Osa 1 Akteosidi estää RANKL-välitteistä osteoklastogeneesiä estämällä C-Fos-induktiota ja NF-kB-reittiä ja heikentämällä ROS-tuotantoa

Osa 1 Kuinka akteosidit edistävät luun kasvua?

Lisätietoja:ali.ma@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3* 1 Chonbukin kansallisen yliopiston kliinisen lääketieteen tutkimuslaitos, Chonbukin kansallisen yliopiston biolääketieteen tutkimuslaitos Sairaala, Jeonju, Chonbuk, Etelä-Korea, 2 Oikomishoidon laitos, Suun Biotieteiden laitos ja Hammaslääketieteen laitos, Chonbukin kansallinen yliopisto, Jeonju, Chonbuk, Etelä-Korea, 3 Bioaktiivisten materiaalitieteiden laitos, Bioaktiivisten aineiden tutkimuskeskus, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, Etelä-Korea

Abstrakti

Lukuisat tutkimukset ovat raportoineet, että tulehdukselliset sytokiinit ovat tärkeitä välittäjiä osteoklastogeneesille, mikä aiheuttaa liiallista luun resorptiota ja osteoporoosia.ActeosidePerinteisessä itämaisessa lääketieteessä laajasti käytetyllä Rehmannia glutinosan tärkeimmällä vaikuttavalla yhdisteellä on anti-inflammatorisia ja antioksidanttisia ominaisuuksia. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että CTE-puoli esti merkittävästi osteoklastien erilaistumista ja muodostumista luuytimen makrofageista (BMM) ja RAW264.7-makrofageista, joita stimuloi ydintekijä-kappaB (NF-kB) -ligandin (RANKL) reseptoriaktivaattori. Acteoside-esikäsittely esti myös kypsien osteoklastien aiheuttaman luun resorption annosriippuvaisella tavalla. Akteosidi (10 mM) heikensi RANKL-stimuloitua p38-kinaasin, solunulkoisten signaalisäädeltyjen kinaasien ja c-Jun N-terminaalisen kinaasin aktivaatiota ja myös tukahdutti NF-kB-aktivaation estämällä p65-alayksikön ja inhibiittorin kBa:n fosforylaatiota. Lisäksi RANKL-välitteinen lisääntyminen aktivoituneiden T-solujen c-Fos:n ja tumatekijän, sytoplasmisen 1:n (NFATc1) ilmentymisessä sekä tuumorinekroositekijä-a:n, interleukiinin (IL)-1b, tuotannossa ja IL-6 ilmeisesti estyivät akteosidiesikäsittelyllä. Lisäksi oraalinen akteosidi vähensi munasarjojen poiston aiheuttamaa luukatoa ja tulehduksellista sytokiinituotantoa kontrollitasoille. Tietomme viittaavat siihenakteosidiestää osteoklastien erilaistumista ja kypsymistä osteoklastien esiasteista tukahduttamalla RANKL-indusoidun mitogeenin aktivoimien proteiinikinaasien ja transkriptiotekijöiden, kuten NF-kB:n, c-Fosin ja NFATc1:n, aktivaation. Nämä tulokset yhdessä viittaavat siihen, ettäakteosidivoi toimia resorptiota estävänä aineena vähentäen luukatoa estämällä osteoklastien aktivaation.

Lisätietoja saat ottamalla yhteyttä:ali.ma@wecistanche.com

Klikkaa Cistanche-tehostetuotteisiin

Johdanto

Tasapainoinen osteoklasti- ja osteoblastitoiminta uudistaa jatkuvasti luuta [1]. Osteoklastit syntyvät monosyytti/makrofagilinjan hematopoieettisista esiastesoluista, kun taas osteoblastit ovat mesenkymaalista linjaa [2]. Epänormaalit osteoklastien aktivaatiot tai vähentynyt osteoblastogeneesi voivat häiritä luun homeostaasia ja aiheuttaa lopulta sairauksia, kuten osteoporoosia, niveltulehdusta ja luusyöpää [3,4]. Osteoporoosi on yleinen luusairaus, joka lisää murtumariskiä. Yleisin osteoporoosin muoto johtuu vaihdevuosi-ikäisten naisten estrogeenin puutteesta. Lääkkeet, kuten kortikosteroidit ja epilepsialääkkeet, voivat myös aiheuttaa epätasapainoa luun resorption ja muodostumisen välillä, mikä voi johtaa osteoporoosiin [5]. Monia resorptiota estäviä estäjiä, mukaan lukien bisfosfonaatit, kalsitoniini, estrogeeni ja selektiiviset estrogeenireseptorin modulaattorit, on käytetty osteoporoosin hoitoon. Nämä estäjät ylläpitävät luumassaa estämällä osteoklastien toimintaa [6]. Estrogeenikorvaushoito on suosituin hoitomuoto postmenopausaalisen osteoporoosin ehkäisyyn ja hoitoon. Pitkäaikainen estrogeenikorvaushoito voi kuitenkin lisätä endometriumin ja rintasyöpien riskiä. Siksi monet tutkijat ovat keskittyneet kehittämään uutta resorptiota estävää ainetta, jolla ei ole sivuvaikutuksia [7–10]. Koska osteoklastit toimivat luun resorptiossa, osteoklastien spesifistä estämistä on pidetty päätavoitteena useissa tutkimuksissa. Osteoklastit ovat monitumaisia ​​jättiläissoluja, jotka muodostuvat monosyytti/makrofagiperheen yksitumaisista esiasteista hematopoieettisten esiastesolujen peräkkäisen lisääntymisen, erilaistumisen ja fuusion kautta [11]. Makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä (M-CSF) ja ydintekijän (NF)-kB (RANK) -ligandin (RANKL) reseptoriaktivaattori (RANKL) ovat olennaisia ​​tekijöitä osteoklastien erilaistumisen kannalta[12]. Lisäksi useat tulehdukselliset sytokiinit, kuten tuumorinekroositekijä (TNF) ja interleukiini (IL)-1b, myötävaikuttavat osteoklastogeneesiin moduloimalla RANKL:n, osteoprotegeriinin ja M-CSF:n induktiota [7,13]. RANKL:n sitoutuminen solun pintaan RANK-reseptori johtaa RANKL/RANK/TNFR-assosioituneiden tekijöiden (TRAF) komplekseihin, jotka aktivoivat peräkkäin NF-kB:n ja mitogeenin aktivoimat proteiinikinaasit (MAPK:t), mukaan lukien c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK), p38 kinaasi ja ekstrasellulaarinen signaaliin liittyvä kinaasi (ERK) [14]. Tällä aktivaatiolla on keskeinen rooli osteoklastien erilaistumisen, aktivoitumisen ja eloonjäämisen välittäjänä. RANKL aktivoi myös transkriptiotekijöiden, kuten aktivoitujen T-solujen ydintekijän, sytoplasmisen 1:n (NFATc1) ja-Fosin, ekspressiota, jotka ovat välttämättömiä osteoklastien kehitykselle [ 7,9]. Siksi RANKL-signalointia pidetään osteoklastien aktivaatiota ja luukatoa supistavien antiresorptiivisten aineiden pääkohteena.

Acteosideon Rehmannia glutinosan tärkein aktiivinen yhdiste, jota käytetään laajasti perinteisessä itämaisessa lääketieteessä [15,16]. Akteosidi on vahva antioksidantti ja sillä on maksatoksisia, tulehdusta ja nosiseptiivisia vaikutuksia [17–20]. Löysimme sen aiemminakteosidivähentää tyrosinaasin aktiivisuutta ja melaniinin biosynteesiä säätelemällä ERK-signalointia [21], suojaa reaktiivisten happilajien (ROS) välittämältä ienvauriolta[22] ja estää mykotoksiinivälitteisen soluvaurion [23]. Nämä vaikutukset liittyvät läheisestiakteosidikyky poistaa ROS ja säädellä MAPK-välitteistä signalointia. Erityisesti ROS:n ehdotetaan välittävän RANKL-indusoituja signalointireittejä ja solutapahtumia osteoklasteissa. Esikäsittely antioksidanteilla esti RANKL-indusoitua NF-kB:n, ERK:n ja IkBa:n aktivaatiota, mikä vaimenti osteoklastogeneesiä [24]. Nämä havainnot viittasivat vahvasti siihen, että anti-inflammatorisen vaikutuksen lisäksi antioksidanttiaktiivisuus on ratkaisevan tärkeää resorptiota estävälle aineelle, jotenakteosidivoi tukahduttaa RANKL:n aiheuttamaa osteoklastogeneesiä.

Tässä tutkimuksessa selvitimme, onkoakteosidisillä on terapeuttinen vaikutus luukatoon. Tutkimme vaikutuksiaakteosidiosteoklastien erilaistumisesta ja luun resorptiosta ja niihin liittyvistä solumekanismeista käyttämällä in vitro ja in vivo -koejärjestelmiä.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen lausunto

Eläinten hoito- ja käyttökäytännöt hyväksyi ChonbukNational Universityn laboratorioeläinten hoidon ja käytön eettinen komitea (lupa nro CBU 2010-0007). Kaikki kokeet tässä tutkimuksessa suoritettiin yliopiston eläinten hoito- ja käyttökomitean ohjeiden mukaisesti.

Hiiret, kemikaalit ja laboratoriotarvikkeet

Neljän viikon ikäiset naaraspuoliset ICR-hiiret ostettiin OrientBio Inc:ltä (Soul, Korea) ja niitä pidettiin 2261 uC:ssa ja 5565 prosentin kosteudessa 12 tunnin valo/pimeyssyklissä, jolloin ruokaa ja vettä oli vapaasti saatavilla. Akteosidi (3,4-dihydroksi-b-fenetyyli-Oa-ramnopyranoosi-syyli-(1R3)-4-O-kofeoyyli-bD-glukopyranosidi; C29H36O15) (kuva S1) eristettiin lehdistä Rehmannia glutinosa. Akteosidi liuotettiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) ennen käyttöä. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 ja M-CSF ostettiin T&K-järjestelmistä (Minneapolis, MN, USA). c-Fos-, p65-, p-p65-, p-ERK-, ERK-, JNK-, p-JNK-, NFATc1-, IkBa-, p-IkBa- ja b-aktiinille spesifiset vasta-aineet saatiin Santa Cruz Biotechnologysta (Santa Cruz, CA, USA) ). Vasta-aineet p-p38:lle ja p38:lle ostettiin Cell Signaling Technologylta (Danvers, MA, USA). CalciumAssay- ja Osteocalcin (OC) EIA-sarjat ostettiin BioAssay Systemsiltä (Hayward, CA, USA) ja Biomedical Technologiesilta (Stoughton, MA, USA) seerumin biokemiallisten parametrien määrittämiseksi. Hiiren tartraattiresistenttiä hapan fosfataasi (TRAP) -määrityssarjaa (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA) käytettiin myös seerumin TRAP5b-tason mittaamiseen. Ellei toisin mainita, lisäkemikaaleja hankittiin yhtiöltä Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) ja laboratoriotarvikkeet olivat SPL Life Sciencesilta (Pochun, Etelä-Korea).

Soluviljelmät

Luuydinsolut saatiin 6 viikon ikäisten naaraspuolisten ICR-hiirten sääriluusta ja reisiluusta aiemmin kuvattujen menetelmien mukaisesti [25]. Luuydinsuspensiota inkuboitiin 100-mm viljelymaljassa 50 ng/ml M-CSF:n läsnä ollessa. 3 päivän kuluttua kiinnittyneitä soluja käytettiin luuytimen makrofageina (BMM) osteoklastien erilaistumisen indusoimiseksi. Joitakin luuydinsoluja inkuboitiin myös 48 tuntia ilman M-CSF:ää, ja kiinnittyneitä soluja viljeltiin osteoblastien erilaistumisalustassa, kuten muualla on kuvattu [25]. RAW264.7-makrofagisoluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen alustassa (DMEM), jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla (FBS), 2 mM L-glutamiinilla ja antibiooteilla. Näitä soluja käytettiin BMM:ien vastineena solulinjana tutkimaan akteosidin vaikutusta osteoklastogeneesiin.

Osteoklastinen erilaistuminen ja TRAP-värjäys

BMM:itä esikäsiteltiin erilaisilla akteosidipitoisuuksilla (0–50 mM) 2 tunnin ajan ennen stimulointia 100 ng/ml RANKL:lla. Elatusaine korvattiin tuoreella elatusaineella päivinä 2 ja 5. 7 päivän inkubaation jälkeen viljelmät kiinnitettiin 4-prosenttisessa PBS-puskuroidussa paraformaldehydissä ja värjättiin TRAP:lla käyttämällä sigma Aldrich -pakkausta valmistajan ohjeiden mukaisesti. TRAP-positiiviset solut laskettiin optisella mikroskopialla, ja vähintään 3 tumaa sisältävät solut katsottiin osteoklasteiksi. RAW 264.7 -solut altistettiin myös 100 ng/ml RANKL:lle 2 tunnin esikäsittelyn jälkeen akteosidilla ja 7 päivän inkubaation jälkeen, solut käsiteltiin TRAP-värjäystä varten.

Solujen elinkelpoisuuden mittaaminen

Solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttämällä vesiliukoista tetratsoliumsuolaa (WST)-8 -reagenssia. Lyhyesti sanottuna BMM-soluja tai RAW264.7-soluja, joita viljeltiin kasvualustassa, joka sisälsi 10 prosenttia FBS:ää ja antibiootteja, käsiteltiin 10 mM akteosidilla tai fenolisella yhdisteellä, kuten kversetiinillä, luteoliinilla, apigeniinillä tai epigallokatekiini-3-gallaatilla (EGCG). WST-8-reagenssi lisättiin viljelmiin 48 tunnin inkubaation jälkeen. 4 tunnin lisäinkuboinnin jälkeen WST-spesifinen absorbanssi mitattiin 450 nm:ssä käyttämällä mikrolevylukijaa (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).

Luun resorptiomääritys

BMM:t (16 105 solua/ml) suspendoitiin a-MEM:iin, joka sisälsi 50 ng/ml M-CSF:ää ja 100 ng/ml RANKL:a, ja jaettiin sitten kalsiumfosfaattinanokiteillä (OAAS{{6}) päällystetylle24-kuoppalevylle. Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Etelä-Korea) tiheydellä 26104 solua/cm2 akteosidin kanssa ja ilman. 7 päivän inkubaation jälkeen solut poistettiin levyiltä 5-prosenttisella natriumhypokloriittiliuoksella, ja tietoa tarkkailtiin optisella mikroskoopilla. Resorboitunut alue mitattiin myös kuva-analysaattorilla ja ilmaistiin prosentteina kontrolliarvosta.

Western Blot -analyysi

Kokonaiset proteiinilysaatit valmistettiin lyysipuskurissa, kuten muualla on kuvattu [26]. Sytosoliset ja tumaproteiinit valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla [25]. Samat määrät proteiiniuutetta erotettiin 12–15 prosentin SDS-PAGE:lla ja blotattiin polyvinyylidifluoridikalvoille. Blotteja tutkittiin primaarisilla vasta-aineilla yön yli 4 °C:ssa ennen inkubointia sekundaarisen vasta-aineen kanssa estopuskurissa 1 tunnin ajan. Blotit kehitettiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) ja valotettiin röntgenfilmille (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).

MAPK-aktiivisuusmääritys

Soluja esikäsiteltiin akteosidilla 2 tuntia ja sitten stimuloitiin RANKL:llä vielä -30 min. MAPK-aktiivisuudet määritettiin käyttämällä immunometrisiä määrityspakkauksia, kuten p-p38kinaasimäärityspakkausta (Assay Designs, Inc., MI, USA), p-ERK-entsyymimäärityspakkausta (Assay Designs) ja p-SAPK/JNK sandwich ELISA -kittiä ( Cell Signaling Technology, MA, USA). Kaikki toimenpiteet noudattivat valmistajan ohjeita, ja absorbanssi mitattiin mikrolevylukijalla.

Electroforetic Mobility Shift Assay (EMSA)

DNA-proteiinisitoutumisreaktiot suoritettiin 3 0 minuutin ajan huoneenlämmössä 10–15 mg proteiinilla 20 ml:ssa puskuria, joka sisälsi 1 mg/ml BSA:ta, 0,5 mg/ml poly(dI-dC), 5 prosenttia glyserolia. ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30, 000 CPM [a-32P] dCTP-leimattuja oligonukleotideja ja Klenow-fragmenttia DNA-polymeraasista. Näytteet erotettiin 6-prosenttisilla polyakryyliamidigeeleillä, jotka kuivattiin ja valotettiin röntgenfilmille (Eastman Kodak Co.) 12–24 tunnin ajan 270 uC:ssa. NF-spesifiset oligonukleotidialukesekvenssit olivat 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 ja 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

NF-kB lusiferaasimääritys

RAW264.7-makrofagit 24-kuoppalevyillä transfektoitiin 0,8 mg kB-lusiferaasireportterivektorilla käyttämällä 2 ml:aa Lipofectamine2000:ta (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 24 tuntia transfektion jälkeen soluja stimuloitiin RANKL:llä akteosidin läsnä ollessa ja ilman sitä 24 tunnin ajan. Solut suspendoitiin uudelleen 100 ml:aan reportterilyysipuskuria (Promega, Madison, WI, USA). Samat määrät proteiininäytteitä laitettiin 96-kuoppamikrolevyille ja sekoitettiin lusiferaasisubstraatin kanssa. Luminesenssi mitattiin käyttämällä mikrolevyluminometriä (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksa). Tässä kokeessa käytettiin läpäisevää NF-B-inhibiittoripeptidiä (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) positiivisena kB-inhibiittorina.

Sytokiinien mittaus

BMM-soluja tai RAW264.7-soluja stimuloitiin RANKL:llä, kun läsnä oliakteosidi24-kuoppaviljelylevyillä. 48 tunnin inkubaation jälkeen viljelmän supernatantit kerättiin ja arvioitiin ELISA:lla käyttämällä TNF-a-, IL-1b- ja IL-6-spesifisiä OptEIATM-pakkauksia valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Reaaliaikainen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR)

Osteoklastisten markkerien, kuten c-Fosin, NFATcl:n ja TNF-a:n, mRNA:n ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR:llä. Lyhyesti sanottuna kokonais-RNA uutettiin makrofageista Trizolreagentilla valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen). cDNA syntetisoitiin 1 mg:lla kokonais-RNA:ta käyttämällä SuperScriptReverse Transcripatase II:ta ja alukkeita (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mixiä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) käytettiin PCR-tuotteen kerääntymisen havaitsemiseen syklin aikana ABI 7500 -sekvenssin havaitsemisjärjestelmällä (sovellettu käyttäen neljäkymmentä 3-vaiheista denaturointisykliä 95 uC:ssa 15 sekuntia, pariutuminen 60 uC:ssa 1 s ja pidennys 72 uC:ssa 30 s. Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin vähintään kolmena rinnakkaisena ja ekspressiotasot normalisoitiin housekeeping-geeniin HPRT samassa reaktiossa. Tässä tutkimuksessa käytettiin samoja kuvattuja alukesekvenssejä muualla [7].

Solunsisäisen ROS:n mittaus

Varastoliuos, jossa oli 29,79-diklooridihydrofluoreseiinidiasetaattia (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Saksa) valmistettiin DMSO:ssa ja säilytettiin 220 uC:ssa pimeässä. Lyhyesti sanottuna BMM-soluja (106 solua/ml 6-kuoppalevyillä) viljeltiin 50 ng/MLM-CSF:llä 24 tuntia ja käsiteltiin sitten erilaisilla akteosidipitoisuuksilla (0–10 mM) 2 tuntia ennen stimulaatiota 100 ul:lla. ng/ml RANKL. 1 tunnin yhteisinkuboinnin jälkeen näitä soluja inkuboitiin sitten 25 mM DCFH-DA:n kanssa 30 minuuttia. 29,79-dikloorifluoreseiinin (DCF) vihreä fluoresenssi tallennettiin 515 nm:ssä (FL 1) käyttämällä FACS VantageH -järjestelmää (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) ja 10,000 tapahtumaa laskettiin näytettä kohti

Munasarjapoiston aiheuttaman osteoporoosin induktio

Tässä tutkimuksessa käytettiin naaraspuolisia ICR-hiiriä (6 viikon ikäisiä). Hiirille tehtiin valeleikkaus (Sham, n=10) tai leikattiin munasarjat (OVX, n=20) nukutuksessa. Viikko leikkauksen jälkeen OVX-hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään, joissa kussakin oli 10 hiirtä: bilateraalinen OVX ja kahdenvälinen OVX, jota oli täydennetty 200 ml:lla PBS:ää, joka sisälsi 1 mM akteosidia suun kautta (AC-ryhmä). Oraalinenakteosidiannettiin kerran 3 päivässä 8 viikon ajan leikkauksen jälkeen, ja sama määrä PBS:ää annettiin vale- ja OVX-ryhmille. Yhden päivän kuluttua viimeisestä annosta hiiret tapettiin ja sen jälkeen seerumin biokemialliset parametrit ja 3-ulotteinen luurakenne analysoitiin.

Seerumin biokemiallisten parametrien määritys

Verinäytteet kerättiin sydänpunktiolla ja seerumi kerättiin sentrifugoimalla. Seeruminäytteitä säilytettiin 280 uC:ssa biokemiallisten parametrien analysointia varten. Seerumin IL-1b- ja IL-6-tasot arvioitiin käyttämällä ELISA-pakkausta edellä kuvatulla tavalla, kun taas alkalisen fosfataasin (ALP) aktiivisuus määritettiin käyttämällä biokemiallista kolorimetristä määritystä, joka mittaa p:n määrää. -nitrofenoli, joka on valmistettu p-nitrofenolifosfaattisubstraatista, kuten muualla on kuvattu [27]. Luun muodostumisen ja resorption biomarkkerien arvioimiseksi määritettiin myös seerumin OC-, kalsium- ja TRAP5b-tasot valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Luun rakenteen ja morfometristen parametrien analyysit

Hiirten reisiluu (Sham-, OVX- ja AC-ryhmät) leikattiin ja täytettiin fysiologisella suolaliuoksella mekaanista testausta varten. Reisiluun mekaaninen lujuus mitattiin muualla kuvatulla tavalla [28]. Murtumakuorma kirjattiin huippuvoimana newtoneina siinä kohdassa, jossa oikean reisiluun keskiakseli murtui. Lisäksi kunkin eläimen kevyt reisiluu analysoitiin histomorfometrisesti käyttämällä mikrotietokonetomografia (mikro-CT) -järjestelmää (SkyScan 1076 microfocus -röntgenjärjestelmä, Kontich, Belgia). Lyhyesti sanottuna 4-prosenttisessa formaldehydivarastossa olevat luut kuivattiin pintapaperilla ennen käärimistä muoviseen "tarrakalvoon" tai parafilmiin, jotta ne eivät kuivuisi skannauksen aikana. Jokainen muovilla päällystetty luu asetettiin muovi-/polystyreenivaahtoputkiin, jotka asennettiin pystysuoraan vaakasuoraan 1076-skannerin näytekammioon mikro-CT-kuvausta varten. Skannaus suoritettiin käyttämällä 100 kV lähdejännitettä ja 140 mA lähdevirtaa 35 mm resoluutiolla. Kolmiulotteiset mallit reisiluun trabekulaarisista luista rekonstruoitiin käyttämällä SkyScan CT Analyzer versiota 1.11. Rakenteelliset parametrit, kuten trabekulaarisen luun mineraalitiheys (BMD, g/cm3), luun tilavuusprosentti (luun tilavuus (BV) / kudostilavuus (TV), prosenttiosuus), paksuus (Tb.Th, mm), erotus (Tb.Sp) , mm) ja lukumäärä (Tb.N, 1/mm) mitattiin sitten.

Osteogeeninen erilaistumis- ja mineralisaatiomääritys

6-kuoppaviljelylevyillä viljellyt luuydinsolut käsiteltiin DAG:lla (10 nM deksametasoni, 50 mM askorbiinihappo ja 20 mM b-glyserofosfaatti) 10 mM:n läsnä ollessa.akteosidi. Kahden viikon erilaistumisen jälkeen soluja kiinnitettiin jääkylmällä 70-prosenttisella (tilavuus/tilavuus) etanolilla 1 tunnin ajan ja värjättiin 0,2-prosenttisella alitsariinipunasini-tislatulla vedellä 30 minuutin ajan huoneessa. lämpötila. Sen jälkeen, kun solut oli poistettu ja ilmakuivattu, soluviljelylevyt arvioitiin valomikroskopialla käyttäen käänteistä mikroskooppia (Nikon TS100, Japani). Punaisen väriaineen määrän määrittämiseksi tahra eluoitiin 10-prosenttisella asetyylipyridiniumkloridilla ravistamalla 20 minuuttia ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 560 nm. Solukerroksiin kertyneen kalsiumin määrä mitattiin myös käyttämällä Calcium Kit -sarjaa (Wako Chemical Inc. Osaka, Japani) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lisäksi luuspesifisten mRNA-markkerien, kuten runtiin liittyvän transkriptiotekijän -2(Runx2), osterixin, luun sialoproteiinin (BSP) ja OC:n, ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR:llä. Näiden markkerien oligonukleotidialukkeet suunniteltiin alle 200 bp:n tuotekoolla käyttäen PrimerExpress Software 3.0:aa (Applied Biosystems), kuten muualla on kuvattu[27].

Tilastollinen analyysi

Ellei toisin mainita, kaikki tiedot ilmaistaan ​​kolmen tai useamman riippumattoman kokeen keskimääräisenä6-standardihajonnana (SD). Yksisuuntaista ANOVAa käytettiin useisiin vertailuihin käyttämällä SPSS-versiota 12.0 -ohjelmistoa. P-arvoa 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.

Tulokset

Akteosidi estää makrofagesiinin aiheuttamaa osteoklastien muodostumista annoksesta riippuvalla tavalla

Akteosidin vaikutuksen vahvistamiseksi BMM:n erilaistumiseen osteoklasteiksi soluja viljeltiin erilaisilla akteosidipitoisuuksilla (0–20 mM) 7 päivän ajan 50 ng/ml M-CSF:n ja 100 ng/ml:n läsnä ollessa. RANKL. Akteosidi vähensi osteoklastien määrää annoksesta riippuvalla tavalla. Kun soluja esikäsiteltiin 10 mM akteosidilla 2 tunnin ajan, osteoklastien lukumäärä laski 43 prosenttia verrattuna soluihin, joita oli täydennetty M-CSF:llä ja RANKL:llä (kuvio 1A). Kuvio 1B esittää RANKL-välitteisen osteoklastien erilaistumisen ja sen inhibition yhdistelmähoidolla akteosidilla. Tämän tuloksen mukaisesti akteosidiesikäsittely vähensi RANKL-stimuloitua RAW264.7-solujen erilaistumista ja osteoklastien muodostumista (kuviot 1C ja D). Kun akteosidin osteoklastien vastaista potentiaalia BMM:issä verrattiin useiden fenoliyhdisteiden antiosteoklastipotentiaaliin samalla pitoisuudella (10 mM), luteoliini osoitti suurinta aktiivisuutta (kuvio 2A). Kuitenkin luteoliini, kversetiini tai apigeniini itse heikensi solujen elinkelpoisuutta (kuvio 2B). Kaikki yhdisteet estivät RAW264.7-makrofagien aiheuttamaa osteoklastien erilaistumista seuraavilla suhteellisilla aktiivisuuksilla: luteoliini. kversetiini=apigeniini .EGCG=akteosidi (kuva 2C). Luteoliini, kversetiini tai apigeniini itsessään osoitti myös solujen alentuneen elinkelpoisuuden (kuvio 2D). Sitä vastoin kversetiinikäsittely aiheutti vain merkittävän elinkelpoisuuden vähenemisen sekä BMM:issä että RAW264.7-soluissa, kun nämä solut altistettiin 10 mM:lle kutakin yhdistettä 2 päivän ajan 50 ng/ml M-CSF:n, 100 ng/ml RANKL:n kanssa, tai molemmat (tietoja ei näytetä). Kun näiden yhdisteiden pitoisuus vaaditaan estämään 50 prosenttia

osteoklastien muodostuminen BMM:issä (IC50) laskettiin käyttämällä pitoisuus-aktiivisuuskäyriä, IC50akteosidiKvertsetiini, luteoliini, apigeniini ja EGCG olivat 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 ja 6,6 mM, vastaavasti (kuvio 2E). Tämä tulos oli samanlainen kuin tapaus, jossa RAW264.7-makrofageja tutkittiin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että luteoliinilla ja kversetiinillä oli korkeampi antiklastogeeninen aktiivisuus kuin akteosidilla. Sitä vastoin kversetiinillä IC50-arvolla oli myös lievä toksinen vaikutus soluihin (tietoja ei esitetty).

Akteosidi estää makrofagien luun resorptiota

Akteosidi esti myös RANKL-välitteisen luun resorption annosriippuvaisella tavalla, mitattuna in vitro -mallijärjestelmällä (kuvio 3A). Luun resorptio estyi merkittävästi, kun BMM:itä inkuboitiin 1 mM akteosidin kanssa (kuvio 3B). A 10 mMakteosidihoito heikensi lähes täysin RANKL-indusoitua tietoa BMM:illä. Samoin akteosidi vähensi luun resorptiota RANKL-stimuloiduissa RAW264.7-soluissa (kuviot S2A ja B). Akteosidin kyky estää luun resorptiota riippui hoidon ajoituksesta suhteessa RANKL-stimulaatioon. 4 päivää RANKL-stimulaation jälkeen lisätty akteosidi (10 mM) ei vähentänyt informaatiota BMM:issä, kun taas se tukahdutti muodostuneiden osteoklastien lukumäärää (kuvio 3C). Tämä erilainen tulos johtui osittain kuoppa-alueesta, joka muodostui jo 4 päivän RANKL-stimulaation muodostumisen jälkeen (kuvio 3D).

Acteoside Down-säätelee varhaisia ​​RANKL-signalointireittejä

RANKL indusoi kolmen tunnetun MAPK:n ja NF-kB:n aktivoitumisen osteoklastien esiasteissa, ja tämä aktivaatio tarvitaan osteoklastien varhaiseen erilaistumiseen. Ymmärtääksemme mahdollisia mekanismeja, joilla akteosidi estää osteoklastogeneesiä, tutkimmeakteosidiMAPK:issa ja NF-B:n aktivoinnissa makrofageissa. BMM-soluja ja RAW264.7-soluja esikäsiteltiin 10 mM akteosidilla 2 tunnin ajan ja sitten stimuloitiin 100 ng/ml RANKL:lla 30 minuuttia. MAPK-fosforylaatio tutkittiin Western blot -menetelmällä ja immunometrisellä analyysillä. RANKL aiheutti p38:n, ERK:n ja JNK:n fosforylaation BMM:issä (kuvio 4A) ja RAW264.7-soluissa (kuvio 4B). Akteosidi esti nämä RANKL:n aiheuttamat p-p38:n, p-ERK:n ja p-JNK:n nousut. Tätä tulosta tuki immunometrinen analyysi, joka esikäsiteltiin 10 mM:llaakteosidiesti merkittävästi fosforyloitujen MAPK:ien tasoja näissä makrofageissa (kuvio 4C). RANKL-hoito lisäsi NF-kB:n DNA-sitoutumista, kun taas akteosidi esti RANKL:n indusoimaa NF-kB-DNA:n sitoutumisen aktivaatiota (kuvio 5A). Tämä esto oli näkyvämpi BMM:issä kuin RAW264.7-soluissa. Akteosidi vähensi myös RANKL-stimuloitua p65- ja IkBa-fosforylaatiota BMM- ja RAW264.7-soluissa (kuviot 5B ja C). 10 mMakteosidin lisääminen esti lähes täysin sekä IkBa:n hajoamisen että aktivoitumisen BMM:issä (kuvio 5B). Sen vahvistamiseksi, että NF kB:n aktivaatio liittyy akteosidin toimintaan, kB-promoottori-lusiferaasikonstruktit transfektoitiin väliaikaisesti RAW264.7-soluihin. Soluilla, joita oli inkuboitu 100 ng/ml RANKL:n kanssa, oli 3- kertaa suurempi kB-promoottoriaktiivisuus, jota 10 mM akteosidi heikensi merkittävästi (kuvio 5D).

Akteosidi estää tulehduksellisten sytokiinien tuotantoa ja TNF-a:n, c-Fosin ja NFATc1:n ilmentymistä RANKL-stimuloiduissa makrofageissa

TNF-a, IL-1b ja IL-6 ovat tärkeitä osteoklastien muodostumisessa ja toiminnassa, jota välittää NF-kB-signalointi RANKL-stimuloiduissa makrofageissa. RANKL stimuloi näiden sytokiinien tuotantoa, ja tämä tuotanto väheni huomattavasti 10 mMakteosidiesikäsittely BMM:issä (kuva 6A). Samoin akteosidi heikensi RANKL-indusoitua sytokiinien tuotantoa, paitsi IL-6, RAW264.7-makrofageissa (kuva S3). Ymmärtääksemme akteosidien toiminnan molekyylimekanismeja osteoklastogeneesissä, tutkimme edelleen akteosidin vaikutusta TNF-a:n, c-Fosin ja NFATc1:n ilmentymiseen. RANKL sääteli näiden tekijöiden mRNA-ilmentymistä BMM- ja RAW264.7-soluissa (kuviot 6B ja C). Esikäsittely 10 mM akteosidilla esti merkittävästi näiden tekijöiden RANKL-indusoitua ilmentymistä molemmissa

BMM:t ja RAW264.7-solut. Akteosidiesikäsittely vähensi myös voimakkaasti c-Fos:n ja NFATc1:n proteiinitasoja RANKL-stimuloiduissa BMM:issä (kuvio 6D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että akteosidi säätelee alaspäin RANKL:ää indusoivia osteoklastien muodostumisen välittäjiä geeni- ja proteiinitasoilla.

Akteosidi vähentää solunsisäistä ROS-tuotantoa BMM:issä annoksesta riippuvaisella tavalla Koska tiedetään, että solunsisäinen ROS-tuotanto korreloi RANKL-stimuloidun osteoklastogeneesin kanssa, tutkimme, estääkö akteosidi ROS-tuotantoa RANKL-välitteisen osteoklastien erilaistumisen aikana käyttämällä solua läpäisevää, hapettuvaa hapettavaa. , DCFH-DA. Virtaussytometria-analyysi osoitti, että DCF:lle spesifinen keskimääräinen fluoresenssisignaali BMM:issä oli ilmeisesti siirtynyt oikealle RANKL-stimulaation jälkeen verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin (kuvio 7A). Tämä muutos oli samanlainen kuin tapaus, jossa RAW264.7-makrofageja havaittiin RANKL-stimulaation jälkeen (tietoja ei näytetä). BMM:ien käsittely akteosidilla vähensi DCF:n signaalin intensiteettiä annoksesta riippuvalla tavalla. Esikäsittely 10 mM akteosidilla vähensi lähes täysin osteoklastien erilaistumisen aikana tuotetun solunsisäisen ROS:n tasot käsittelemättömille kontrollitasoille (kuvio 7B).

Oraalinen akteosidin antaminen estää osteoporoottisten biokemiallisten markkerien ja luukadon muuttumista hiirillä, joilta on poistettu munasarjat

Tutkiaksemme akteosidin vaikutusta luukatoon, valmistimme osteoporoottisen eläinmallin munasarjan poiston avulla. OVX:n ja Shammicen välillä oli merkittävä ero ruumiinpainossa koejakson aikana (tietoja ei esitetty). Ryhmällä oli merkittävästi korkeammat seerumin IL{0}}b- ja IL-6-tasot kuin valeryhmässä (kuva 8). Munasarjapoiston aiheuttamat lisäykset näiden tulehduksellisten sytokiinien määrässä vaimenivat suun kautta annettavalla akteosidilla (AC-ryhmä). Luun vaihtuvuusmarkkerien, kuten ALP:n, kalsiumin, TRAP5b:n ja OC:n, seerumitasot nousivat merkittävästi OVX-ryhmässä. Näistä osteoporoottisista markkereista kohonneet kalsiumin, TRAP5b:n ja OC:n tasot OVX-hiirillä ilmeisesti estyivät akteosidihoidolla, kun taas ALP:n seerumitaso ei muuttanut hoitoa. Keskimääräinen maksimimurtumakuormitus oikean reisiluun akselin keskelle oli merkittävästi pienempi OVX-ryhmässä kuin Sham-ryhmässä (kuva 9A). Akteosidihoito nosti murtumien enimmäismäärän Sham-ryhmän vastaavaan. Kun reisiluun kortikaalinen luu leikattiin ja tarkkailtiin optisella mikroskopialla, OVX-ryhmässä esitetyt osteoporoottiset piirteet olivat kadonneet lähes kokonaan AC-hiiristä (kuvio 9B). Akteosidin vaikutuksen varmistamiseksi OVX-indusoituun osteoporoosimalliin BMD- ja luun morfologiset parametrit kevyen proksimaalisen reisiluun trabekulaarissa analysoitiin mikro-CT:llä. Kuten kuviossa 9C esitetään, OVX-hiirillä havaittiin muutos reisiluun trabekulaarisessa arkkitehtuurissa, kun taas tämä muutos väheni akteosidikäsittelyllä. Mikro-CT-analyysin tulokset paljastivat, että BMD, luun vahvuuden mitta, väheni dramaattisesti OVX-hiirillä (kuvio 9D). Verrattuna Sham-ryhmään, OVX-hiirillä oli myös merkittäviä muutoksia BV/TV:ssä, Tb. Sp ja Tb. N, mutta ei Tb.Th. OVX-hiirten oraalinen akteosidihoito esti merkittävästi BMD:n sekä BV/TV:n ja Tb.N:n muutoksen.

Akteosidi ei vaikuta luuydinsolujen osteoblastogeneesiin

Akteosidin roolia osteoblastiseen erilaistumiseen tutkittiin edelleen käyttämällä luuydinsoluja. Kuten kuviossa 10A esitetään, DAG-käsittely lisäsi alitsariinipunavärjäytyneiden solujen määrää, eikä tämä muuttunut 10 mM akteosidiesikäsittelyllä. Läsnä olevan väriaineen määrä osoitti, että yhdistetty akteosidi- ja DAG-käsittely ei muuttanut mineralisaatiota (kuvio 10B). Vastaavasti luuspesifisten markkerien, kuten Runx2:n, osterixin, BSP:n ja OC:n, solunsisäisen kalsiumpitoisuuden (kuvio 10C) ja mRNA-tasojen (kuvio 10D) DAG-indusoituihin nousuihin ei vaikuttanut esikäsittelyakteosidi.