Uusi netriini{0}}johdettu peptidi parantaa suojaa neuronaalista kuolemaa vastaan ja lieventää aivoverenvuotoa hiirillä, osa 3
Aug 19, 2024
Hoitoryhmiä, joissa oli suolaliuosta, TAT:tä tai TE1:tä (liuotettuna suolaliuokseen), annettiin hiirille 2 jälkeen ICH:sta ja joka päivä 5 päivän ajan intraperitoneaalisella injektiolla kokonaistilavuudella 0,1 ml eläintä kohti. Peptidejä annettiin sokkomenetelmällä annoksina 12 mg/kg.
Fysiologinen suolaliuos on yleisesti käytetty fysiologinen puskuri, jota käytetään laajalti lääketieteellisissä ja biologisissa kokeissa. Mutta tiesitkö? Fysiologinen suolaliuos voi myös parantaa muistiamme!
Ensinnäkin fysiologisella suolaliuoksella on tärkeä rooli solujen normaalissa toiminnassa. Se voi ylläpitää normaalia solun osmoottista painetta ja ylläpitää solujen normaalia morfologiaa ja toimintaa. Aivoissa suuri osa hermosoluista tarvitsee fysiologista suolaliuosta perusaineena, ja fysiologisen suolaliuoksen lisäyksellä voidaan edistää aivosolujen normaalia toimintaa, tarjota aivoille riittävästi happea ja ravinteita sekä tehdä aivoista terveempiä.
Toiseksi fysiologinen suolaliuos voi edistää signaalin välitystä aivojen hermosolujen välillä ja parantaa aivojen oppimiskykyä. Tutkimukset ovat osoittaneet, että tehtäväoppimisprosessissa fysiologisen suolaliuoksen ruiskuttaminen voi parantaa merkittävästi oppijan oppimisvaikutusta ja parantaa oppilaiden tunnetilaa, vähentää oppimisahdistusta ja stressiä. Samalla fysiologinen suolaliuos voi myös lisätä neuronien määrää ja neuronien monimutkaisuutta aivotursossa, mikä edistää muistin muodostumista ja ylläpitoa.
Lisäksi fysiologinen suolaliuos voi parantaa aivojen metabolista ympäristöä ja vähentää erilaisia haitallisia vaikutuksia aivoihin, kuten vaurioita, leesioita, iskemiaa ja hypoksiaa. Nämä ovat tekijöitä, jotka voivat vahingoittaa aivoja, ja fysiologisen suolaliuoksen ruiskuttaminen voi parantaa aivojen selviytymiskykyä ja vähentää vaurioita, mikä parantaa aivojen muistia ja ajattelukykyä.
Yleensä suolaliuos on ihanteellinen aine muistin parantamiseen. Sillä voi olla useita myönteisiä vaikutuksia aivoihin, mukaan lukien hermosolujen lukumäärän ja monimutkaisuuden lisääminen, aineenvaihduntaympäristön tehostaminen ja signaalinsiirron edistäminen hermosolujen välillä. Siksi, kun meidän on parannettava muistiamme, voimme yhtä hyvin harkita suolaliuoksen ruiskuttamista antaaksemme paremman suojan ja tuen aivoillemme. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistiamme, ja Cistanche voi parantaa muistiamme merkittävästi, koska se voi myös säädellä välittäjäaineiden tasapainoa, kuten nostaa asetyylikoliinin ja kasvutekijöiden tasoa, jotka ovat erittäin tärkeitä muistille ja oppimiselle. Lisäksi Cistanche voi myös parantaa verenkiertoa ja edistää hapen toimitusta, mikä voi varmistaa, että aivot saavat riittävästi ravintoa ja energiaa, mikä parantaa aivojen elinvoimaa ja kestävyyttä.
Napsauta Tiedä tapoja parantaa muistiasi
4.13. ICH:n kollagenaasi-indusoitu hiirimalli
Kollagenaasi-injektiota käytetään yleisesti ICH:n indusoimiseen [60]. Urospuoliset C57BL/6-hiiret (8-12 viikon ikäiset) nukutettiin isofluraanilla (2-5 %) ja asetettiin stereotaksiselle kehykselle.
Toimenpiteen aikana jokaisen eläimen ruumiinlämpö pidettiin 37 ◦C:ssa homeotermisellä peitolla. Stereotaksisella instrumentilla (Ruiwode Life ScienceCo., Ltd., Shenzhen, Kiina) ja ruiskulla (Hamilton Company, Reno, NV, USA) 0,3 µLof-kollagenaasi (0).{12 }}45 IU Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) infusoitiin oikeanpuoleiseen triatumiin (AP: +0,2 mm; ML: -2,3 mm; DV: -3,5 mm) virtausnopeudella 0,1 µl/min.
Yhteensä 0,3 µl suolaliuosta infusoitiin kontrollieläimiin. Kaikki kirurgiset toimenpiteet suoritettiin aseptisissa olosuhteissa. Tässä tutkimuksessa käytettiin yli 66 uroshiirtä, ja eläimet jaettiin satunnaisesti ryhmiin ennen jokaista koetta [57].
4.14. Käyttäytymisanalyysi
Hiirten neurologinen käyttäytymisanalyysi aivohematooman muodostumisen jälkeen havaittiin teipinpoistotestillä [61] ja sylinteritestillä [60]. Tarranauhan poistotesti suoritettiin asettamalla teippi hiirten kunkin etukäpälän (oikealle ja vasemmalle) istutusalueelle.
Jokainen hiiri asetettiin uuteen häkkiin.
Aika nauhan kiinnittämisestä siihen, kun hiiri poisti sen onnistuneesti, kirjattiin jokaiselle tassulle. Jokaista tassua kohden sallittiin enintään 300 s. Kokeiden välillä eläimet pidettiin kotihäkeissään taudinaiheuttajista vapaassa tilassa.
Sylinteritesti suoritettiin asettamalla hiiri läpinäkyvään akryylilasisylinteriin (halkaisija: 8 cm; korkeus: 25 cm) kahden peilin ja kameran eteen 5 minuutiksi. Kamera sijoitettiin keskelle kahden peilin ja sylinterin eteen optimaalisen videokuvan saamiseksi.
Itsenäisen eturaajan käytön arvioimiseksi arvioitiin (1) hiirten kykyä koskettaa sylinterin seinämää yhdellä eturaajalla täyden kasvatuksen aikana ja (2) hiirten kykyä laskeutua vain yhdellä eturaajalla lattialle täyden kasvatuksen jälkeen. Ainakin 20 kontaktipistettä jokaista eturaajaa kohti laskettiin hidastettua liikettä käyttäen.
Leikkausta edeltävää lähtötilanneanalyysiä varten testi suoritettiin kahdesti hiirtä kohden 1 tunnin taukolla kokeiden välillä. Eturaaja ilmaistaan oikean ja vasemman puolen itsenäisen eturaajan käytön suhteena.
4.15. Hematoomatilavuusanalyysi
Sen määrittämiseksi, vähensivätkö hoidot hematooman tilavuutta, hiiret tapettiin 5 päivää ICH:n jälkeen; aivot poistettiin ja pakastettiin OCT:ssa. Koronaalileikkeet leikattiin 30 µm:n paksuisiksi ja asetettiin suoraan lasilevyille. Hematooman tilavuuden kvantifioimiseksi osat digitoitiin standardoiduilla koronatasoilla.
Sokea käyttäjä mittasi ääriviivat ja hematooman vasemmalla ja oikealla pallonpuoliskolla kussakin osassa. Hematooman tilavuus ja turvotus mitattiin ja laskettiin käyttämällä ImageJ:tä (NIH).
Ainakin viidelle aivolle ryhmää kohden tehtiin hematoomamittaukset, ja hematoomatilavuus mitattiin koko aivoista.
4.16. Fluori-Jade C -värjäys
Hiirten neurodegeneraatio kollagenaasi-indusoidun ICH:n jälkeen arvioitiin värjäämällä Fluoro-jade C Ready-to-Dilute -värjäyssarjalla (TR-100-FJT, Biosensis, Thebarton, Australia) valmistajan protokollan mukaisesti [62].
Lyhyesti sanottuna kontrollihiiret ja ICH-hiiret (±ip-peptidi) tapettiin 5 päivää mallintamisen jälkeen, ja aivot käsiteltiin immunosytokemian kokeessa käytetyn protokollan mukaisesti.
Kelluvat aivoleikkeet upotettiin 1-prosenttiseen natriumhydroksidiliuokseen 5 minuutiksi, huuhdeltiin 2 minuutin ajan 70-prosenttisessa etanolissa ja huuhdeltiin sitten 2 minuutin ajan tislatussa vedessä. Seuraavaksi kelluvat osat upotettiin 0,06 % kaliumpermanganaattiliuokseen (KMnO4 tislatussa vedessä) 10 minuutiksi.
Leikkeet pestiin ddH2O:lla ennen kuin ne upotettiin 0,0001 % Fluoro-jade-värjäysliuokseen (Fluoro-jade C tislatussa vedessä) 20 minuutiksi sekoittaen kevyesti pimeässä.
Leikkeet pestiin ddH20:lla, kiinnitettiin päällystetyille objektilaseille ja kuivattiin huoneenlämpötilassa yön yli pimeässä. Fluori-Jade C -värjäytyminen perihematomaalisella alueella tutkittiin Zeiss LSM 880 konfokaalimikroskoopilla. Fluoro-jade Cstainingin kvantitointi suoritettiin käyttämällä ImageJ-ohjelmistoa.
4.17. Kudosten immunofluoresenssi
Kudosten immunofluoresenssivärjäys suoritettiin käyttämällä sarjaa 30-µm paksuisia leikkeitä. Leikkeet inkuboitiin seuraavien primääristen vasta-aineiden kanssa: hiiren antiNeuN (1:500, Millipore, MAB377, Billerica, MA, USA) tai hiiren anti-GFAP (1:200, SigmaAldrich, G3893, St Louis, MO, USA) vasta-aineet 4 °C:ssa ◦C yön yli. PBS:llä pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin Alexa Fluor 488-konjugoidun aasin anti-hiirivasta-aineen (1:1000; Invitrogen, A21202, Carlsbad, CA, USA) kanssa.
4.18. TUNEL-määritys
Terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasivälitteistä deoksiuridiinitrifosfaatti (dUTP) nick end-labeling (TUNEL) -määritystä käytettiin tunnistamaan apoptoottisia soluja, joissa oli tuman DNA-fragmentaatiota aivojen perihematomaalisella alueella.
Värjäys suoritettiin käyttämällä kaupallista yksivaiheista TUNEL-apoptoosimäärityspakkausta (Beyotime, C1090, Nanjing, Kiina) ja suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kudos-immunofluoresenssin jälkeen suoritettiin TUNEL-reaktio.
Aivoleikkeitä inkuboitiin TUNEL-reaktioseoksella (1 tunti 37 °C:ssa), ja sitten leikkeet pestiin PBS:llä ja vastavärjättiin DAPI:lla. NeuN-TUNEL-värjäyksen samanaikainen lokalisaatio tutkittiin Zeiss LSM 880 konfokaalimikroskoopilla.
TUNEL-positiiviset neuronit (NeuN-positiiviset) perihematomaalisella alueella striatumin sisällä määritettiin käyttämällä ImageJ-ohjelmistoa kolmella eri kuvalla hiirtä kohden 20-kertaisella objektiivilla. GFAP-TUNEL-värjäyksen kolokalisaatio oli samanlainen kuin NeuN-TUNEL-värjäyksen.
4.19. In vivo -veri-aivoesteen läpäisevyysmääritys
In vivo -veri-aivoesteen läpäisevyyden määritykset suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [63–65]. Lyhyesti, kontrollihiiriin ja ICH-hiiriin (±ip-peptidi) injektoitiin intraperitoneaalisesti FITC-leimattua 4 kDa:n dekstraania (100 µl 2 mM kantaliuosta PBS:ssä, Sigma Aldrich, 46944-100 MG-F, St Louis, MO, USA) mallinnuksen jälkeen 5 päivää, jonka jälkeen anestesia 5 minuuttia myöhemmin.
Merkkiaineen kiertoajan 10 minuutin jälkeen eläimet valmisteltiin sydämen läpi tapahtuvaa perfuusiota varten, ja rintaontelosta kerättiin ~ 300 ui verta juuri eteispunktion jälkeen, mitä seurasi 3 minuutin perfuusio PBS:llä. Hemiaivot (vapaita hajulohkoista, pikkuaivoista ja takaaivoista) ja yksi munuainen kerättiin ja pakastettiin välittömästi nestemäisellä typellä ja säilytettiin -80 ◦C:ssa.
Fluoresenssimittausta varten näytteet sulatettiin jäällä, punnittiin ja homogenisoitiin PBS:ssä (400 µl hemicerebrumille ja 600 µl munuaisille), minkä jälkeen sentrifugoitiin 20 minuuttia 4 ◦ C:ssa ja 15, 000 × g.
Supernatantit (100 µl) sekä yhtä suuret määrät seerumia (1/5 laimennus PBS:ssä) ladattiin 96-kuoppalevyyn ja fluoresenssi mitattiin vastaavalla virityksellä (490 nm)/emissiolla (520 nm). ) levynlukijassa (Tecan, Männedorf, Sveitsi). Valeeläimiä (ilman merkkiinjektiota) käytettiin autofluoresenssiarvojen vähentämiseen. Permeabiliteettiindeksi (ml/g) laskettiin kudosten RFU:iden/g kudospainon ja seerumin RFU:iden/ml seerumin suhteena.
4.20. Fluoresoiva lektiinivärjäys
Aivojen mikrosuonten visualisoimiseksi käytimme fluoreseiinikonjugoitua Lycopersicon esculentum lektiiniä (1:200, Vector Laboratories, FL-1171, Burlingame, CA, USA) upotettuihin leikkeihin 1 tunnin ajan.
Leikkeet kuvattiin Zeiss LSM 880 -konfokaalimikroskoopilla 20-kertaisella objektiivilla, ja kuvat käsiteltiin 1,3 gamma-asetuksella. Kolme kuvaa otettiin kolmelta ennalta määritellyltä alueelta sepelvaltimoaivojen perihematomaalisella alueella. Sokkoutunut tutkija määritti suonen haarapisteet kussakin aivossa. Haaroittumiskohta määriteltiin yhdeksi fluoreseiinilla leimatuksi suoneksi, joka erottui selvästi kahteen erilliseen ja erilliseen suoniuraan [66].
4.21. Tilastollinen analyysi
Kaikki kokeelliset toimenpiteet suoritettiin sokkoina ja suoritettiin 3 kertaa itsenäisesti, kuten aiemmin on kuvattu [67]. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. Tilastollinen analyysi suoritettiin soveltuvin osin yksisuuntaisella ANOVAlla, kaksisuuntaisella ANOVAlla ja Studentin testillä käyttämällä GraphPad Prism v7:ää (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) ) ja SPSS-ohjelmistoversio 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).
Tilastolliset parametrit löytyvät vastaavista kuvien selitteistä. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin arvoon *p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.]
5. Johtopäätökset
Netrinin-1 EGF3-domeeni on ratkaisevan tärkeä Netrin-1 vuorovaikutuksessa DCC:n kanssa ja voi aktivoida erilaisia signalointireittejä. Netrin-1:n katkaistu peptidi E1 (jäännökset 407–422) on vuorovaikutuksessa DCC:n kanssa suojellakseen hermosoluja hemiinin aiheuttamalta toksisuudelta.
Peptidin E1 käyttö parantaa toiminnallista palautumista ICH:n kokeellisessa mallissa. Lisäksi peptidi E1 voi suojata hermosoluja degeneraatiolta ja apoptoosilta ICH:n jälkeen.
Tekijän panokset: Conceptualization, LL, Z.-XH ja X.-JZ; metodologia, LL, K.-JL ja J.-BC; validointi H.-LY ja X.-XH; tutkimus, X.-JZ; tietojen kuratointi, JY; resurssit LL ja Z.-XH; kirjoitus LL, Z.-XH ja X.-JZ; valvonta, Z.-XH, X.-JZ; rahoituksen hankinta, Z.-XHand X.-JZ Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet käsikirjoituksen julkaistun version ja hyväksyneet sen.
Rahoitus: Tätä tutkimusta rahoitti Kiinan kansallinen luonnontieteellinen säätiö (31671065 ja 32071018), Jilinin maakunnan tieteen ja teknologian kehittämissuunnitelma (202520YY01017404).
Institutional Review Boardin lausunto: Northeast Normal Universityn Institutional Animal Careand Use Committee (NENU/IACUC, AP2016200299) hyväksyi kaikki menettelyt. Kiinan kansantasavallan kansalliset standardit (GB/T 35892–2018), Laboratory Animal-Guideline for Ethical Review of Animal Welfare, toimi eläinten hoidossa ja protokollissamme.
Ilmoitettu suostumus: Ei sovelleta.
Kiitokset: Tätä työtä tukivat Kiinan kansallinen luonnontieteellinen säätiö (31671065 ja 32071018) sekä Jilinin maakunnan tieteen ja teknologian kehittämissuunnitelma (202520YY01017404).
Eturistiriidat: Kirjoittajat ilmoittavat, että ne eivät ole eturistiriitoja. Rahoittajalla ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelussa; tietojen keräämisessä, analysoinnissa tai tulkinnassa; käsikirjoituksen kirjoittamisessa tai tulosten julkaisupäätöksessä.
Viitteet
1. Kirshner, HS Aivojensisäisen verenvuodon lääketieteellinen hallinta: Takaisin perusasioihin. Int. J. Clin. Harjoittele. 2008, 62, 521–522.[CrossRef] [PubMed]
2. Anderson, CS; Heeley, E.; Huang, Y.; Wang, J.; Stapf, C.; Delcourt, C.; Lindley, R.; Robinson, T.; Lavados, P.; Neal, B.; et ai. Nopea verenpaineen lasku potilailla, joilla on akuutti aivoverenvuoto. N. Engl. J. Med. 2013, 368, 2355–2365. [CrossRef][PubMed]
3. Qureshi, AI; Mendelow, AD; Hanley, DF Aivojen sisäinen verenvuoto. Lancet (Lond. Engl.) 2009, 373, 1632–1644. [CrossRef]
4. Pidä, RF; Hua, Y.; Xi, G. Aivojen sisäinen verenvuoto: Vamman mekanismit ja terapeuttiset kohteet. Lancet Neurol. 2012, 11 720–731. [CrossRef]
5. Schrag, M.; Kirshner, H. Aivojen sisäisen verenvuodon hoito: JACC Focus -seminaari. J. Am. Coll. Cardiol. 2020, 75, 1819–1831.[CrossRef] [PubMed]
6. Kandasamy, R.; Idris, Z.; Abdullah, JM aivoverenvuotokirurgia. Neurovaskulaarisessa kirurgiassa neurovaskulaaristen sairauksien kirurgiset lähestymistavat; July, J., Wahjoepramono, EJ, toim.; Springer: Singapore, 2019; s. 201–210.7. Broughton,
7. Broughton, BR; Reutens, DC; Sobey, CG Apoptoottiset mekanismit aivoiskemian jälkeen. Aivohalvaus 2009, 40, e331–e339. [CrossRef][PubMed]
8. Kristiansen, M.; Graversen, JH; Jacobsen, C.; Sonne, O.; Hoffman, HJ; laki, SK; Moestrup, SK Hemoglobiininpoistoreseptorin tunnistaminen. Nature 2001, 409, 198–201. [CrossRef]
9. Madangarli, N.; Bonsack, F.; Dasari, R.; Sukumari-Ramesh, S. Aivojen sisäinen verenvuoto: veren komponentit ja neurotoksisuus. Brain Sci. 2019, 9, 316. [CrossRef]
10. Deiner, MS; Kennedy, TE; Fazeli, A.; Serafini, T.; Tessier-Lavigne, M.; Sretavan, DW Netrin-1 ja DCC välittävät aksonia paikallisesti optisessa levyssä: Toiminnan menetys johtaa näköhermon hypoplasiaan. Neuron 1997, 19, 575-589. [CrossRef]
11. Kennedy, TE; Serafini, T.; de la Torre, JR; Tessier-Lavigne, M. Netriinit ovat diffuusioituvia kemotrooppisia tekijöitä sikiön selkäytimen komissuraalisille aksoneille. Cell 1994, 78, 425-435. [CrossRef]
12. Flores, C. Netriinin-1 rooli mesokortikolimbisen dopamiinijärjestelmän organisoinnissa ja toiminnassa. J. Psychiatry Neurosci. Jpn.2011, 36, 296–310. [CrossRef]
For more information:1950477648nn@gmail.com
