Asyloidut fenyylietanoidioligoglykosidit, joilla on maksasuojaavaa vaikutusta autiomaakasvista Cistanche tubulosasta

lisätietoja:Ali.ma@wecistanche.com

Toshio Morikawa et ai

Abstrakti

Metanoliuute tuoreista varreistaCistanche tubulosa(Orobanchaceae) havaittiin osoittavan hepatosuojaavia vaikutuksia D-galaktosamiinin (D-GalN)/lipopolysakkaridin (LPS) aiheuttamaa maksavauriota vastaan ​​hiirissä. Otteesta kolme uuttafenyylietanolioligoglykosidit, kankanosidit H1 (1), H2 (2) ja I (3), eristettiin yhdessä 16:n kanssafenyylietanoidiglykosidit(4–19) ja kaksi asyloitua oligosokeria (20,21). Kohteiden 1–3 rakenteet määritettiin spektroskooppisten ominaisuuksien ja kemiallisten todisteiden perusteella. Isolaattien joukossa ekinakosidi (4, IC50=10,2 lM), akteosidi (5, 4,6 lM), isoakteosidi (6,5,3 lM), 20-asetyylilakteosidi (8, 4,8 lM) ja tubulosidi A (10, 8,6 lM) esti D-GalN:n aiheuttamaa hepatosyyttien kuolemaa. Nämä viisi isolaattia, 4 (31,1 lM), 5 (17,8 lM), 6 (22,7 lM), 8 (25,7 lM) ja 10 (23,2 lM) ja cistantubulosidi B1 (11, 21,4 lM) vähensivät myös TNF-a- indusoi sytotoksisuus L929-soluissa. Lisäksi pääaineosat (4–6) osoittivat maksan suojaavia vaikutuksia in vivo annoksilla 25–100 mg/kg, PO.

Klikkaa nähdäksesi cistanchen sivuvaikutukset ja Cistanche-tuotteet

1. Esittely

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) on yksivuotinen loiskasvi, joka kasvaa Salvadora- tai Calotropis-lajien juurissa ja on levinnyt Pohjois-Afrikassa, Arabiassa ja Aasian maissa.2 VarretCistanche tubulosasamoin kuin avustavaa salsaa ja Cistanche deserticolaa on perinteisesti käytetty impotenssin, hedelmättömyyden, lumbagon ja kehon heikkouden hoitoon sekä verenkiertoa edistävänä aineena.2,3 Aiemmin useitafenyylietanolis, iridoidit, monoterpeenit ja lignaanit eristettiin Kiinasta ja PakistanistaCistanche tubulosa.2,4–9 Tämän luonnonlääkkeen bioaktiivisten aineosien karakterisointitutkimuksissamme raportoimme aiemmin, että viisi iridoidia, kankanosidi A–D ja kankanoli, monoterpeeniglykosidi, kankanosidi E, kaksifenyylietanolioligoglykosideja, kankanosideja F ja G (23) ja asyloitua oligosokeria, kankanoosia (21), eristettiin kuivattujen varsien metanoliuutteesta.Cistanche tubulosa.10,11 Lisäksi metanoliuutteen ja useiden isolaattien, kuten ekinakosidin (4), akteosidin (5), cistanosidin F (20), 21:n ja kankanosidi F:n, havaittiin osoittavan verisuonia relaksoivaa vaikutusta, toisin sanoen indusoituja supistuksia estäviä vaikutuksia. noradrenaliinilla eristetyssä rotan rintaaortassa.11 Jatkuvissa tutkimuksissamme kasvin ainesosista, metanoliuute tuoreista varrestaCistanche tubulukset olihavaittiin osoittavan suojaavaa vaikutusta D-galaktosamiinin (D-GalN)/lipopolysakkaridin (LPS) aiheuttamaan maksavaurioon hiirillä. Metanoliuutteesta olemme eristäneet kolme uuttafenyylietanolioligoglykosidit nimeltä kankanosids H1 (1), H2 (2) ja I (3) yhdessä 16 fenyylietanoidiglykosidin (4–19) ja kahden asyloidun oligosokerin (20, 21) kanssa. Tämä artikkeli käsittelee näiden uusien eristämistä ja rakenteellista selvitystäfenyylietanolioligoglykosidit (1–3). Fenyylietanoliglykosidien rakenteellisia vaatimuksia hepatoprotektiiviselle aktiivisuudelle käsitellään myös (kuva 1).

2. Tulokset ja keskustelu

2.1. Varresta peräisin olevan metanoliuutteen suojaava vaikutusCistanche tubulosaD-GalN/LPS:n aiheuttamaan maksavaurioon hiirillä

Tuoreet varretCistanche tubulosa(viljelty Urumqissa, Xinjiangin maakunnassa, Kiinassa) uutettiin metanolilla palautusjäähdyttäen, jolloin saatiin metanoliuute (8,36 prosenttia tuoreista varresta). Kuten taulukosta 1 käy ilmi, annoksilla 250–500 mg/kg, PO, metanoliuutteet osoittivat estävää vaikutusta seerumin aspartaattiaminotransaminaasien (sAST) ja alaniiniaminotransaminaasien (sALT) nousuun, jotka ovat D- GalN/LPS hiirissä.

2.2. Kemialliset aineosat varrestaCistanche tubulosa

Metanolipitoinen uute tuoreista varreistaCistanche tubulosaaltistettiin Diaion HP-20 -pylväskromatografialle (H2O?MeOH), jotta saatiin H20- ja MeOH-eluoituja fraktioita (5,63 prosenttia ja 2,73 prosenttia, vastaavasti). MeOH:lla eluoitu fraktio altistettiin SiO2- ja ODS-kolonnikromatografialle ja lopuksi HPLC:lle, jolloin saatiin kolme uuttafenyylietanolioligoglykosidit, kankanosidit H1 (1, 0.0008 prosenttia ), H2 (2, 0,0001 prosenttia ) ja I (3, 0,0007 prosenttia ) yhdessä 16:n kanssafenyylietanoidiglykosidit, ekinakosidi2,11 (4, 0,45 prosenttia ), akteosidi2,11 (5, 0,28 prosenttia ), isoakteosidi2,11 (6, 0.0 41 prosenttia ), cis-akteosidi12,13 (7, 0.0007 prosenttia ), 20-asetyylilakteosidi2,11 (8, {{ 42}}.0{{50}}38 prosenttia ), kofeoyylilakteosidi14 (9, 0.0002 prosenttia ), tubuluspuoli A2,11 (10, 0,013 prosenttia), cistantubulosidit B19 (11, 0,0020 prosenttia), B29 (12,0,0003 prosenttia), arenariosidi15 (13, 0,0006 prosenttia), wiedemanninosidi C16 (14,0,0008 prosenttia), cistantubulosidi A9 (15, 0,0009 prosenttia), syringalidi A 30-OaL ramnopyranosidi4 (16, 0,0017 prosenttia), kampneosidit I17,18 (17,0,8) ja II17 (17,0,8) , 0,0005 prosenttia) ja salidrosidi11 (19, 0,0027 prosenttia) ja kaksi asyloitua oligosokeria, cistanosidi F11 (20, 0,0004 prosenttia) ja kankanoosi11 (21, 0,0004 prosenttia).

2.3. Kananosidien H1 (1), H2 (2) ja I (3) rakenteet

Kankanosidi H1 (1) saatiin valkoisena jauheena, jolla oli negatiivinen optinen rotaatio (½a-24D-45,3 MeOH:ssa). Sen IR-spektri osoitti absorptiokaistat kohdissa 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1{{107}70 ja 1040 cm 1, jotka voidaan katsoa johtuvan hydroksyyleistä, esterifunktioista karbonyyleistä ja eetterifunktioista. ja aromaattiset renkaat. Positiivisten ja negatiivisten ionien FABMS-spektrit 1 osoittivat kvasimolekylaariset ionihuiput arvoilla m/z 835 (M plus Na) plus ja m/z 811 (MH), vastaavasti, ja molekyylikaava määritettiin C37H48O20:ksi korkearesoluutioisella positiivisella ioni FABMS-mittaus. 1:n 1H- ja 13C-NMR-spektrit (CD3OD, taulukot 2 ja 3), jotka määritettiin useilla NMR-kokeilla19, osoittivat signaaleja, jotka voidaan osoittaa kahdelle metyleenille [d 2,70 (2H, m, H2-7), 3,66 , 4,07 (1H kumpikin, molemmat m, H2-8)], orto- ja metakytketyt ABC-tyyppiset aromaattiset protonit [d 6,52 (1H, dd, J=1.8,7,8 Hz, H{ {50}}), 6,65 (1H, d, J=1,8 Hz, H-2), 6,67 (1 H, d, J=7,8 Hz, H{62) }})], kaksi bD-glukopyranosyyliosaa [d 4,29 (1H, d, J=7,8 Hz, terminaali-Glc-H-1), 4,54 (1H, d, J {{76) }},2 Hz, sisä-Glc-H-1)] ja aa-L-ramnopyranosyyliosa [d 1,06 (3H, d, J=6,0 Hz, Rha-H{{89) }}), 4,80 (1H, br s, Rha-H-1)] yhdessä asetyyliryhmän [d 1,98(3H, s)] ja trans-p-kumaroyyliryhmän kanssa {trans-olefiini [d 6,34, 7,67 (1H kumpikin, molemmat d, J=16,0 Hz, H-8 ja 7)] ja orto-kytketyt A2B2--tyyppiset aromaattiset protonit [d 6,80, 7,46 (kukin 2H) , molemmat d,J=8.7 Hz, H-3,5 ja 2,6)]}. Oligoglykosidi- ja asyyliosien väliset yhteydet kohdassa 1 karakterisoitiin HMBC-kokeella, joka osoitti pitkän kantaman korrelaatioita seuraavien protoni- ja hiiliparien välillä: sisä-Glc-H-1 ja C-8 (dC71.9) ); sisä-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, dd-kaltainen)] ja asetyylikarbonyylihiili (dC 171,4); sisä-Glc-H-4 [d 5,08 (1H, dd, J=9,6, 9,6 Hz)] ja p-kumaroyylikarbonyylihiili (dC 168,2); Rha-H-1 ja sisä-Glc-C-3 (dC 80,5); ja terminaali-Glc-H-1 ja sisempi-Glc-C-6 (dC69.3) (kuva 2). Lopuksi 1:n alkalinen hydrolyysi 5-prosenttisella kaliumhydroksidilla (KOH) vapautti trans-p-kumaarihappoa, joka tunnistettiin HPLC-analyysillä, yhdessä deasyloidun tuotteen kanssa. Deasyloitua tuotetta käsiteltiin peräkkäin 1,0 M kloorivetyhapolla (HCl) L-ramnoosin ja D-glukoosin vapauttamiseksi, jotka tunnistettiin HPLC-analyysillä käyttäen optista rotaatiodetektoria.10,11 Siten kankanosidi H1:n rakenne selvitettiin olevan {{181 }}(3,4-dihydroksifenyyli)etyyli OaL-ramnopyranosyyli-(1- 3)-[bD-glukopyranosyyli-(1-6)]-2-O-asetyyli{{196 }}O-trans-p-kumaroyyli-bD-glukopyranosidi (1).

Kankanosidi H2 (2) eristettiin valkoisena jauheena negatiivisella optisella rotaatiolla (½a 25 D 52,4 MeOH:ssa). Sen molekyylikaavan C37H48O20 todettiin olevan sama kuin kaavan 1 korkearesoluutioisella positiivisen ionin FABMS-mittauksella. Yhdisteen 2 spektroskooppiset ominaisuudet olivat hyvin samankaltaiset kuin 1:n, lukuun ottamatta cis-p-kumaroyyliryhmästä johtuvia signaaleja [d 5,79, 6,95 (1H kumpikin, molemmat d, J=12,8 Hz, H{{ 22}} ja 7), 6,76, 7,73 (2H kumpikin, molemmat d, J=8,7 Hz, H-3,5 ja 2,6)]. Lisäksi HMBC-koe 2:lla paljasti myös samanlaisia ​​pitkän kantaman korrelaatioita kuin ne, jotka havaittiin 1:lle seuraavien protoni- ja hiiliparien välillä: sisä-Glc-H-1 [d 4,51 (1H, d, J {{44) }},8 Hz)] ja C-8 (dC 72,0); sisä-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, m)] ja asetyylikarbonyylihiili (dC 171,4); sisä-Glc-H-4 [d 4,98 (1H, dd, J=9,6, 9,7 Hz)] ja p-kumaroyylikarbonyylihiili (dC 166,7); Rha-H-1 [d 4,77 (1H, d, J=1,4 Hz, Rha-H-1)] ja sisä-Glc-C-3 (dC 80,7) ); ja terminaali-Glc-H-1 [d 4,28 (1H, d, J=7,8 Hz)] ja sisempi-Glc-C-6 (dC 69,4) (kuva 2) . Hajoamistutkimuksessa 2 antoi cis-p-kumaarihappoa ja kaksi samaa sokeria kuin ne, jotka saatiin tapauksessa 1. Näin ollen kankanosidi H2:n rakenne selvisi olevan 2-(3,4- dihydroksifenyyli)etyyli OaL-ramnopyranosyyli-(1-3)-[bD-glukopyranosyyli-(1-6)]-2-O-asetyyli-4-O-cis-p-kumaroyyli- bD-glukopyranosidi (2).

Kankanosidi I (3) eristettiin myös valkoisena jauheena, jolla oli negatiivinen optinen rotaatio (½a- 25D-62,2 MeOH:ssa). Sen molekyylikaava C35H46O18 määritettiin positiivisilla ja negatiivisilla FABMS- ja HRFABMS-mittauksilla. 3:n (CD3OD, taulukot 2 ja 3) spektroskooppiset ominaisuudet olivat päällekkäisiä ekinakosidin (4) ominaisuuksien kanssa, lukuun ottamatta aglykoniosasta johtuvia signaaleja {{kaksi metyleeniä {d 2,95 (2H, dd, J=7). 3, 7,8 Hz, H2-7), [3,79 (1H, m), 4,10 (1H, dt, J=16.9, 7,3 Hz), H{{32} }]}, monosubstituoidut aromaattiset protonit [d7,18 (1H, m, H-4), 7,26-7,28 (4H, m, H-2,6, 3,5)]}}. Yhdisteen 3 alkalinen hydrolyysi 5-prosenttisella KOH:lla vapautti trans-kahvihapon, ja deasyloitua tuotetta käsiteltiin peräkkäin 1,0 M HCl:lla L-ramnoosin ja D-glukoosin vapauttamiseksi. Lopuksi asyyliryhmän ja 3:n sokeriosien kytkennät selvitettiin HMBC-kokeella, kuten kuvassa 2. Edellä mainitun todisteen perusteella kankanosidi I:n rakenteen selvitettiin olevan 2-fenyylietyyli-OaL- ramnopyranosyyli-(1-3)-[bD-glukopyrano-syyli-(1-6)]-4-O-trans-kofeoyyli-bD-glukopyranosidi (3)

2.4. Cistanche tubulosan varresta peräisin olevien kemiallisten ainesosien vaikutukset D-GalN:n aiheuttamaan sytotoksisuuteen primaarisissa viljellyissä hiiren maksasoluissa

D-GalN/LPS:n aiheuttaman maksavaurion tiedetään kehittävän immunologisia vasteita.19 Tämän tyyppisen maksavaurion on raportoitu esiintyvän kahdessa muodossa. Ensinnäkin D-GalN lisää herkkyyttä TNF-a:lle, koska ofuridiinitrifosfaatti ehtyy hepatosyyteistä. Toiseksi tulehdusta edistävät välittäjät, kuten NO ja TNF-a, vapautuvat LPS-aktivoiduista makrofageista (Kupfferin solut). TNF-a:n aiheuttaman maksasolujen apoptoosin on raportoitu olevan tärkeä rooli D-GalN/LPS:n aiheuttamassa maksavauriossa.20

Aiemmissa tutkimuksissamme luonnonlääkkeiden hepatoprotektiivisista yhdisteistä raportoimme, että useat ainesosat ovat peräisin Hovenia Dulcisista, 21 Bupleurum scorzonerifolium, 22, 23 Curcuma zedoaria, 24–26 Angelica furcijuga, 27, 28 Betula sativum, 30 Salacia reticulata,31,2 hierochuntica, 33 Panax notoginseng, 34 Cyperus longus, 35 Erycibe expansa, 36 Camellia sinensis, 37 Sedum sarmentosum, 38, 39 Sinocrassula indica, 40 Hedychium coronarium, 41 ja Piper chaba42, 43 osoittivat D-Gal-vaurion aiheuttamia vaikutuksia hiirissä ja/tai platyphylla var. japonica,29 Pisumia estävä vaikutus D-GalN-indusoituun sytotoksisuuteen primaarisissa viljellyissä hepatosyyteissä. Koska metanolipitoinen uute varrestaCistanche tubulosaosoitti hepatoprotektiivisia vaikutuksia D-GalN/LPS:n aiheuttamaan maksavaurioon hiirillä (vide ante), ainesosien estävä vaikutus D-GalN:n aiheuttamaan sytotoksisuuteen primaarisesti viljellyissä hiiren maksasoluissa tutkittiin käyttämällä 3-(4,{) {6}}dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) -määritys. Kuten taulukosta 4 näkyy, ekinakosidi (4, IC50=10,2 lM), akteosidi (5, 4,6 lM), isoaseteosidi (6, 5,3 lM), 20-asetyylilakteosidi (8, 4,8 lM), tubulosidit A (10,8,6 lM) ja B11 (22, 14,6 lM) ja kankanosidi G11 (23, 14,8 lM) osoittivat voimakasta aktiivisuutta. Niiden aktiivisuus oli suurempi kuin kaupallisen silybiinin (38,8 lM),33–43 positiivisena kontrollina.44,45fenyylietanoidiglykosidit for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 lM)]; (2) aglykoni, jossa oli 3,4-dihydroksiryhmä, osoitti voimakkaampaa aktiivisuutta kuin se, jolla oli 4-hydroksiryhmä (6 > 23); (3) 60-ObD-glukopyranosyyliosa vähensi aktiivisuutta (4 < 5,10="">< 8);="" (4)="" 8-obd-glukopyranosyyliosa,="" jossa="" oli="" 40-o-kofeoyyliryhmä,="" osoitti="" voimakkaampaa="" aktiivisuutta="" kuin="" se,="" jossa="" oli="" 60-o-kofeoyyliryhmä="" (5="6," 8=""> 22). ); ja (5) 20-O-asetyyliosan lisääminen vähensi aktiivisuutta (8 5 5, 22 <>

Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 lM, tietoja ei esitetty). Siten näiden yhdisteiden ei havaittu vaikuttavan NO:n ja TNF-a:n ylituotantoon LPS-aktivoiduista makrofageista.

2.5. Kemiallisten aineosien vaikutukset TNF-a:n aiheuttamaan sytotoksisuuteen L929-soluissa

Aineosien vaikutusten selvittämiseksi hepatosyyttien herkkyyteen TNF-a:lle, TNF-a:n aiheuttama L929-solujen elinkelpoisuuden väheneminen, TNF-a-herkkää solulinjaa48 tutkittiin käyttämällä MTT-määritystä. Ilman testinäytteitä solujen elinkelpoisuus väheni n. 60 prosenttia sen jälkeen, kun soluja oli inkuboitu 20 ng/ml TNF-a:n kanssa 44 tunnin ajan verrattuna tapaukseen ilman TNF-a:ta. Kuten taulukosta 5 näkyy, ekinakosidi (4, IC50=31,1 lM), akteosidi (5, 17,8 lM), isoaseteosidi (6, 22,7 lM), 20-asetyylilakteosidi (8, 25,7 lM), tubulosidi A (10,23,2 lM) ja cistantubulosidi B1 (11, 21,4 lM) estivät solujen elinkelpoisuuden laskua, ja niiden aktiivisuudet havaittiin suurempia kuin piperiinin42,43 ja silybiinin. Rakenteelliset vaatimuksetfenyylietanoidiglykosidit for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 lM)]; ja (5) 20-O-asetyyliosan lisääminen vähensi aktiivisuutta (8 < 5,="" 22="">< 6).="" nämä="" vaatimukset="" havaittiin="" samanlaisiksi="" kuin="" edellisessä="" luvussa="" havaitut="" vaatimukset,="" jotka="" koskivat="" estäviä="" vaikutuksia="" d-galn:n="" aiheuttamaan="" sytotoksisuuteen="" primaarisissa="" viljellyissä="" hiiren="">

Nämä in vitro -löydökset viittaavat seuraaviin mahdollisiin vaikutusmekanismeihin varren ainesosien hepatosuojaavalle vaikutukselleCistanche tubulosa: (i) D-GalN:n aiheuttaman sytotoksisuuden väheneminen (4–6, 8, 10, 22 ja 23) ja (ii) TNF-a:n aiheuttaman sytotoksisuuden väheneminen (4–6, 8, 10 ja 11) .

2.6. Ekinakosidin (4), akteosidin (5) ja isoakteosidin (6) suojaavat vaikutukset D-GalN/LPS-hiirien aiheuttamaa maksavauriota vastaan ​​ja niiden vaikutustapa

Lopuksi tarkastelimme pääoman vaikutustafenyylietanoidiglykosidit, ekinakosidi (4), akteosidi (5) ja isoakteosidi (6) D-GalN/LPS:n aiheuttamassa maksavauriossa hiirillä. Kuten taulukoista 6 ja 4-6 näkyy, esti merkittävästi D-GalN/LPS:n indusoimaa sAST:n ja sALT:n kasvua hiirillä annoksilla 25-100 mg/kg, PO. Toisaalta 4–6 ei vaikuttanut TNF-a:n ylituotantoon LPS-aktivoiduista makrofageista. Lisäksi 4–6 esti merkittävästi TNF-a:n aiheuttamaa L929-solujen kuolemaa, mikä viittaa L929-solujen herkkyyden vähenemiseen TNF-a:lle (vide ante). Nämä havainnot viittaavat siihen, että 4–6 vähentävät näiden solujen herkkyyttä TNF-a:n aiheuttamalle sytotoksisuudesta. Monia yhdisteitä, jotka estävät D-GalN:n indusoimaa solukuolemaa ja TNF-a:n tuotantoa, on raportoitu,24,26,32, mutta on raportoitu muutamia yhdisteitä, jotka selektiivisesti vähentävät maksasolujen herkkyyttä TNF-a:lle.42,43,49,50

Lopuksi tuoreista varretCistanche tubulosa, kolme uuttafenyylietanoidiglykosidit, kankanosidit H1 (1), H2 (2) ja I (3) yhdessä 16 tunnetun kanssafenyylietanoidiglykosidit(4-19) ja kaksi asyloitua oligosokeria (20, 21) eristettiin. Rakenteelliset vaatimukset niiden suojaaville vaikutuksille D-GalN:n aiheuttamille hepatosyyttivaurioille ja TNF-a:n aiheuttamille sytoprotektiivisille vaikutuksille L929-soluihin olivat seuraavat; (1) aglykoniosa oli välttämätön aktiivisuudelle; (2) aglykoni, jossa oli 3,4-dihydroksiryhmää, osoitti voimakkaampaa aktiivisuutta kuin se, jossa oli 4-hydroksiryhmä; (3) 60-ObD-glukopyranosyyliosa vähensi aktiivisuutta; (4) 8-ObD-glukopyranosyyliosa, jossa oli 40-O-kofeoyyliryhmiä, osoitti voimakkaampaa aktiivisuutta kuin se, jossa oli 60-O-kofeoyyliryhmä; ja (5) {{27 }}O-asetyyliosa vähensi aktiivisuutta. Lisäksi pääasiallinenfenyylietanoidiglykosidit, ekinakosidi (4), akteosidi (5) ja isoakteosidi (6) esti insAST:n ja sALT:n nousua annoksilla 25–100 mg/kg PO D-GalN/LPS:llä käsitellyillä hiirillä, ja näiden estovaikutusten ehdotettiin olevan hepatosyyttien vähentyneestä herkkyydestä TNF-a:lle. Yksityiskohtaiset toimintamekanismitfenyylietanoidiglykosiditpitäisi tutkia lisää.

3. Kokeellinen

3.1. Kenraali

Seuraavia laitteita käytettiin spektri- ja fysikaalisten tietojen saamiseksi: spesifiset kierrokset, Horiba SEPA-300 digitaalinen polarimetri (l=5 cm); UV-spektrit, Shimadzu UV-1600 -spektrometri; IR-spektrit, Shimadzu FTIR-8100 -spektrometri; 1H- ja 13C NMR-spektrit, JEOLJNM-ECA600 (600 ja 150 MHz) ja JEOL JNM-ECS400 (400 ja 100 HMz) spektrometrit tetrametyylisilaanin kanssa sisäisenä standardina; FABMS ja korkean resoluution FABMS, JEOL JMS-SX 102A massaspektrometri; HPLC-detektori, Shimadzu RID-10A taitekerroin, Shimadzu SPD-10A UV-vis ja Shodex OR-2 optiset kiertoilmaisimet. Analyyttisiin tarkoituksiin käytettiin HPLC-kolonnia, Cosmosil 5C18-MS-II-kolonnia ja pNAP-kolonnia (Nacalai TesqueInc., 250 4,6 mm id) ja (250 - 20 mm id) -kolonnia, vastaavasti.

Kromatografiassa käytettiin seuraavia koeolosuhteita: normaalifaasisilikageelipylväskromatografia (CC), silikageeli 60 N (Kanto Chemical Co., Ltd, 63–210 mesh, pallomainen, neutraali ); käänteisfaasisilikageeli CC, Diaion HP-20 (NipponRensui) ja Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100–200 mesh); normaalifaasi TLC, esipäällystetyt TLC-levyt silikageelillä 60F254 (Merck, 0,25 mm); käänteisfaasi-TLC, esipäällystetyt TLC-levyt silikageelillä RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); käänteisfaasi-HPTLC, esipinnoitetut TLC-levyt silikageelillä RP-18 WF254S(Merck, 0,25 mm), havaitseminen tehtiin ruiskuttamalla 1 % Ce(SO4)2-10 % vesipitoista H2SO4, mitä seurasi kuumennus .

3.2. Kasvimateriaali

Tuoreet varretCistanche tubulosaviljellyt Urumqissa, Xinjiangin maakunnassa, Kiinassa, kerättiin syyskuussa 2007. Yksi kirjoittajista (MY) tunnisti kasvimateriaalin. Kasvimateriaalin lahjakortti on arkistossa laboratoriossamme.

3.3. Poisto ja eristäminen

Tuoreet varretCistanche tubulosa(2,98 kg) leikattiin hienoksi ja uutettiin kolme kertaa metanolilla palautusjäähdyttäen 3 tunnin ajan. Liuottimen haihdutus alennetussa paineessa antoi metanoliuutteen (249,1 g, 8,36 prosenttia). Metanoliuute altistettiin Diaion HP 20 CC:lle (50 kg, H2O?MeOH), jolloin saatiin H2O- ja MeOH-eluoituja fraktioita (167,84 g, 5,63 prosenttia ja 81,21 g, 2,73 prosenttia). , vastaavasti). MeOH-eluoitu fraktio (61.00 g) altistettiin normaalifaasin silikageeli-CC:lle [1,8 kg, CHCl3-MeOH-H2O (15:3:0.4?1{{48}). }:3:0.5?6:4:1, v/v/v)?MeOH], jolloin saadaan seitsemän fraktiota [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0,89 g), 4 (10,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) ja 7 (4,60 g)]. Fraktio 2 (9,56 g) erotettiin käänteisfaasisilikageelillä CC [400 g,MeOH-H2O (1{{201}}:90, v. /v)-MeOH-asetoni], jolloin saadaan viisi fraktiota [Fr. 2–1 (55,9 mg), 2–2 (4,48 g), 2–3 (3,42 g), 2–4 (1,16 g) ja 2–5 (31,9 mg)]. Fraktiolle 2–3 (1.00 g) tehtiin HPLC [Cosmo sil 5C18-MS-II, CH3CN - 1 % vesipitoinen AcOH (7:93, v/). v)] antaa seitsemän murto-osaa [Fr. 2–3–1 (66,5 mg), 2–3–2 (20,4 mg), 2–3–3 (260 mg), 2–3–4 (136,6) mg), 2–3–5 (38{{300}},6 mg), 2–3–7 (84,9 mg)]. Fraktio 2–3–4 (106,6 mg) puhdistettiin edelleen HPLC:llä [Cosmosil pNAP, CH3CN - 1 % vesipitoinen AcOH (5:95, tilavuus/tilavuus)], jolloin saatiin salidrosidia (19,13,7 mg, {{340}.0{{409}}27 prosenttia ). Fraktio 4 (10,69 g) erotettiin käänteisfaasisilikageelillä CC [500 g, MeOH-H2O (30:7). 0, v/v)?MeOH?asetoni], jolloin saatiin neljä fraktiota [Fr. 4–1 (878,2 mg), 4–2 (7.06 g), 4–3 (1,57 g) ja 4–4 (792,8 mg)]. Fraktiolle 4–2 (1,5{{560} g) tehtiin HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN - 1 % vesipitoinen AcOH (2{{57{{586} }}}:80, v/v)], jolloin saadaan viisi murto-osaa {Fr. 4–2–1 (42,9 mg), 4–2–2 [= kampneosidi I (17, 67.0 mg, 0,014 prosenttia )], 4–2– 3 [= akteosidi (5, 1,21 g, 0,26 prosenttia )], 4–2–4 (41,6 mg) ja 4–2–5 (181,3 mg)}. Fraktio 4–2–4 (41,6 mg) puhdistettiin edelleen HPLC:llä [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 % vesipitoinen AcOH (18:82, tilavuus/tilavuus)], jolloin saatiin isoakteosidia (6, 19,1 mg, 0,0040 %) ja cis-akteosidia. (7,3,4 mg, 0,0007 prosenttia). Fraktio 4–3 (1,57 g) puhdistettiin HPLC:llä [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vesipitoinen AcOH (20:80, tilavuus/tilavuus)], jolloin saatiin 11 fraktiota [Fr. 4–3–1 (30,4 mg), 4–3–2 (55,2 mg), 4–3–3 (= 17, 22,1 mg, 0,0010 prosenttia), 4–3–4 (= 5) , 224,6 mg, 0,010 prosenttia ), 4–3–5 (27,4 mg), 4–3–6 (43,6 mg), 4–3–7 (= 6, 825,0 mg, 0,037 prosenttia ), 4–3 –8 [= syringa lide A 30-OaL-ramnopyranosidi (16, 37,6 mg, 0,0017 prosenttia )], 4–3–9 (39,8 mg), 4–3–10 [{{310} }asetyylilakteosidi (8, 85,4 mg, 0,0038 prosenttia )] ja 4–3–11 (64,6 mg)]. Fraktio 4-3-6 (43,6 mg) puhdistettiin edelleen HPLC:llä [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 % vesipitoinen AcOH (18:82, v/v)], jolloin saatiin kankanosideja H1 (1, 17,0 mg, 0,0008 %). ja H2 (2,3,3 mg, 0,0001 prosenttia). Fraktio 4-3-9 (39,8 mg) puhdistettiin edelleen HPLC:llä [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 % vesipitoinen AcOH (18:82, v/v)], jolloin saatiin kankanosidi I (3, 15,4 mg, 0,0007 %) ja 6 ( 3,1 mg, 0,0001 prosenttia). Fraktio 5 (8,84 g) erotettiin käänteisfaasisilikageeliCC:llä [400 g, MeOH-H2O (20:80-30:70, v/v)?MeOH?asetoni]. seitsemän murto-osaa [Fr. 5–1 (870,2 mg), 5–2 (478,9 mg), 5–3 (3,72 g), 5–4 (979,9 mg), 5–5 (1,19 g), 5–6 (1,27 g) ja 5 -7 (130,1 mg)]. Fraktio 5–1 (870,2 mg) puhdistettiin HPLC:llä [Cos mosilpNAP, CH3CN – 1 % vesipitoinen AcOH (5:95, tilavuus/tilavuus)], jolloin saatiin kofeiiniton lakteosidi (9, 5,1 mg, 0,0002 %) ja cistanosidi F ( 20, 8,1 mg, 0,0004 prosenttia). Fraktio 5–3 (3,72 g) puhdistettiin HPLC:llä [Cosmosil5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vesipitoinen AcOH (15:85, tilavuus/tilavuus)], jolloin saatiin kuusi fraktiota [Fr. 5–3–1 (128,6 mg), 5–3–2 [= kankanoosia (21, 9,4 mg, 0,0004 prosenttia )], 5–3–3 (64,6 mg), 5–3–4 (72,3) mg), 5–3–5 [= echinaco-puoli (4, 2,54 g, 0,11 prosenttia) ja 5–3–6 (318,5 mg)]. Fraktio 5-3-4 (72,3 mg) puhdistettiin edelleen HPLC:llä [Cosmosil pNAP, CH3CN - 1 % vesipitoinen AcOH (10:90, v/v)], jolloin saatiin kampneosidi II:ta (18,10,6 mg, 0,0005 %). Fraktio 5-4 (979,9 mg) puhdistettiin HPLC:llä [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN - 1 % vesipitoinen AcOH (15:85, v/v)] annetuiksi fraktioiksi [Fr. 5–4–1 (28,6 mg), 5–4–2 (90,5 mg), 5–4–3 (99,7 mg), 5–4–4 (= 4, 25,7 mg, 0,0012 prosenttia), 5 –4–5 (16,4 mg), 5–4–6 (318,5 mg), 5–4–7 (21,6 mg), 5–4–8 (= 5, 204,4 mg, 0,0091 prosenttia) ja 5–5– 4-9 (134,7 mg)]. Fraktio 5–4–6 (318,5 mg) puhdistettiin HPLC:llä [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 % vesipitoinen AcOH (15:85, v/v)], jolloin saatiin cistantubulosideja B1 (11, 44,9 mg, 0,0020 %), B2 (12). 7,6 mg, 0,0003 prosenttia) ja A (15, 21,1 mg, 0,0009 prosenttia) ja wiedemanninosidi C (14, 17,2 mg, 0,0008 prosenttia). Fraktio 5–5 (1,19 g) puhdistettiin HPLC:llä [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vesipitoinen AcOH (18:82, tilavuus/tilavuus)], jolloin saatiin tubulosidi A:ta (10, 300,3 mg, 0,013 prosenttia) ja arenariosidia (13,5,8 mg, 0,0006 prosenttia). Fraktio 6 (12,52 g) erotettiin käänteisfaasisilikageelillä CC [600 g, MeOH-H2O (20:80 - 30:70, v/v) -MeOH-asetoni], jolloin saatiin neljä fraktiota [Fr. 6–1 (553,8 mg), 6–2 (10,69 g), 6–3 (1,40 g) ja 6–4 (17,8 mg)]. Fraktio 6–2 (500,0 mg) puhdistettiin HPLC:llä [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN – 1 % vesipitoinen AcOH (25:75, tilavuus/tilavuus)], jolloin saatiin yhdiste 4 (353,1 mg, 0,34 % ).

3.3.1. Kankanoside H1 (1)

Valkoinen jauhe, ½a- 24D -45,3 (c 1,06, MeOH). Korkean resoluution positiivisten ionien FABMS: Laskettu C37H48O20Na:lle (M plus Na) plus: 835,2637. Todettu: 835,2633. UV [MeOH, nm (loge)]: 226 (4,33), 293 (sh, 4,36), 317 (4,52). IR (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070, 1044 cm{30}}. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: annettu taulukossa 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: annettu taulukossa 3. Positiivisten ionien FABMS: m/z 835 (M plus Na) plus. Negatiivisten ionien FABMS: m/z 811 (MH)-.

3.3.2. Kankanoside

H2 (2) Valkoinen jauhe, ½a- 25D-52,4 (c 0.27, MeOH). Korkean resoluution positiivisten ionien FABMS: Laskettu C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835,2637. Todettu: 835,2644. UV [MeOH, nm (loge)]: 228 (4,26), 290 (sh, 4,22), 316 (4,37). IR (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 cm{32}}. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: annettu taulukossa 2. 13C NMR (150 MHz, CD3OD) dC: annettu taulukossa 3. Positiivisten ionien FABMS: m/z 835 (M plus Na) plus .negatiivisten ionien FABMS : m/z 811 (MH)-.

3.3.3. Kankanoside I (3)

Valkoinen jauhe, ½a-25D-62.2 (c 1.00, MeOH). Korkean erotuskyvyn positiivisten ionien FABMS: Laskettu yhdisteelle C35H46O18Na (M plus Na) plus: 777,2581. Havaittu: 777,2585. UV [MeOH, nm (loge)]: 246 (3,97), 295 (sh, 4,04), 334 (4,23). IR (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070, 1046 cm{30}}. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: annettu taulukossa 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: annettu taulukossa 3. Positiivisten ionien FABMS: m/z 777 (M plus Na) plus. Negatiivisten ionien FABMS: m/z 753 (MH)-.

3.4. Alkalinen ja happohydrolyysi 1-3

Liuoksia 1, 2 ja 3 (kukin 1,5 mg) 5-prosenttisessa vesipitoisessa kaliumhydroksidissa (KOH, 0,5 ml) sekoitettiin 40 asteessa 1 tunti. Jokainen liuos neutraloitiin Dowex HCR W2:lla (H plus -muoto), ja hartsi poistettiin suodattamalla. Liuottimen haihdutus alennetussa paineessa tuotti vastaavat deasyloidut tuotteet, joille suoritettiin HPLC-analyysi [sarake: Cosmosil pNAP, 250 - 4,6 mm id; liikkuva faasi: CH3CN - 1 % vesipitoinen AcOH (15:85, v/v); havaitseminen: UV (254 nm); virtausnopeus: 1.0 ml/min] tunnistetaan trans-kahvihapoksi (tR 9,9 min 3:sta), trans-p-kumaarihapoksi (tR 17,1 min 1:stä) ja cis-p-kumaarihapoksi (tR17,8 min arvosta 2), vastaavasti. Sitten kukin liuotettiin 10 MHCl:aan (10 ml) ja kuumennettiin 80 C:ssa 3 tuntia. Jäähdytyksen jälkeen reaktioseos neutraloitiin Amberlite IRA-400:lla (OH-muoto), ja hartsit poistettiin suodattamalla. Kun liuotin oli poistettu alennetussa paineessa, jäännös erotettiin Sep-Pak C18 -patruunakolonnilla (H20-MeOH). H2O-eluoitu fraktio altistettiin HPLC-analyysille seuraavissa olosuhteissa: HPLC-pylväs, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm id - 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokio, Japani); tunnistus, optinen kierto[Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd, Tokio, Japani); liikkuva faasi, CH3CN-H20 (85:15, tilavuus/tilavuus); virtausnopeus 0,8 ml/min]. L-ramnoosi (i) ja D-glukoosi (ii), jotka vapautuivat 1, 2 tai 3 H2O-eluoidusta fraktiosta, suoritettiin vertaamalla niiden retentioaikoja ja optista rotaatiota autenttisten näytteiden [i,tR 9,9 min. (negatiivinen)] ja [ii, tR 17,9 min (positiivinen)].

3.5. Biomääritys

3.5.1. Reagenssit

LPS (Salmonella enteritidis), välttämätön vähimmäiselatusaine (MEM) ja William's E -elatusaine ostettiin Sigma-Aldrich Chemicalilta (St. Louis, MO, USA); sikiön naudan seerumi (FBS) oli yhtiöltä Invitrogen (Carlsbad, CA, USA); ja muut kemikaalit olivat Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd:ltä (Osaka, Japani). 96-Kaivon mikrolevyt ostettiin Sumitomo Bakelite Co.,Ltd:ltä (Tokio, Japani).

3.5.2. Eläimet

Urospuoliset ddY-hiiret ostettiin Kiwa Laboratory AnimalCo., Ltd:ltä (Wakayama, Japani). Eläimiä pidettiin vakiolämpötilassa 23 ± 2 °C ja niille ruokittiin standardilaboratorioruokaa (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tokio, Japani). Kaikki kokeet suoritettiin tajuissaan olevilla hiirillä, ellei toisin mainita. Koeprotokollan hyväksyi Kinkin yliopiston koe-eläintutkimuskomitea.

3.5.3. Suojaavat vaikutukset D-GalN/LPS:n aiheuttamiin maksavauriohiiriin

Tiegs et al.51:n kuvaamaa menetelmää muunnettiin ja sitä käytettiin tässä kokeessa. Lyhyesti sanottuna urospuoliset ddY-hiiret, jotka painoivat noin 25–30 g, paastosivat 20 tuntia ennen koetta. D-GalN (350 mg/kg) ja LPS (10 lg/kg) liuotettuna suolaliuokseen injektoitiin intraperitoneaalisesti maksavaurion tuottamiseksi. Jokainen testinäyte annettiin suun kautta 1 tunti ennen D-GalN/LPS-injektiota. Verinäytteet kerättiin infraorbitaalisesta laskimopunoksesta 10 tuntia D-GalN/LPS-injektion jälkeen. sAST- ja SALT-tasot määritettiin Reitman-Frankel-menetelmällä (kaupallinen pakkaus, Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure ChemicalIndustries, Co., Ltd). Vertailuyhdisteenä käytettiin hydrokortisonia. Testinäytteet suspendoitiin 5-prosenttiseen arabikumiliuokseen, ja liuosta annettiin suun kautta 10 ml/kg kussakin kokeessa, kun taas vehikkeliä annettiin suun kautta 10 ml/kg vastaavalle kontrolliryhmälle.

3.5.4. Suojaavat vaikutukset D-GalN:n perusviljeltyjen hiiren hepatosyyttien aiheuttamaan sytotoksisuuteen

Ainesosien hepatoprotektiivisen vaikutuksen määritti {{0}}(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) ) kolorimetrinen määritys käyttäen primääriviljeltyjä hiiren hepatosyyttejä.33–43 Maksasoluja eristettiin uroshiiristä (30–35 g) kollagenaasiperfuusiomenetelmällä. Solususpensio 4 - 104 soluilla 100 l:ssa William's E -elatusainetta, joka sisälsi FBS:ää (10 prosenttia), penisilliini G:tä (100 yksikköä/ml) ja streptomysiiniä (100 lg/ml), ympättiin 96-kuoppamikrolevylle ja esiviljelty 4 tuntia 37 asteessa 5 prosentin CO2-ilmakehässä. Väliaineeseen lisättiin 100 ui tuoretta alustaa, joka sisälsi D-GalN:a (2 mM) testinäytteen kanssa tai ilman sitä, ja maksasoluja viljeltiin 44 tuntia. Elatusaine vaihdettiin 100 ll:aan tuoretta alustaa ja 10 ui MTT-liuosta [5 mg/ml fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS)] lisättiin alustaan. 4 tunnin inkubaation jälkeen väliaine poistettiin ja sitten lisättiin 100 ui isopropanolia, joka sisälsi 0,04 M HCl:a soluissa tuotetun formatsaanin liuottamiseksi. Formatsaaniliuoksen optinen tiheys (OD) mitattiin mikrolevylukijalla aallonpituudella 570 nm (viite: 655 nm). Esto (prosenttia) saatiin seuraavalla kaavalla.

Esto ( prosentti )= [(OD(näyte) - OD(kontrolli))/(OD(normaali)-OD(kontrolli)] x 100

3.5.5. Vaikutukset NO:n tuotantoon LPS-stimuloiduissa hiiren vatsakalvon makrofageissa

Seulontatesti NO-tuotannon suhteen käyttämällä TGC-indusoituja hiiren vatsakalvon makrofageja suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu.43,46,

3.5.6. Vaikutukset TNF-a:n tuotantoon LPS-stimuloiduissa hiiren vatsakalvon makrofageissa

Elatusaineeseen vapautunut TNF-a määritettiin kuten aiemmin on kuvattu28 pienellä modifikaatiolla. Lyhyesti sanottuna TGC-indusoidut hiiren peritoneaaliset makrofagit (5 - 105 solua/kuoppa) kerättiin urospuolisten ddY-hiirten vatsaonteloista, suspendoituna 100 lLof RPMI 1640:een, jota oli täydennetty 5 prosentilla FBS:llä, penisilliinillä (100 yksikköä/kuoppa). ml) ja streptomysiiniä (100 lg/ml) ja esiviljelty 96-kuoppamikrolevyillä 37 asteessa 5 % CO2:ssa ilmassa 1 tunnin ajan. Kiinnittymättömät solut poistettiin pesemällä PBS:llä ja lisättiin 100 ui tuoretta alustaa, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia testiyhdistettä. 10 minuutin kuluttua lisättiin 100 ui väliainetta, joka sisälsi 10 lg/ml LPS:ää, ja inkuboitiin 4 tuntia. TNF-a:n tuotanto kussakin kuopassa määritettiin käyttämällä ELISA-pakkausta (Mouse TNF-a ELISA -kitti, Invitrogen). Jokainen testiyhdiste liuotettiin DMSO:hon ja liuos lisättiin alustaan ​​(lopullinen DMSO-pitoisuus 0,5 prosenttia)

3.5.7. Estävät vaikutukset TNF-a:n aiheuttamaan solukuolemaan L929-soluissa

L929-soluja (Dainippon Pharmaceuticals, Osaka, Japani) pidettiin Minimum Essential Medium Eaglessa (MEM, Sigma–Aldrich), joka sisälsi 1 0 prosenttia FBS:ää, 1 prosenttia MEM ei-välttämättömiä aminohappoja (Invitrogen), penisilliini G:tä (100 yksikköä). /ml) ja streptomysiiniä (100 lg/ml) 37 °C:ssa 5 % C02-ilmakehässä. Solut siirrostettiin 96-kuoppakudosviljelylevylle [3 -104 solua/kuoppa 100 l:ssa/kuoppa MEM:ssä]. 44 tunnin inkuboinnin jälkeen TNF-a:ssa (20 ng/ml) testinäytteen kanssa tai ilman sitä, solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-kolorimetrisellä määrityksellä (videante). 49,50 Jokainen testiyhdiste liuotettiin DMSO:hon ja liuos lisättiin väliaineeseen (lopullinen konsentraatio DMSO:ssa 0,5 prosenttia).

3.6. Tilastot

Arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM. Tilastolliseen analyysiin käytettiin yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA), jota seurasi Dunnettin testi. Alle 0,05 pienempiä todennäköisyysarvoja (p) pidettiin merkitsevinä.

Kiitokset

TM, KN ja OM saivat tukea tieteellisen tutkimuksen apurahasta "High-tech Research Center" -projektista yksityisille yliopistoille: vastaava rahastotuki opetus- ja kulttuuriministeriön tieteellisen tutkimuksen apurahasta , Urheilu, tiede ja teknologia (MEXT), Japani, 2007–2011, ja sitä tukee myös MEXT:n tieteellisen tutkimuksen apuraha. MY:tä ja HM:ää tuki 21. COE-ohjelma, Academic Frontier Project ja MEX:n tieteellisen tutkimuksen apuraha.

Lähde: ' Asyloitufenyylietanolioligoglykosidit, joilla on hepatoprotektiivista vaikutusta aavikkokasvistaCistanche tubulosa' tekijältäToshio Morikawa et ai

---Bioorganic & Medicinal Chemistry 18 (2010) 1882–1890.