyseroli-3-fosfokoliini; 1,2-dioleoyyli-sn-glyseroli-3-fosfokoliini; L- -fosfatidyylietanoliamiini (aivot); sfingomyeliini (aivot) (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA). Kolesteroli ostettiin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Saksa). Fosfolipidien ja kolesterolin välinen suhde oli 79-21 prosenttia. Tyydyttyneiden ja tyydyttymättömien rasvahappojen suhde oli 48 prosenttia 52 prosenttiin.

Kemiallisen puhtauden liuottimet (kloroformi, etanoli) - Poch (Gliwice, Puola); HLP 5 Hydrolabin (Straszyn, Puola) tuottama juuri deionisoitu vesi. Viljelyalusta, seerumi ja antibiootit ostettiin CytoGen GmbH:lta. Kokeissa käytetyt kemialliset reagenssit saatiin Sigma Aldrichilta.

4.2. Soluviljelmä

Ihmisen neuroblastoomasolulinjaa SK-N-SH (European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC)) viljeltiin 10 prosentissa naudansikiön seerumissa (FBS) Dulbeccon Modified Eagle Mediumissa (DMEM), jota oli täydennetty 0,01 prosentilla penisilliiniä. -streptomysiini 37 asteessa kosteassa ilmakehässä, joka sisältää 5 prosenttia CO2:ta.

4.3. Solujen elinkelpoisuuden mittaaminen (MTT-määritys)

Solut kylvettiin {{0}}kuoppalevylle tiheydellä 1 × 104 solua kuoppaa kohti 0,1 ml:n tilavuudessa. Soluja käsiteltiin 24 tuntia erilaisilla kversetiinin pitoisuuksilla (3.75-200 μM）. Tämän ajan jälkeen lisättiin 3 mM ja 5 mM vetyperoksidia 3 tunnin ajan. Erojen puuttumisen vuoksi HO2 pitoisuuksilla 3 ja 5 μM, tilastollisissa tutkimuksissa niitä käsiteltiin samoina hoitoina ja kuvattiin 3-5 uM H2O2-käsittelynä.

Sen jälkeen 50μL MTT（3-【4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli】-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi)-liuosta (5:n steriili kantaliuos) mg/ml) lisättiin soluihin ja inkuboitiin 2 tuntia 37 asteessa kostutetussa 5 % CO, ilmakehässä. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 0,4 ml dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja pidettiin 10 minuuttia. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantin optinen tiheys mitattiin 570 nm:ssä käyttäen mikrolitralevylukijaa (BioTek Instruments, VT, USA).

4.4. Mem1brane Damage Assay (LDH-määritys)

Laktaattidehydrogenaasi (LDH) -määritystä käytettiin solukalvon kokonaisuuden markkerina.

Solut määränä 1 × 1{{10}}* kuoppaa kohti kylvettiin 96-kuoppalevylle ja inkuboitiin kversetiinin (3.75-200 μM）) läsnä ollessa. 24 tunnin ajan; Sitten lisättiin 3 mM ja 5 mM H20 3 tunnin ajaksi. Putkiin, jotka sisälsivät 0,5 ml 0,75 mM natriumpyruvaattia ja 10 uL NADH (140 µM) (kuumennettiin 37 °C:ssa 10 minuuttia), lisättiin 150 µl supernatanttia ja inkuboitiin 37 astetta 30 minuuttia lämpötilassa. Sitten näytteeseen lisättiin 0,5 ml 2,4-dinitrofenyylihydratsiinia ja 1 tunnin kuluttua mitattiin absorbanssi 450 nm:ssä.

4.5. Lipidiperoksidaation (MDA-pitoisuuden) määritys

Kalvon lipidiperoksidaatio arvioitiin tiobarbituurihapon (TBA) reaktiolla malondialdehydin (MDA) kanssa. Solut kylvettiin {{0}}kuoppalevyille, jotka sisälsivät kversetiiniä ja H, O2:ta (yllä kuvatuina pitoisuuksina ja aikoja) 1 × 104 solua per kuoppa tilavuudessa { {10}},25 ml. Käsittelyn jälkeen näytteet kerättiin ja sentrifugoitiin (1000×&,5 min). Pelletteihin lisättiin 0,5 ml 0,5-prosenttista TCA:ta, vorteksoitiin 1 minuutin ajan ja hajotettiin sonikoiden 5 minuutin ajan. Kun oli sentrifugoitu 10 000 x g:llä 10 minuutin ajan, 0,4 ml supernatanttia lisättiin 1,25 ml:aan 20 % TCA:ta, jossa oli 0,5 % TBA:ta, ja kuumennettiin kuivassa lämpölohkossa (100 astetta) 30 minuuttia. Jäähdytyksen jälkeen absorbanssi mitattiin aallonpituudella 532 nm käyttämällä MDA:n molaarista ekstinktiokerrointa, joka on 155 M-1 cm-1.

4.6. Mallikalvot

Puskuriotsonointi. Fosfaattipuskuri (0,01 M, pH 7,4) kyllästettiin otsonilla, joka oli tuotettu otsonigeneraattorilla FM 500 (Grekos, Puola). Otsonin pitoisuus puskurissa määritettiin Baderin ja Hoignen [42] mukaan.

Pintapaineen isotermit.cistanche peniksen kasvuPintapaineisotermien rekisteröintiin käytettiin Langmuirin kourua (KSV, Suomi) vakiopuristusnopeudella, joka vastaa 5 mm/min estenopeutta. Lipidiyksikerros muodostettiin levittämällä määrätty määrä lipidikloroformiliuosta pitoisuudella 1 mg/ml alafaasille, joka koostui vesipitoisesta 0,01 M fosfaattipuskurista, pH 7,4 kversetiinin kanssa tai ilman sitä ja otsonin kanssa tai ilman. Pintajännitykset mitattiin Pt-Wilhelmy-levyllä. Kokeet suoritettiin 25 astetta ± 1 astetta.

4.7. Tilastollinen analyysi

Kullekin testatulle variantille suoritettiin kolmesta kuuteen riippumatonta analyysiä ja laskettiin keskiarvo (±SD). Merkittävät erot verrokkeihin verrattuna arvioitiin käyttämällä SAS ANOVA -menettelyä. Tilastollinen analyysi suoritettiin Duncanin monialuetestillä, ottaen p<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">

Tekijän panokset: Conceptualization, BK, BD ja ER-S.methodology, BKBD; ohjelmisto, BK, BDvalidation, BK, BD, ER-S., ABkirjoitus – alkuperäisen luonnoksen valmistelu BK, BD, ER-S., kirjoittaminen – tarkistus ja editointi, BK, BD, ER-S., ABvisualisointi, BK, BDsupervision, BK, BD, ER-S., ABAKaikki kirjoittajat ovat lukeneet käsikirjoituksen julkaistun version ja hyväksyneet sen.

Rahoitus:Tämä tutkimus ei saanut ulkopuolista rahoitusta.

Institutional Review Boardin lausunto: Ei sovellettavissa.

Ilmoitettu suostumuslausunto: Ei sovellettavissa.

Tietojen saatavuusilmoitus: Tiedot sisältyvät artikkeliin. Eturistiriidat: Kirjoittajat eivät julista eturistiriitoja.

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Molecules 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules