Abstrakti

Tavoite:
Tutkia akteosidin vaikutuksia osteoblastien ja osteoklastien aktiivisuuteen hiirillä, joilta on poistettu munasarjat (OVX).

Menetelmät:
Postmenopausaalinen osteoporoosin hiirimalli perustettiin munasarjan poistolla (OVX). Viisikymmentä C57BL/6-hiirtä jaettiin satunnaisesti viiteen ryhmään: valeleikkausryhmä, malliryhmä, estrogeeniryhmä, pieniannoksinen akteosidiryhmä ja suuren annoksen akteosidiryhmä, jossa kussakin ryhmässä oli 10 hiirtä.

Ruumiinpaino kirjattiin. Luun histomorfometrinen analyysi suoritettiin käyttämällä mikrotietokonetomografiaa (mikro-CT). Estradiolin (E2), CTX-1-, PINP- ja ALP-pitoisuudet seerumissa mitattiin vastaavilla määrityssarjoilla. Kohdun paino kirjattiin. TRAP-värjäystä käytettiin osteoklastien lukumäärän tarkkailuun. Runx2-proteiinin ilmentymisen havaitsemiseen käytettiin immunohistokemiaa. Reaaliaikaista kvantitatiivista RT-PCR:ää (qRT-PCR) ja Western blot -analyysiä käytettiin luun muodostukseen ja luun resorptioon liittyvien markkerien ilmentymisen arvioimiseksi.

Tulokset:
Verrattuna valeleikkausryhmään, malliryhmän hiirillä ruumiinpaino kasvoi merkittävästi, kohdun paino ja seerumin E2-, PINP- ja ALP-tasot vähenivät ja seerumin CTX-1-tasot kasvoivat merkittävästi. Luuparametrit mukaan lukien BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, PINP, ALP, Runx2, OCN ja Col1 vähenivät merkittävästi, kun taas Tb.Sp kasvoi merkittävästi. Femoraalisessa kudoksessa ALP-, OCN- ja Col1-mRNA-ilmentyminen väheni merkittävästi, kun taas NFATc1- ja c-fos-mRNA-ilmentyminen sekä Runx2-, p-IkB- ja p-Akt-proteiinin ilmentyminen lisääntyivät merkittävästi (P<0.05P < 0.05P<0.05). The number of osteoclasts was also increased.

Malliryhmään verrattuna kaikissa hoitoryhmissä ruumiinpaino pieneni merkittävästi, seerumin PINP- ja ALP-tasot kasvoivat merkittävästi ja seerumin CTX-1-tasot laskivat merkittävästi. BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, PINP, ALP, Runx2, OCN ja Col1 lisääntyivät merkittävästi, kun taas Tb.Sp väheni merkittävästi. Femoraalisessa kudoksessa ALP-, OCN- ja Col1-mRNA-ilmentyminen lisääntyi merkittävästi, kun taas NFATc1- ja c-fos-mRNA-ilmentyminen sekä Runx2-, p-IkB- ja p-Akt-proteiinin ilmentyminen väheni merkittävästi (P<0.05P < 0.05P<0.05). The number of osteoclasts was reduced.

Johtopäätös:
Acteosidilla on kaksinkertainen säätelyvaikutus OVX-hiirten luun uudelleenmuodostukseen. Se voi parantaa OVX-indusoitua luukatoa estämällä osteoklastien välittämää luun resorptiota estämällä NF-KB/Akt/NFATc1/c-fos-reittiä ja edistää samalla osteoblastien ohjaamaa luun muodostumista aktivoimalla Runx2/OCN/Col1-akselia.

Avainsanat:
akteosidi; postmenopausaalinen osteoporoosi; osteoblastit; osteoklastit

Mikä on osteoporoosi?

Osteoporoosi (OP) on yleinen ja usein hiljainen luuston sairaus, jolle on ominaista luun mineraalitiheyden heikkeneminen, luun mikrorakenteen heikkeneminen, lisääntynyt luun hauraus ja suurempi murtumariski. Maailmanlaajuisesti noin 18,3 % väestöstä sairastuu, ja postmenopausaaliset naiset ovat erityisen haavoittuvia. Tämä tila tunnetaan postmenopausaalisena osteoporoosina (PMOP) [1].

Estrogeenilla on keskeinen säätelyrooli luun uudelleenmuodostuksessa useiden mekanismien kautta. Luun uudelleenmuotoilun aikana osteoklastit ja osteoblastit ylläpitävät dynaamista tasapainoa luun resorption ja luun muodostumisen välillä. Kun osteoblastien aktiivisuus laskee ja/tai osteoklastien aktiivisuus muuttuu liialliseksi, tämä tasapaino häiriintyy, mikä johtaa vakavaan luumatriisin katoamiseen [2].

Siksi osteoblastien ja osteoklastien toiminnan ja muodostumisen säätely voi olla tehokas strategia estrogeenin puutteeseen liittyvän osteoporoosin hoidossa.

Miksi katsoa yrttiyhdisteitä osteoporoosin varalta?

Nykyisiä yleisiä osteoporoosin lääkkeitä ovat bisfosfonaatit, teriparatidi, raloksifeeni ja selektiiviset estrogeenireseptorin modulaattorit. Nämä lääkkeet voivat olla tehokkaita, mutta ne voivat myös aiheuttaa haittavaikutuksia, kuten maha-suolikanavan epämukavuutta ja harvoissa tapauksissa leuan osteonekroosia. Nämä huolenaiheet voivat rajoittaa pitkäaikaista käyttöä.

Viime vuosina yhä enemmän huomiota on kiinnitetty perinteiseen kasviperäiseen lääketieteeseen luuston terveyden tukemiseksi, erityisesti postmenopausaalisessa osteoporoosissa.

Rehmannia-juuri, perinteinen kiinalainen yrtti, tunnetaan munuaisten ravitsemisesta ja verenkierron edistämisestä. Sitä käytetään usein yrttivalmisteissa osteoporoosin hoitoon [3]. Useat kliiniset tutkimukset ovat raportoineet, että Rehmanniaa sisältävät kiinalaiset yrttivalmisteet voivat auttaa parantamaan luun mineraalitiheyttä, lievittämään kipua ja parantamaan kliinisiä oireita osteoporoosipotilailla [4].

Akteosidi on vesiliukoinen fenyylietanoidiglykosidi, jota löytyy Rehmanniasta, Cistanchesta, Plantagon siemenistä ja muista lääkekasveista. Sillä on raportoitu olevan antioksidanttisia, anti-inflammatorisia, diabeteslääkkeitä ja luun muodostumista edistäviä vaikutuksia [5].

Useiden tietokantojen systemaattiseen tarkasteluun ja tiedon louhintaan perustuva tutkimus ehdotti, että akteosidi voi olla yksi tärkeimmistä aktiivisista komponenteista kiinalaisissa yrttivalmisteissa postmenopausaalisen osteoporoosin hoitoon [6]. Verkkofarmakologiset tutkimukset ovat myös osoittaneet, että akteosidi voi olla keskeinen aktiivinen ainesosa yrttivalmisteissa, kuten Qigu-kapselissa ja Zuogui/Yougui-pillereissä postmenopausaalisen osteoporoosin hoidossa [7,8].

Nämä havainnot viittaavat siihen, että akteosidi voi olla lupaava luonnollinen yhdiste luuston terveydelle. Sen tarkkaa toimintamekanismia ei kuitenkaan ole vielä täysin selvitetty.

Tämä tutkimus suunniteltiin tutkimaan akteosidin vaikutuksia osteoblastien ja osteoklastien aktiivisuuteen hiirimallissa, josta munasarjat on poistettu. Tavoitteena oli tarjota tieteellinen perusta akteosidin jatkokehittämiselle osteoporoosiin liittyvässä tutkimuksessa.

 

1. Materiaalit ja välineet

1.1 Koeeläimet

Viisikymmentä SPF-luokan 6 viikon ikäistä naaraspuolista C57BL/6-hiirtä ostettiin Hebei Experimental Animal Centeristä, lisenssinumero SCXK (Hebei) 2022-001. Hiiret painoivat 20–23 g.

Kaikkia hiiriä pidettiin 12 tunnin valo/pimeyden syklissä, huoneen lämpötila säädettiin arvoon 22±3°C22 \\pm 3^\\circ C22±3°C, kosteus 55±5%55 \\pm 5\\%55±5%, ja riittävästi ruokaa ja vettä tarjottiin. Viikon mukautuvan ruokinnan jälkeen koe suoritettiin.

1.2 Lääkkeet ja reagenssit

Akteosidi, jonka puhtaus oli 98 % ja eränumero CFN97048, ostettiin Wuhan ChemFacesilta.

Estradiolivaleraattitabletit, spesifikaatio 1 mg x 21 tablettia, ostettiin Bayer Healthcare Co., Ltd.:ltä, Guangzhousta.

Hiiren seerumin estradioli (E2), alkalinen fosfataasi (ALP), tyypin I kollageenisilloittunut C-terminaalinen telopeptidi (CTX-1) ja prokollageenin tyypin I N-terminaalinen propeptidi (PINP) -määrityssarjat ostettiin Beyotime Biotechnologysta, Shanghaista.

RIPA-lyysipuskuri saatiin Sigmalta, USA. Bio-Rad DC Protein Assay Kit hankittiin Bio-Rad Laboratoriesilta, USA. Anti-fosfo-Akt, anti-Akt, anti-phospho-IKB ja anti-IKB vasta-aineet ostettiin Cell Signaling Technologylta, USA. Anti-Runtiin liittyvä transkriptiotekijä 2 (Runx2) -vasta-aine ostettiin Santa Cruz Biotechnologysta, USA:sta. TRAP-värjäyssarja ostettiin Sigmalta, USA:sta. TRIzol-reagenssi ja RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit ostettiin Thermo Fisher Scientificilta, USA.

1.3 Pääinstrumentit

Pääasiallisia käytettyjä instrumentteja olivat mm.

SKYSCAN 1276 mikrotietokonetomografia, Bruker Technology, Peking

SpectraMax M -mikrolevylukija, Molecular Devices, Shanghai

FA2004N elektroninen analyyttinen vaaka, Sailun Instruments, Peking

WMP-6105 optinen mikroskooppi, Wumo Optical Instruments, Shanghai

VeritiPro reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-järjestelmä ja PowerEase-elektroforeesilaite, Thermo Fisher Scientific, Shanghai

 

2. Menetelmät

2.1 Mallin perustaminen ja ryhmittely

C57BL/6-hiiret jaettiin satunnaisesti viiteen ryhmään:

Valeleikattu ryhmä

Malliryhmä

Estrogeeniryhmä, 1 mg/kg1 \\teksti{ mg/kg}1 mg/kg

Pieniannoksinen akteosidiryhmä, 50 mg/kg50 \\text{ mg/kg}50 mg/kg

Suuren annoksen akteosidiryhmä, 150 mg/kg150 \\text{ mg/kg}150 mg/kg

Kukin ryhmä sisälsi 10 hiirtä.

Kaikki eläimet nukutettiin 2-prosenttisella natriumpentobarbitaalilla. Pieni viilto tehtiin munasarjojen paljastamiseksi. Munasarjat paikannettiin varovasti ja poistettiin OVX-mallin luomiseksi. Valeleikkausryhmässä poistettiin vain munasarjojen läheltä oleva rasvakudos.

Leikkauksen jälkeen kaikki hiiret saivat lihaksensisäistä penisilliiniä 50 000 U/päivä 3 peräkkäisenä päivänä.

Leikkauksen jälkeen:

Estrogeeniryhmä sai estradiolivaleraattia annoksella 1 mg/kg1 \\text{ mg/kg} 1 mg/kg letkulla kerran päivässä.

Pienen ja suuren annoksen akteosidiryhmät saivat akteosidia letkulla kerran päivässä.

Valeleikkatut ja malliryhmät saivat puhdistettua vettä annoksella 10 mg/kg10 \\text{ mg/kg}10 mg/kg letkun kautta.

Hiiret lopetettiin 4 viikkoa leikkauksen jälkeen. Reisiluun kudosta ja verinäytteitä kerättiin. Reisiluut kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä 48 tunnin ajan ja arvioitiin käyttämällä mikro-CT:tä.

2.2 Mikro-CT-tunnistus

Jokaisen hiiren vasen reisiluu skannattiin käyttämällä korkean resoluution mikro-CT:tä. Skannausparametrit olivat:

Jännite: 50 kV

Virta: 55 μA

Isotrooppinen resoluutio: 6 μm

Reisiluun skannaus suoritettiin 2 mm:n etäisyydellä kasvulevystä, ja joka kerta skannattiin 720 leikettä.

Mikro-CT-tiedot analysoitiin käyttämällä INFINITT-Xelis-ohjelmistoa. Arvioidut rakenteelliset parametrit sisälsivät:

Luun mineraalitiheys (BMD)

Luun tilavuus/kokonaistilavuus (BV/TV)

Trabekulaarisen paksuus (Tb.Th)

Trabekulaarinen erotus (Tb.Sp)

Trabekulaariluku (Tb.N)

2.3 Veren biokemialliset indikaattorit

Verinäytteet kerättiin ja sentrifugoitiin nopeudella 1300 r/min 15 minuuttia 4°C4^\\circ C4°C:ssa. ELISA-sarjoja käytettiin seerumitason mittaamiseen:

CTX-1, luun resorptiomerkki

PINP, luun muodostumisen merkkiaine

ALP, luun muodostumisen merkkiaine

2.4 TRAP-värjäys

Kiinnittämisen jälkeen hiiren reisiluun kalkki poistettiin EDTA:ssa 10 päivän ajan. Sitten ne kuivattiin, upotettiin parafiiniin ja valmistettiin 6 μm:n osiin.

Leikkeet alistettiin ksyleenin vahanpoistoon, etanoli-rehydraatioon ja TRAP-värjäykseen. Tämän jälkeen osat kuivattiin, puhdistettiin ja asennettiin.

2.5 Immunohistokemiallinen (IHC) värjäys

Runx2-immunohistokemiaa varten leikattiin 5 μm:n leikkeet mikrotomilla, sitten vaha poistettiin ja hydratoitiin.

Endogeeninen peroksidaasi estettiin 0,3-prosenttisella vetyperoksidilla PBS:ssä 30 minuutin ajan.

Epäspesifisen värjäytymisen vähentämiseksi leikkeitä inkuboitiin 1 tunti PBS:ssä, joka sisälsi 10 % normaalia hevosen seerumia ja 0,1 % Tritonia X-100.

Leikkeitä inkuboitiin yön yli 4°C4^\\noin C4°C:ssa primaarisen anti-Runx2-vasta-aineen kanssa laimennuksella 1:1 000.

Seuraavaksi leikkeet pestiin PBS:llä ja inkuboitiin biotinyloidun kanin anti-vuohen IgG:n kanssa laimennoksessa 1:200 2 tuntia, mitä seurasi inkubaatio avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin kanssa 1 tunnin ajan.

Antigeenin värikehitys suoritettiin käyttämällä 3,3'-diaminobentsidiinitetrahydrokloridiliuosta, joka sisälsi 0,003 % vetyperoksidia. Vastavärjäykseen käytettiin hematoksyliiniliuosta.

2.6 Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR)

RNA uutettiin käyttämällä TRIzol-reagenssia. RNA:n määrä kussakin näytteessä normalisoitiin 1 ug:aan cDNA-synteesiä varten.

cDNA syntetisoitiin käyttämällä RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit -sarjaa.

qRT-PCR suoritettiin käyttämällä Exicycler-96 reaaliaikaista kvantitatiivista lämpösyklilaitetta.

Vahvistusparametrit olivat:

Ensimmäinen denaturointi 95∘C95^\\noin C95∘C 5 minuutin ajan

40 kolmivaiheisen PCR:n sykliä:

Denaturointi 95∘C95^\\noin C95∘C 1 minuutin ajan

Hehkutus 60∘C60^\\noin C60∘C 30 sekunnin ajan

Lopullinen pidennys 72∘C72^\\noin C72∘C 1 minuutin ajan

Tiedot normalisoitiin käyttämällä GAPDH:ta ja arvioitiin keskimääräisinä kertamuutoksina. Suhteellinen geeniekspressio laskettiin käyttämällä 2-ΔΔCt2^{-\\Delta\\Delta Ct}2-ΔΔCt-menetelmää.

2.7 Western Blot -analyysi

Solut hajotettiin käyttämällä RIPA-lyysipuskuria, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita ja fosfataasi-inhibiittoreita I ja II.

Proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bio-Rad DC Protein Assay Kit -sarjaa.

Yhtä suuret määrät proteiinia, 20 ug 20 ug 20 ug kaistaa kohti, ladattiin 10 % natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) geeleille ja siirrettiin Immobilon-P polyvinylideenifluoridikalvoille.

Kalvot estettiin 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla 1 tunnin ajan ja inkuboitiin sitten yön yli lämpötilassa 4°C4^\\noin C4°C primaaristen vasta-aineiden kanssa.

Sen jälkeen, kun kalvoja oli pesty kolme kertaa Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 0,1 % Tween-20:tä (TBST), kalvoja inkuboitiin anti-hiiri- tai anti-kaniini-IgG-piparjuuriperoksidaasilla konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa laimennuksessa 1:3 000 1 tunnin ajan.

Proteiinit visualisoitiin kemiluminesenssilla käyttäen ECL-sarjaa.

2.8 Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeelliset testit suoritettiin vähintään kolme kertaa.

Vertailut useiden ryhmien välillä suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä. Ryhmien väliset parivertailut suoritettiin käyttämällä Tukeyn monivertailutestiä.

Tilastolliseen analyysiin käytettiin SPSS 14.0 -ohjelmistoa. P:n arvo<0.05P < 0.05P<0.05 was considered statistically significant.

 

3. Tulokset

3.1 Acteosidin vaikutukset seerumin E2-tasoon, kohdun painoon, painoon ja kohdun indeksiin OVX-osteoporoottisilla hiirillä

Kuten kuvasta 1 näkyy, malliryhmän hiirillä oli huomattavasti alhaisemmat seerumin E2-tasot, kohdun paino ja kohdun indeksi verrattuna valeleikkausryhmään, kun taas ruumiinpaino kasvoi merkittävästi (P<0.05P < 0.05P<0.05).

Malliryhmään verrattuna hiirillä kaikissa hoitoryhmissä paino pieneni merkittävästi (P<0.05P < 0.05P<0.05).

Kuva 1. Akteosidin vaikutukset seerumin E2-tasoon, kohdun painoon, ruumiinpainoon ja kohdun indeksiin OVX-osteoporoottisilla hiirillä

A. Valeoperoitu ryhmä
B. Malliryhmä
C. Estrogeeniryhmä
D. Pieniannoksinen akteosidiryhmä
E. Suuriannoksinen akteosidiryhmä

Huomautus:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 vs. malliryhmä;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

 

3.2 Akteosidin vaikutukset luun histomorfometrisiin parametreihin OVX-osteoporoottisissa hiirissä

Kuten kuviosta 2 näkyy, malliryhmän hiirillä oli merkitsevästi alentunut BMD, BV/TV, Tb.N ja Tb.Th verrattuna valeleikkausryhmään, kun taas Tb.Sp oli merkittävästi lisääntynyt (P<0.05P < 0.05P<0.05).

Malliryhmään verrattuna kaikissa hoitoryhmissä BMD, BV/TV, Tb.N ja Tb.Th lisääntyivät merkittävästi, kun taas Tb.Sp oli merkittävästi pienentynyt (P<0.05P < 0.05P<0.05).

Kuva 2. Akteosidin vaikutukset luun histomorfometrisiin parametreihin OVX-osteoporoottisilla hiirillä

A. Valeoperoitu ryhmä
B. Malliryhmä
C. Estrogeeniryhmä
D. Pieniannoksinen akteosidiryhmä
E. Suuriannoksinen akteosidiryhmä

Huomautus:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 vs. malliryhmä;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

 

3.3 Akteosidin vaikutukset seerumin luuaineenvaihduntaan liittyviin indikaattoreihin OVX-osteoporoottisilla hiirillä

Kuten kuvasta 3 näkyy, malliryhmän hiirillä oli merkitsevästi alentuneet seerumin PINP- ja ALP-tasot, kun taas CTX-1-tasot kasvoivat merkitsevästi (P<0.05P < 0.05P<0.05).

Malliryhmään verrattuna kaikissa hoitoryhmissä seerumin PINP- ja ALP-tasot kohosivat merkittävästi, kun taas CTX-1-tasot laskivat merkittävästi (P<0.05P < 0.05P<0.05).

Kuva 3. Akteosidin vaikutukset seerumin luun aineenvaihduntaan liittyviin indikaattoreihin OVX-osteoporoottisilla hiirillä

A. Valeoperoitu ryhmä
B. Malliryhmä
C. Estrogeeniryhmä
D. Pieniannoksinen akteosidiryhmä
E. Suuriannoksinen akteosidiryhmä

Huomautus:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 vs. malliryhmä;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

Kuva 4. Akteosidin vaikutukset osteoklastien lukumäärään OVX-osteoporoottisten hiirten reisiluun (TRAP-värjäys)

A. Valeoperoitu ryhmä
B. Malliryhmä
C. Estrogeeniryhmä
D. Pieniannoksinen akteosidiryhmä
E. Suuriannoksinen akteosidiryhmä

Kuva 5. Akteosidin vaikutukset Runx2-proteiinin ilmentymiseen osteoporoottisten OVX-hiirten reisikudoksessa (IHC, × 400)

A. Valeoperoitu ryhmä
B. Malliryhmä
C. Estrogeeniryhmä
D. Pieniannoksinen akteosidiryhmä
E. Suuriannoksinen akteosidiryhmä

Kuva 6. Akteosidin vaikutukset ALP:n, OCN:n, Coll:n, NFATcl:n ja c-fos-mRNA:n ilmentymiseen OVX-osteoporoottisten hiirten reisikudoksessa

A. Valeoperoitu ryhmä
B. Malliryhmä
C. Estrogeeniryhmä
D. Pieniannoksinen akteosidiryhmä
E. Suuriannoksinen akteosidiryhmä

Huomautus:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 vs. malliryhmä;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

3.4 Akteosidin vaikutukset osteoporoottisten OVX-hiirten reisikudoksen osteoklastien määrään

Kuten kuviosta 4 näkyy, TRAP-positiivisten osteoklastien lukumäärä malliryhmässä kasvoi valeleikkaukseen verrattuna.

Malliryhmään verrattuna TRAP-positiivisten osteoklastien määrä väheni kaikissa hoitoryhmissä.

3.5 Acteosidin vaikutukset Runx2-proteiinin ilmentymiseen osteoporoottisten OVX-hiirten reisikudoksessa

Kuten kuviossa 5 esitetään, valeleikkaukseen verrattuna Runx2-proteiinipositiivinen ilmentyminen reisiluun kudoksessa väheni malliryhmässä.

Malliryhmään verrattuna Runx2-proteiinipositiivinen ilmentyminen reisiluun kudoksessa lisääntyi kaikissa hoitoryhmissä.

3.6 Akteosidin vaikutukset ALP:n, OCN:n, Col1:n, NFATc1:n ja c-fos-mRNA:n ilmentymiseen osteoporoottisten OVX-hiirten reisikudoksessa

Kuten kuvasta 6 näkyy, valeleikkaukseen verrattuna, reisiluun ALP:n, OCN:n ja Col1:n mRNA:n ilmentyminen väheni merkittävästi malliryhmässä, kun taas NFATc1:n ja c-fos-mRNA:n ilmentyminen lisääntyi merkittävästi (P<0.05P < 0.05P<0.05).

Malliryhmään verrattuna kaikissa hoitoryhmissä ALP-, OCN- ja Col1-mRNA-ilmentyminen lisääntyi merkittävästi, kun taas NFATc1- ja c-fos-mRNA-ilmentyminen väheni merkittävästi (P<0.05P < 0.05P<0.05).

 

Kuva 7. Akteosidin vaikutukset p-IKB- ja p-Akt-proteiinin ilmentymiseen osteoporoottisten OVX-hiirten reisikudoksessa

A. Valeoperoitu ryhmä
B. Malliryhmä
C. Estrogeeniryhmä
D. Pieniannoksinen akteosidiryhmä
E. Suuriannoksinen akteosidiryhmä

Huomautus:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 vs. malliryhmä;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

 

4. Keskustelu

Osteoporoosi on yleinen metabolinen luusairaus, jolle on ominaista luun mineraalitiheyden väheneminen, luun mikrorakenteen tuhoutuminen, lisääntynyt luun hauraus ja kohonnut murtumariski.

Noin 200 miljoonaa ihmistä maailmassa kärsii osteoporoosista. Väestön ikääntyessä sen korkea ilmaantuvuus ja kuolleisuus kuormittavat voimakkaasti yhteiskuntaa.

Postmenopausaalinen osteoporoosi johtuu pääasiassa estrogeenin puutteesta ja on yleisin osteoporoosin tyyppi. Sen tyypillisiä piirteitä ovat estrogeenitasojen lasku ja jatkuva kalsiumin menetys ikääntymisen myötä.

Osteoporoosin patologiselle mekanismille on ominaista luumassan väheneminen ja trabekulaarisen mikrorakenteen tuhoutuminen. Tämä johtuu suoraan osteoklastien muodostumisen ja osteoblastien muodostumisen välisestä epätasapainosta [9].

Ottaen huomioon estrogeenin puutteen tärkeän vaikutuksen osteoporoosiin, tässä tutkimuksessa käytettiin munasarjojen poiston aiheuttamaa hiirimallia arvioimaan akteosidin osteoporoottisia vaikutuksia.

Ensinnäkin tämä tutkimus vahvisti, että OVX aiheutti estrogeenin puutetta, kohdun atrofiaa ja luukadon hiirillä, kun taas eksogeeninen E2-lisä paransi kohdun surkastumista ja luukadoa OVX-hiirillä.

Lisäksi tässä tutkimuksessa havaittiin, että akteosidi ei muuttanut seerumin E2-tasoja tai kohdun painoa OVX-hiirillä, mutta se paransi merkittävästi luun mineraalitiheyttä ja luun mikrorakennetta, mikä paransi luukatoa.

Tämä näkyi lisääntyneenä reisiluun BMD:n, BV/TV:n, Tb.N:n ja Tb.Th:n sekä vähentyneenä Tb.Sp:nä.

Näistä parametreista:

BMD arvioi tehokkaasti luukadon asteen.

BV/TV heijastaa hohkoista luumassaa.

Tb.N, Tb.Sp ja Tb.Th käytetään pääasiassa trabekulaarisen luun spatiaalisen morfologian arvioimiseen [10].

 

Kuinka Acteoside voi tukea luun uudelleenmuotoilua

Luun muodostumisen ja luun resorption välistä epätasapainoa pidetään osteoporoosin päämekanismina.

Nykyiset osteoporoosin hoidot sisältävät pääasiassa:

Antiresorptiiviset lääkkeet, kuten bisfosfonaatit, jotka estävät osteoklastien toimintaa

Anaboliset aineet, kuten lisäkilpirauhashormoni, jotka edistävät osteoblastien toimintaa

Vaikka näillä lääkkeillä on selviä etuja luuston terveydelle, ne voivat myös liittyä haittavaikutuksiin, kuten pahoinvointiin, oksenteluun, vatsakipuihin ja lisääntyneisiin rintasyöpään ja kohdun limakalvon syöpään liittyviin riskeihin [11].

Ihanteellinen osteoporoosistrategia olisi yhdiste, jolla on kaksoissäätelyaktiivisuutta ja vähemmän sivuvaikutuksia: sellainen, joka voi estää osteoklastien erilaistumista samalla kun se lisää osteoblastien aktiivisuutta.

Tässä tutkimuksessa havaittiin, että akteosidi alensi seerumin CTX-1-tasoja ja nosti seerumin PINP- ja ALP-tasoja.

Seerumin ALP ja PINP ovat luun muodostumisen markkereita, kun taas CTX-I on luun resorption markkeri [12].

Nämä tulokset viittaavat siihen, että akteosidi voi säädellä luun aineenvaihduntaa OVX-hiirissä edistämällä luun muodostumista ja estämällä luun resorptiota, mikä osoittaa mahdollista kaksoissäätelyvaikutusta luun kiertoon.

 

Akteosidi voi auttaa vähentämään osteoklastivälitteistä luun resorptiota

Histologinen analyysi osoitti, että akteosidikäsittely vähensi TRAP-positiivisten solujen, nimittäin osteoklastien, määrää trabekulaarisessa luussa lähellä OVX-hiirten reisiluun kasvulevyä.

Tämä viittaa siihen, että akteosidi saattaa estää OVX:n aiheuttamaa osteoklastien aktivaatiota.

Luun mikroympäristössä osteoklastit ovat erikoistuneita monitumaisia ​​makrofageja, jotka muodostuvat RANKL:n ja makrofagipesäkkeitä stimuloivan tekijän indusoiman monosyyttien erilaistumisesta.

RANKL-indusoidulla signalointikaskadilla on keskeinen rooli osteoklastien toiminnan säätelyssä. Sen jälkeen kun RANKL on sitoutunut reseptoriinsa RANK, se värvää TNF-reseptoriin liittyvää tekijää 6, joka edelleen aktivoi alavirran NF-KB-reittiä.

Klassisessa NF-κB-reitissä IκB sitoutuu NF-κB:hen ja estää sen ydintranslokaatiota. Osteoklastien erilaistumisen aikana IkB fosforyloituu ja hajoaa, mikä johtaa NF-KB-reitin aktivaatioon.

Lisäksi Akt:lla on tärkeä rooli osteoklastien erilaistumisessa [13]. RANKL- ja M-CSF-stimulaatio voi aktivoida Akt:n, joka edistää NFATc1:n tuman lokalisointia glykogeenisyntaasikinaasi 3:n fosforylaatiolla, mikä indusoi osteoklastien muodostumista.

NF-KB:n ja Akt:n aktivaatio laukaisee tärkeimpien osteoklastien erilaistumistekijöiden c-fos ja NFATc1 ilmentymisen. Nämä kaksi ydinsäätelijää vaikuttavat osteoklastien esiasteiden erilaistumiseen kypsiksi osteoklasteiksi säätelemällä osteoklastispesifisten geenien ilmentymistä.

Tässä tutkimuksessa havaittiin, että akteosidikäsittely esti IKB:n hajoamista OVX-hiirten reisiluun kudoksessa, estäen siten NF-KB-reitin aktivaation. Se myös vähensi spesifisesti Akt-fosforylaatiota ja esti c-fos- ja NFATc1-proteiinin ilmentymistä.

Nämä tulokset osoittavat, että akteosidi voi estää osteoklastien erilaistumista ja estää OVX:n aiheuttamaa luun resorptiota salpaamalla NF-KB- ja Akt-reitit ja vähentämällä NFATc1- ja c-fos-ilmentymistä.

 

Acteosidi voi edistää osteoblastien aiheuttamaa luun muodostumista

Runx2 on keskeinen transkriptiotekijä luun muodostuksessa. Se ilmentyy vain osteoblasteissa ja mineralisoituneissa kudoksissa, ja sillä on tärkeä rooli osteoblastien erilaistumisessa indusoimalla keskeisiä osteoblastispesifisiä markkerigeenejä, mukaan lukien ALP, OCN ja Col1 [14].

Näistä:

ALP on osteoblastien erilaistumisen varhainen fenotyyppinen merkki. Sen aktiivisuus heijastaa osteoblastien erilaistumisen alkuvaihetta ja sillä on tärkeä rooli luun mineralisaatiossa käynnistämällä ja/tai edistämällä hydroksiapatiittikiteiden muodostumista osteoblastimatriisivesikkeleissä.

OCN ja Col1 ilmentyvät osteoblastien erilaistumisen myöhemmissä vaiheissa, jotka liittyvät solunulkoisen matriisin mineralisaation alkamiseen [15].

Immunohistokemiallisen analyysin avulla tämä tutkimus havaitsi, että akteosidi lisäsi osteogeenisen markkerin Runx2 proteiiniekspressiota reisiluun kudoksessa, mikä viittaa siihen, että se saattaa edistää luun muodostumista OVX-hiirissä.

Samanaikaisesti osteoblastispesifisten markkerigeenien ALP, OCN ja Col1 alentumista havaittiin OVX-hiirten reisikudoksessa, kun taas akteosidihoito käänsi osittain OVX:n aiheuttaman osteoblastispesifisen geenin transkription suppression.

Nämä tulokset viittaavat siihen, että akteosidi voi edistää osteogeneesiä tehostamalla sekä varhaista että myöhäistä osteoblastien erilaistumisen vaihetta, mikä tukee osteoblastien erilaistumista ja mineraalien kertymistä.

 

Mitä tämä tarkoittaa ihmisille, jotka ovat kiinnostuneita osteoporoosin yrttituesta

Tämä tutkimus tarjoaa mielekkään tieteellisen suunnan ihmisille, jotka etsivät yrttejä tai luonnollisia tapoja tukea luuston terveyttä.

Acteoside ei ole vain "kalsiumlisä". Sen sijaan tämä tutkimus viittaa siihen, että se voi toimia syvemmin auttamalla säätelemään kahden tärkeän luusolutyypin välistä tasapainoa:

Osteoblastit, jotka rakentavat luuta

Osteoklastit, jotka hajottavat luuta

Terveet luut riippuvat näiden kahden prosessin välisestä tasapainosta. Postmenopausaalisessa osteoporoosissa luun resorptio on usein vahvempaa kuin luun muodostuminen, mikä johtaa asteittaiseen luun häviämiseen.

Tämän hiiritutkimuksen mukaan akteosidi voi auttaa palauttamaan tämän tasapainon:

Tukee osteoblasteihin liittyvää luun muodostumista

Vähentää osteoklasteihin liittyvää luun resorptiota

Luun mineraalitiheyden ja trabekulaarisen luun rakenteen parantaminen

Luun uudelleenmuodostukseen liittyvien keskeisten molekyylireittien säätely

Yrttiperäisistä luuterveystuotteista kiinnostuneille asiakkaille tämä tarjoaa lupaavan tutkimusperustan akteosiderikkaille kasviaineille, kuten Rehmannia ja Cistanche.

On kuitenkin tärkeää olla vastuullinen ja realistinen: tämä tutkimus tehtiin hiirillä, ei ihmisillä. Siksi akteosidia ei pitäisi esittää todistetusti ihmisen osteoporoosin parannuskeinona. Ihmisten, joilla on diagnosoitu osteoporoosi, tulee kääntyä pätevän terveydenhuollon ammattilaisen puoleen, varsinkin jos he jo käyttävät reseptilääkkeitä tai hormonihoitoa.

Silti niille, jotka etsivät luonnollista luuta tukevaa strategiaa, akteosidi on huomion arvoinen yhdiste, koska sitä tukee uusi mekanistinen tutkimus.

 

Johtopäätös

Yhteenvetona voidaan todeta, että akteosidilla näyttää olevan kaksinkertainen säätelyvaikutus OVX-hiirten luun uudelleenmuodostukseen.

Se voi estää osteoklastien välittämää luun resorptiota estämällä NF-κB/Akt/NFATc1/c-fos-reitin aktivaatiota.

Samalla se voi edistää osteoblastien ohjaamaa luun muodostumista aktivoimalla Runx2/OCN/Col1-akselin.

Näiden mekanismien avulla akteosidi paransi OVX:n aiheuttamaa luun resorption lisääntymistä ja luun muodostumisen vähenemistä, mikä lopulta auttoi vähentämään luukatoa hiirillä.

Tämä tutkimus tehtiin kuitenkin vain eläinmallilla. Tulevien tutkimusten pitäisi luoda vastaavia solumalleja, jotta voidaan tutkia tarkemmin, kuinka akteosidi säätelee osteoblastien ja osteoklastien toimintaa in vitro. Ihmisillä tarvitaan myös lisää kliinisiä tutkimuksia, ennen kuin akteosidia voidaan suositella terapeuttiseksi vaihtoehdoksi osteoporoosin hoitoon.

Toistaiseksi akteosidi edustaa lupaavaa luonnollista yhdistettä jatkokehitykseen luuston terveyteen ja osteoporoosiin liittyvässä tutkimuksessa.

---

Viitteet

[1] Brown JP. Postmenopausaalisen osteoporoosin pitkäaikainen hoito.Endokrinol Metab (Soul), 2021, 36(3): 544–552.

[2] Fischer V, Haffner-Luntzer M. Luun ja immuunisolujen välinen vuorovaikutus: vaikutukset postmenopausaaliseen osteoporoosiin.Semin Cell Dev Biol, 2022, 123: 14–21.

[3] Hän Yuchi, Liu Ya. Liuwei Dihuang Pillin molekyylimekanismin tutkiminen diabetekseen liittyvän osteoporoosin hoidossa verkkofarmakologiaan ja molekyylitelakointiin perustuen.Perinteinen kiinalainen lääketiede, 2025, 14(7): 6.

[4] Tan Xiaoyan, Li Xinhua, Chen Guanghua et ai. Liuwei Dihuang -pillerin kliininen tehokkuus yhdistettynä tsoledronihappoon postmenopausaalisen osteoporoosin hoidossa.China Journal of Pharmaceutical Economics, 2024, 19(10): 47–51.

[5] Xiao Y, Ren Q, Wu L. Akteosidin farmakokineettiset ominaisuudet ja farmakologinen aktiivisuus: katsaus.Biomed Pharmacother, 2022, 153: 113296.

[6] Zhou Yu. Perinteisen kiinalaisen lääketieteen yhdistelmäreseptien systemaattinen arviointi ja lääkityssäännön tutkiminen postmenopausaaliseen osteoporoosiin ja Gujindanin interventioterapian mekanismiin. Väitöskirja. Changchun: Changchunin kiinalaisen lääketieteen yliopisto, 2023.

[7] Wu Tingyu, Yu Pei, Liu Zhiqiang et ai. Qigu-kapselin mekanismi osteoporoosia vastaan, joka perustuu verkkofarmakologiaan.Xinyun yliopiston lehti, 2021, 26(5): 29–37.

[8] Sun Qianhui. Tutkimus Zuogui Pillin ja Yougui Pillin vaikutuksista luuytimen mesenkymaalisten kantasolujen osteogeneesiin, adipogeneesiin ja apoptoosiin rotilla, joilta on poistettu munasarjat. Väitöskirja. Shenyang: Liaoningin perinteisen kiinalaisen lääketieteen yliopisto, 2017.

[9] Zhang QY, Gong HB, Jiang MY, et ai. Entsymaattisen lipidien peroksidaation säätely osteoblasteissa suojaa postmenopausaalista osteoporoosia vastaan.Nat Commun, 2025, 16(1): 758.

[10] Wang Dongdong, Ren Weimin, Chen Kai et ai. Mikro-CT-parametrien ennustearvo uusiutumiseen osteoporoottisen nikaman puristusmurtumaleikkauksen jälkeen.Kuvantamisen tiede ja fotokemia, 2022, 40(1): 22–27.

[11] Brown JP. Postmenopausaalisen osteoporoosin pitkäaikainen hoito.Endokrinol Metab (Soul), 2021, 36(3): 544–552.

[12] Migliorini F, Maffulli N, Spiezia F, et ai. Biomarkkerit postmenopausaalisen osteoporoosin hoidon seurannassa: Systemaattinen katsaus.J Orthop Surg Res, 2021, 16(1): 318.

[13] Udagawa N, Koide M, Nakamura M, et ai. Osteoklastien erilaistuminen RANKL- ja OPG-signalointireiteillä.J Bone Miner Metab, 2021, 39(1): 19–26.

[14] Gomathi K, Akshaya N, Srinaath N, et ai. Runx2:n säätely translaation jälkeisillä modifikaatioilla osteoblastien erilaistumisessa.Life Sci, 2020, 245: 117389.

[15] Sharma AR, Lee YH, Gankhuyag B, et ai. Alumiinioksidihiukkasten vaikutus osteoblastien osteogeeniseen kykyyn.J Funct Biomater, 2022, 13(3): 105.