Hypoksian aiheuttaman tekijän erottuva jakautuminen-1 viljellyissä munuaisten tubulussoluissa hypoperfuusiolla, jota simuloidaan peittolasien asetuksella

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Abstrakti

Kroonisella hypoksialla munuaisten tubulointerstitiumissa on keskeinen rooli kroonisen taudin etenemisessämunuainensairaus(CKD). Siksi on tärkeää tutkia tubulaarista hypoksiaa ja hypoksiaa indusoivan tekijän (HIF)-1 aktiivisuutta vasteena hypoksiaan. Peritubulaarisen kapillaarin harvinaisuus aiheuttaa hypoperfuusiota CKD:ssä; Hypoperfuusion vaikutusta HIF:iin on kuitenkin harvoin tutkittu. Indusoimme hypoperfuusion, jonka aiheutti peitinlasien sijoittaminen ihmiseenmunuainen-2 solua ja havaitsi happigradientin kansilasin alla. HIF-1:n immunosytokemia osoitti munkin muotoisen muodostelman pimonidatsolipositiivisen alueen reunalla, jonka nimesimme "HIF-renkaaksi". HIF-renkaan happijännityksen arvioitiin olevan noin 4-20 mmHg. Tämä tulos ei ollut yhteensopiva aiempien tutkimusten tulosten kanssa, jotka osoittivat HIF-1:n kerääntymistä hapettomalla alueella homogeenisen happijännityksen kanssa. Havaitsimme lisäksi pH-gradientin läsnäolon peitinlasin alla sekä HIF-renkaan siirtymän, joka johtuu viljelyalustan pH:n muutoksista, mikä viittaa siihen, että HIF-rengas muodostui HIF-1:aan liittyvän suppression seurauksena. matalaan pH-arvoon. Tämä tutkimus osoitti, että HIF{10}}-aktivaatio jäljittelee fysiologista tilaa viljellyissä soluissa, joissa on hypoperfuusio.

AVAINSANAThypoperfuusio, hypoksia, hypoksian aiheuttama tekijä, happigradientti, pH

Cistanche herbaestää munuaissairauksia, napsauta tästä saadaksesi näytteen

1|JOHDANTO

Kroonisen sairauden esiintyvyysmunuainensairaus(CKD) lisääntyy kaikkialla maailmassa yhteiskuntien ikääntyessä (Tonelli & Riella, 2014). CKD:n eteneminen on peruuttamatonta, kun munuaisvaurio saavuttaa tietyn tason ja johtaa lopulta loppuvaiheen munuaissairauteen (ESRD), perussairaudesta riippumatta. Tämä tulos osoittaa "lopullisen yhteisen polun" olemassaolon. Aiempien patologisten analyysien mukaan munuaisten toiminnan heikkeneminen korreloi voimakkaammin tubulointerstitiaalisen vaurion kuin glomerulaarisen vaurion kanssa. On ollut useita raportteja, jotka osoittavat, että munuaisfibroosi aiheuttaa kroonista hypoksiaa tubulointerstitiumissa, ja tämä tubulointerstitiaalinen hypoksia pahentaa kroonista munuaistautia ja johtaa ESRD:hen. Nämä todisteet osoittavat, että tubulointerstitiaalinen hypoksia on osa CKD:n lopullista yhteistä reittiä (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Themunuainenon erittäin herkkä hypoksialle, koska sen hapen tarve on suuri ja munuaisvaltimoiden ja suonien välillä on happishuntti (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Siksi katsomme, että on välttämätöntä tutkia hypoksiaa ja vastetta hypoksiaan munuaisten tubulointerstitiumissa.

Ensisijainen biologinen reaktio hypoksiaan elävissä organismeissa tapahtuu hypoksian aiheuttaman tekijän (HIF) kautta (Hypoxia, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou et al., 2003). HIF koostuu - ja -alayksiköistä. Vaikka -alayksikkö on konstitutiivisesti aktiivinen, -alayksikkö hajoaa hapen läsnä ollessa. Normoksisissa olosuhteissa HIF- hydroksyloituu prolyylihydroksylaasidomeenilla (Ph.D.), mikä tekee sen tunnistettavaksi von Hippel-Lindau -tuumorisuppressorilla (VHL). Tämä tunnistaminen johtaa ubikvitinoitumiseen ja hydroksyloidun HIF- hajoamiseen proteasomissa. Hypoksisissa olosuhteissa HIF- kerääntyy sytosoliin, koska hydroksyloimaton HIF- vältyy hajoamiselta. Kertynyt HIF- siirtyy sytosolista tumaan, jossa se dimeroituu HIF-:n kanssa ja toimii transkriptiotekijänä edistäen alavirran geenien ilmentymistä. Kolmesta tunnistetusta HIF-alayksiköiden isoformista – HIF-1, HIF-2 ja HIF-3 – munuaisten tubulusepiteelisolujen tiedetään ilmentävän HIF-1 (Tanaka et al. ., 2016). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet tilapäistä tai alueellista sairaanhoitovuoteen kertymistämunuainenCKD:n kanssa (Goldfarb et al., 2006; Yu et ai., 2012), ja tämä HIF aktivoituu alentuneessa happipaineessa CKD-miljöössä. Sopeutumishäiriö hypoksiaan CKD:ssä saattaa johtua tekijöistä, jotka estävät HIF-reittejä (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). HIF-aktivaation suojaavia vaikutuksia on raportoitu useissa eläinmalleissa, mukaan lukien streptotsotosiini-indusoidut diabeettiset rotat ja 5/6 nefrektomiarotat (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). Ph.D. inhibiittorit ovat viime aikoina herättäneet huomiota uusina terapeuttisina lähestymistavoina munuaisanemiaan CKD-potilailla (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al. ., 2016; Provenzano et ai., 2016). Kuitenkin yksityiskohdat munuaisten hypoksian etenemisestä ja tavasta, jolla TIF-kertyvyys tapahtuumunuainenCKD:n kanssa, jää epäselväksi. HIF-:n happiriippuvainen hydroksylaatio tapahtuu sytosolissa, ja siksi on tärkeää mitata solunsisäinen ja solunulkoinen happipaine. Happipaineen mittaamiseen käytetään useita menetelmiä, mukaan lukien mikroelektrodien käyttö tai veren happitasosta riippuvainen magneettikuvaus (BOLD-MRI). Käytimme solunsisäisen happitilan kvantitatiiviseen mittaamiseen fosforesenssin elinkaarikuvausmikroskopiaa (PLIM) (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 on fosforoiva väriaine, joka perustuu iridium(III)-kompleksiin BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=bentsoaattipyridiini, aac=asetyyliasetoni), jossa on kationinen dimetyyliaminoryhmä, joka on passiivisesti jakautuvat solunsisäisiin lysosomeihin. Se syntetisoitiin fosfo-uudeksi koettimeksi mittaamaan solunsisäistä hapenpainetta (Yoshihara et al., 2015). PLIM BTPDM1:n kanssa mahdollisti korkearesoluutioisten kuvien saamisen hapen osapaineesta munuaisten tubulussoluissa normaalien hiirten munuaisten pinnalla, mikä antoi tietoja happigradientin olemassaolosta jopa normaaleissa munuaisissa (Hirakawa et al., 2018). ).

Elävissä elimissä on happigradientteja, mukaan lukienmunuaiset, jopa normaaleissa olosuhteissa (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), ja tällaisia ​​gradientteja voidaan siksi odottaa myös kroonisessa taudissa. Hypoperfuusio johtuu CKD:n mikroverisuonten harvenemisesta, jossa etenevä glomerulaarinen vaurio johtaa peritubulaarisen kapillaariverenvirtauksen vähenemiseen, mikä pahentaa interstitiaalista fibroosia. Interstitiaalinen fibroosi heikentää hapen diffuusiota ja syöttöä tubulussoluihin ja johtaa mikroverisuonten harvenemiseen, mikä entisestään pahentaa tubulointerstitiaalista hypoksiaa (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Hypoperfuusion biologiset vaikutukset jäävät kuitenkin hämäriksi, koska useimmat tutkimukset ovat tutkineet hypoksian ja HIF-1:n vaikutuksia viljeltyihin soluihin homogeenisen perfuusion ja happipaineen olosuhteissa (Rexius-Hall et al., 2017). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että yksikerroksiset viljellyt solut, jotka on peitetty peittolasilla, tarjoavat hyvän mallin hypoperfuusiota varten, jonka aiheuttaa viljelyalustassa oleva diffuusioeste. Mallitettu hypoperfuusio liittyy happigradienttiin, koska peitinlasi estää hapen diffuusion alustan yläosasta soluihin (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). Peitinlasilla peitetyssä yksikerroksisessa viljellyissä soluissa solunsisäinen happijännitys laskee etäisyyden mukaan peitinlasin reunasta, koska hapen diffuusio viljeltyihin soluihin on rajoitettu. Tämän seurauksena happigradientti muodostuu peitinlasin reunasta keskelle ja solunsisäinen happijännitys voi pudota hapettomalle alueelle peitinlasin keskellä (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . Tässä tutkimuksessa keskityimme HIF-aktivaatioon ja tutkimme, onko HIF-ekspressiossa hapesta riippumatonta muutosta hypoperfuusion läsnä ollessa happigradientin kanssa. Koska hypoperfuusio happigradientin kanssa esiintyy munuaistiehyissä in vivo, happiriippumattomien vaikutusten havainnointi HIF-ilmentymiseen peitinlasimallissa voi antaa käsityksen mekanismista, joka on taustalla CKD:n riittämättömyyden HIF-akkumulaatiossa.

cistanche-uutemunuaisille

2|MATERIAALIT JA MENETELMÄT

2.1|Soluviljely

Viljeltyjä soluja inkuboitiin kostutetussa inkubaattorissa, jossa oli 5 % C02:ta. Hypoksinen inkubaatio suoritettiin henkilökohtaisessa CO2/monikaasu-inkubaattorissa APM-30D (Astec). Anoksia indusoitiin anoksiapussilla, AnaeroPackilla ja anaerobisilla viljelysarjoilla #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

HK-2 solut (Homo sapiens, ihminenmunuainen, uros, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), immortalisoitu proksimaalinen tubulusepiteelisolulinja normaalista aikuisen ihmisen munuaisesta, viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaine/ravinneseoksessa F{{2} } Kinkku (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich), joka sisältää 10 prosenttia naudan sikiön seerumia (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) ja penisilliini-streptomysiiniliuosta (15070063, Thermo Fisher Scientific) 10 cm:n viljelymaljassa. Siirtämistä varten HK-2-solut dissosioitiin trypsiinillä (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ja sentrifugoitiin 300 g:ssä 5 minuuttia.

HeLa kohdunkaulan syöpäsolut ja ihmisen alkiomunuainensoluja 293 (HEK293) viljeltiin DMEM:ssä alhaisen (1000 mg/l) glukoosin (D6046, Sigma Aldrich) kanssa, joka sisälsi 5 prosenttia FBS:ää 10 cm:n viljelymaljassa. Nämä solut siirrettiin HK-2-soluina.

Munuaisten proksimaaliset tubulusepiteelisolut (RPTEC:t) (CC- 2553, Cambrex) ylläpidettiin RenaLifeTM Comp -pakkausten (LRC-LL0025, Lonza Ltd.) avulla. Passointia varten RPTEC:t dissosioitiin käyttämällä trypsiiniä, neutraloitiin Trypsin Neutralizing Solution -liuoksella (CC-5002, Lonza Ltd.) ja sentrifugoitiin 200 g:ssä 5 minuuttia.

2.2|Hypoperfuusiomallin muodostaminen peitinlasien asetuksella

Pyöreät, halkaisijaltaan 15 mm:n peitelasit (C015001, Matsunami) puhdistettiin ultraäänellä ja säilytettiin 99,5-prosenttisessa etanolissa ennen käyttöä. Käytettiin kahta menetelmää, jotka perustuivat solujen havainnointiin peitinlasin ulkopuolella.

Yksikerroksiset viljellyt solut asetettiin peitinlasin ja astian pohjan väliin (kuva S1a, b) tai vaihtoehtoisella menetelmällä (kuva S1c), kuten alla on kuvattu. Joko perinteinen tai vaihtoehtoinen menetelmä valittiin muodostamaan peitinlasimallimme live-kuvaukseen, olipa kyseessä happikuvaus tai PH-kuvaus. Immunosytokemiaan (ICC) valittiin vaihtoehtoinen menetelmä, koska perinteistä menetelmää käytettäessä suurin osa soluista irtosi usein maljan pohjasta peitinlasien poiston yhteydessä solujen kiinnittämistä varten (kuva S2a).

2.2.1|Perinteinen menetelmä

Päivänä 1 solut asetettiin 27 mm:n lasipohjaisen maljan (3910-035, Iwaki) pohjalle yhtymäkohtaan 100 prosenttia* (noin 5,0 × 105/malja). Niitä viljeltiin yön yli DMEM/F12:ssa, joka sisälsi 10 % FBS:ää ilman antibioottiliuosta. Päivänä 2 peittilasi asetettiin viljeltyjen solujen päälle ilmoitetuksi ajaksi (kuvio S1b).

2.2.2|Vaihtoehtoinen menetelmä

Solut kylvettiin peitinlasille 35 mm:n viljelymaljassa 100 prosentin konfluenssissa (noin 5,0 × 105/malja) päivänä.

1. Niitä viljeltiin yön yli DMEM/F12:ssa, joka sisälsi 10 % FBS:ää ilman antibioottiliuosta. Päivänä 2 kansilasi käännettiin ylösalaisin sen solujen pinnan kiinnittämiseksi uuden 27 mm:n lasipohjaisen astian pohjaan tietyksi ajaksi (kuva S1c).

Teimme myös peitinlasimallin käyttämällä pyöreitä, halkaisijaltaan 10 mm:n peitelaseja (CS01005, Matsunami) (kuva S2b).

2.3|Elävä happikuvaus BTPDM1:llä

Viljellyt solut valmistettiin päivänä 1, kuten edellä on kuvattu. Päivänä 2 solut huuhdeltiin kahdesti Hanksin tasapainotetulla suolaliuoksella (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) ja inkuboitiin 500 nM BTPDM1:n kanssa, iridiumpohjaisen kationisen lipofiilisen väriaineen kanssa, jota käytettiin solunsisäisenä fosforoivana koettimena (Yoshihara et al. 2015), DMEM/F12:ssa ilman fenolipunaista (21041-025, Thermo Fisher Scientific) 30 minuutin ajan. Sen jälkeen kun solut oli pesty kahdesti HBSS:llä, ne asetettiin peitinlasin ja astian pohjan väliin, kuten edellä on kuvattu. BTPDM1:n fosforesenssin intensiteetti peittolasilla peitetyissä viljellyissä soluissa tarkkailtiin viritys- ja emissiosuodattimella ja BTPDM1-fosforesenssi (Hirakawa et al., 2015) havaittiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia, BZ-X710 (Keyence Corporation). Käänteisestä fluoresoivasta mikroskoopista saatujen kuvien kirkkautta ja kontrastia säädettiin käyttämällä BZ-X-analyysiohjelmistoa.

2.4|Immunosytokemia

Peitinlasilla olevia soluja viljeltiin 200 µM pimonidatsoli-HCl:lla (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) DMEM/F12:ssa ilman fenolipunaista 1 tunnin ajan, minkä jälkeen peitinlasia käännettiin ja kiinnitettiin kansilasiastiaan, kuten aiemmin kuvattu. Sitten soluja viljeltiin DMEM/F12:ssa ilman fenolipunaista määrätyn ajan. Kun pimonidatsolivastavärjäystä ei käytetty, esikäsittely pimonidatsolilla jätettiin pois.

Viljelyjakson päätyttyä kukin peitinlasi otettiin talteen ja solut kiinnitettiin välittömästi metanoli/asetoni-seoksella (1:1) jäillä, jossa ne pysyivät 30 minuuttia. Pesun jälkeen kahdesti Dulbeccon fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) (D5652, Sigma Aldrich), solukalvoa läpäistiin 30 minuuttia, inkuboitiin 5-prosenttisella naudan seerumialbumiinilla (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) 30 minuuttia ja sen jälkeen seerumittomalla proteiiniblokilla (X0909, DAKO) 10 minuutin ajan. Solut värjättiin ensimmäisellä vasta-aineella ja sen jälkeen toisella, fluoresoivalla vasta-aineella. Luettelo ensimmäisistä vasta-aineista on annettu taulukossa S1. FITC-sian polyklonaalista anti-kanin immunoglobuliinia (F0205, 1:20 laimennus, DAKO) käytettiin ensimmäisenä vasta-aineena, jos isäntä oli kani. Fluoresoivaa vasta-ainetta Alexa Fluor 594 streptavidiini (S11227, 1:500 laimennus, Thermo Fisher Scientific) käytettiin ensimmäisenä vasta-aineena, jos isäntä oli hiiri, jota seurasi biotinyloitu anti-hiiri-IgG (H plus L) (BA{{23} }, 1:1000 laimennus, Vector Laboratories), toisena vasta-aineena. Ydinvärjäys suoritettiin käyttäen bisbentsimidi H 33342 -trihydrokloridia (B2261, Sigma Aldrich) jokaiselle näytteelle.

Fluoresoivat signaalit tarkkailtiin käyttämällä käänteistä fluoresoivaa mikroskooppia BZ-X710 (Keyence Corporation) seuraavilla suodattimilla: Texas Red, jonka viritysaallonpituus (Ex) oli 560/40 nm, emissioaallonpituus (Em) 630/75 nm, GFP ( Esim: 470/40 nm, Em: 525/50 nm) ja DAPI (esim. 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Kuvien kirkkautta ja kontrastia säädettiin käyttämällä BZ-X-analyysiohjelmistoa.

2,5|Kobolttikloridilla käsiteltyjen HK-2-solujen HIF:n ICC

Vaihtoehtoista menetelmää muutettiin tuottamaan peitinlasimalli kobolttikloridilla käsitellyistä HK-2-soluista. HK-2-soluja ympättiin puolikonfluenttitiheydellä (2,5 × 105/malja) peitinlasille päivänä 1 ja niitä käsiteltiin 300 µM kobolttikloridiheksahydraatilla (C 8661, Sigma Aldrich) 16 tunnin ajan. Päivä 2. Päivänä 3 peitinlasi käännettiin ylösalaisin solupintojen kiinnittämiseksi uuden 27 mm:n lasipohjaisen maljan pohjalle 3 tunnin ajaksi, ja suoritettiin HIF:n ICC.

2,6|Western blottaus

HIF{{0}}:n kerääntymisen tutkimiseksi erilaisilla happipaineilla ja eri pH-tasoilla 1.0 × 106 HK-2 solua 10 cm:n viljelymaljaa kohden inkuboitiin joko normoksiassa, 2 % happessa, 1 % happessa tai anoksiassa 5 tuntia tai DMEM/F12:ssa pH:ssa 7,4, pH 6,0 tai pH 5,0 5 tuntia.

Nämä solut hajotettiin RIPA-puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-puskuria (pH 8.{5}}), 150 mM NaCl:a, 0,5 w/v % natriumia deoksikolaatti, 0,1 paino/tilavuus-% SDS ja 1,0 paino/tilavuus-% NP40.

Western blottausta varten SDS-näytepuskuri, joka sisältää {{0}},35 M Tris-HCl:a (pH 6,8), 10 prosenttia SDS:a, 36 prosenttia glyserolia, 0,012 prosenttia bromifenolisinistä ja 0,1 M ditiotreitolia. (DTT) lisättiin proteiineihin. SDS-näytepuskuria sisältävät proteiinit eluoitiin keittämällä 95 asteessa 5 minuuttia.

Proteiinit erotettiin elektroforeesilla 10 % SDS-polyakryyliamidigeeleillä. Proteiinit siirrettiin sitten AmershamTM HybondTM PVDF -kalvolle (10600023, GE Healthcare) siirtopuskurissa (48 mM Tris-emäspuskuri, 39 mM glysiini, 0,04 % SDS ja 20 v/v % metanolia) käyttäen Trans-Blot®-laitetta. TurboTM Transfer System (Bio-Rad). Kalvoja inkuboitiin huoneenlämmössä primääristen vasta-aineiden, anti-HIF1-vasta-aineen (NB100-134, 1:500 laimennus, Novus Biologicals, RRID: AB_350071) ja anti-aktiinivasta-aineen (A2066) kanssa. , 1:2000 laimennus, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), ja sen jälkeen sekundaarisessa vasta-aineessa polyklonaalinen vuohen anti-kanin immunoglobuliini/HRP (P0448, 1:10000 laimennus, DAKO, RRID: AB{{26) }}). Havaitsemiseen käytettiin PierceTM ECL Plus Western Blotting -substraattia (32132, ThermoFisher Scientific). Kemiluminesenssi havaittiin käyttämällä Luminoimage Analyzer ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare) -laitetta. Toistettavuus varmistettiin suorittamalla vähintään kolme riippumatonta koetta. Vyöhykkeiden intensiteetti määritettiin käyttämällä National Institutes of Health ImageJ -ohjelmistoa (Schneider et al., 2012).

2,7|Lusiferaasireportterimääritys

Suoritettiin lusiferaasireportterimääritys HIF1:n kertymisen mittaamiseksi homogeenisessa hypoksisessa viljelmässä. Rakensimme aiemmin merkityn lusiferaasigeenin, jota ohjaa hypoksiaan reagoiva elementti (HRE) ja kehitimme Hypoksia-responsiivisen reportterivektorin (Transgeenikonstruktio). Tämä rakennettiin HRE:n tandemkopioista rotan verisuonten endoteelin kasvutekijägeenistä, joka oli alakloonattu am CMV-promoottori-lusiferaasi-transkriptioyksikön (pre-Luc) 5'-alueelle (Chiang et al., 2011; Tanaka et al. al., 2004).

HK{{0}}-soluja konsentraatiolla 1,0 × 105 per kuoppa valmistettiin 12-kuoppaviljelylevyille (150628, Thermo Fisher Scientific). Solut kotransfektoitiin 500 ng:lla pGL3-Basic HRE-lusiferaasivektoreita ja 30 ng:lla pRL-SV40 Renilla-lusiferaasikontrollivektoreita (Promega) käyttäen 2 µl FuGENE® HD -transfektioreagenssia (E2311, Promega) per hyvin. Negatiivisena kontrollina käytettiin HK-2-soluja, jotka oli transfektoitu yhdessä 500 ng:lla ofpGL3-Perustulikärpäsen lusiferaasivektoreita ja 30 ng:lla pRL-SV40 Renilla-lusiferaasikontrollivektoreita (Promega).

Transfektoituja soluja inkuboitiin normoksiassa, 2 prosentin hypoksiassa, 1 prosentin hypoksiassa tai anoksiapussissa 5 tuntia. Sitten solut kerättiin käyttämällä 100 ui passiivista proteiinin lyysipuskuria kaksoislusiferaasimääritystä varten. Mittauksiin käytettiin LB9507-luminometriä (EG ja Berthold). Transfektion tehokkuuden korjaamiseksi tulikärpäsen lusiferaasin valoyksikön suhteellinen arvo jaettiin Renilla-lusiferaasin arvolla.

cistanche ed

2,8|Apoptoosin analyysi

Viljellyt solut peitettiin peitinlasilla 0 min, 15 min, 30 min, 1 tunnin, 3 tunnin, 6 tunnin ja 24 tunnin ajan, minkä jälkeen ne otettiin talteen trypsiinillä. Solut, joita oli käsitelty 3-prosenttisella vetyperoksidilla (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 30 minuuttia, valmistettiin apoptoottiseksi kontrolliksi. Apoptoosin kvantitatiivinen analyysi suoritettiin käyttämällä Muse Annexin V- ja Dead Cell Kit -pakkauksia (MCH100105, Millipore) Muse™ Cell Analyzer -laitteessa (Millipore) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

2,9|Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR)

RNA:n kokonaisuutto ja cDNA-synteesi suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti RNAiso Plus:lle (9109, Takara) ja PrimeScript™ RT Master Mixille (RR036B, Perfect Real Time) (Takara). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä THUNDERBIRD SYBR qPCR Mixiä (QPS- 201, Toyobo) CFX Connect Real-Time PCR Detection System -järjestelmässä (Bio-Rad). Transkriptitasot normalisoitiin -aktiini-mRNA-ilmentymisen tasolle. qRT-PCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttämällä geenispesifisiä alukkeita. HIF-1 monistettiin käyttämällä eteenpäin suunnattuja, 5'-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3' ja käänteisiä 5'-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3'-alukkeita. -aktiini monistettiin käyttämällä forward-, 5'-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3' ja käänteisiä 5'-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3'-alukkeita.

2.10|Transfektio siRNA:lla

RNAi-indusoidun HIF-1-knockdownin tutkimiseksi HK-2-soluissa valmistettiin 50 × 104 HK-2-solua kuoppaa kohden kuusikuoppaisille levyille. Lipofectamine RNAiMAXin kanssa käytettiin kahdenlaista RNAi:ta – HIF-1 siRNA:ta (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] ja siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]) Transfektioreagenssi (Thermo Fisher Scientific). Negatiivisena kontrollina käytettiin Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113); 1,5 ui kutakin siRNA:ta ja 5 ui RNAiMAXia sekoitettiin. siRNA-transfektoituja soluja inkuboitiin normoksisissa tai hypoksisissa (1 prosentti O2) olosuhteissa 48 tuntia ja RNA uutettiin. HIF-1-knockdownin tehokkuutta tutkittiin käyttämällä qRT-PCR:ää.

2.11|Live-kuvaus PH-gradientin vaikutuksista

Visualisoimme elävien solujen solunsisäisen pH-gradientin peitinlasin alla. Solut käsiteltiin pHrodo Green AM Intracellular pH-indikaattorilla (p35373, ThermoFisher Scientific) valmistajan ohjeiden mukaisesti ennen peitinlasimallin käyttöönottoa. Käänteistä fluoresenssimikroskooppia, BZ-X710 (Keyence Corporation), jossa oli GFP-suodatin, käytettiin tarkkailemaan fluoresenssin intensiteettigradientin aikasiirtymää peitinlasin alla.

2.12|HIF-renkaan kvantitatiivinen analyysi

2.12.1|HIF-renkaan paikka

Mittasimme HIF-renkaiden ja pimonidatsolipositiivisten alueiden etäisyyden peitinlasien reunoista käyttämällä ImageJ:tä seuraavasti. HIF-renkaan ja pimonidatsolipositiivisen ympyrän ulko- ja sisäympyröiden pinta-alat määritettiin ja kunkin ympyrän säde laskettiin. Jokainen arvo vähennettiin 7,5 mm:stä, joka on 15 mm:n peitinlasin säde, sen etäisyyden laskemiseksi peitinlasien reunasta. Kolme riippumatonta HIF:n ICC-koetta suoritettiin kussakin tilassa.

2.12.2|HIF-renkaan määritelmä

Käytimme fluoresoivia kuvia, jotka saatiin peitinlasimallista, jota inkuboitiin normoksiassa ja neutraalissa pH:ssa. Määritimme HIF-renkaan paikan ja sen ulko- ja sisäpuolelle 2,5–3.0 mittakaava (0,22–0,45 mm), 0,5 –1.0 asteikko (1,12–1,35 mm) ja 5.0–5,5 (2,24–2,47 mm) peitinlasien reunasta käyttämällä ImageJ:tä. Mittasimme viisi HIF-1-signaalia näytettä kohden ja laskemme keskiarvon. Kolme riippumatonta HIF:n ICC-koetta suoritettiin.

cistanche-uutejauhe

2,13|Hapen paineen mittaus PLIM-kuvalla

2.13.1|Kalibrointilinjan rakentaminen hapen paineen mittaamiseksi

Kalibrointikäyrä HK-2-soluista tehtiin edellisessä raportissamme kuvatun menetelmän perusteella (Yoshihara et al., 2015). HK-2-soluja, jotka oli ladattu 500 nM BTPDM1:llä 30 minuutin ajan, viljeltiin happipitoisuutta muutettavassa monikaasu-inkubaattorissa, joka oli varustettu käänteisellä fluoresoivalla mikroskoopilla, joka oli kytketty eliniän mittausjärjestelmään. Stern-Volmer-analyyseihin perustuva kalibrointilinja rakennettiin käyttämällä HK-2-solujen fosforesenssin elinikää (PL) useissa eri happijännityksissä käyttäen

Yhtälö (1)

missä τp edustaa PL:tä pO2:ssa, τ0 edustaa PL:tä hapenpoistossa, kq edustaa sammutusnopeusvakiota ja pO2 edustaa hapen osapainetta. Käyttämällä tätä kalibrointilinjaa hapen paine voitiin laskea PL:stä.

2.13.2|PLIM-kuva kansilasimallista

Valmistettiin HK-2-soluja, jotka oli ladattu 500 nM BTPDM1:llä 30 minuutin ajan. Peitinlasimalli rakennettiin ja viljeltiin O2-konsentraatiota säädettävässä monikaasu-inkubaattorissa, joka oli varustettu käänteisellä fluoresoivalla mikroskoopilla, joka oli kytketty käyttöiän mittausjärjestelmään.

PLIM-kuvat tallennettiin käänteisellä fluoresenssimikroskoopilla, joka oli varustettu konfokaalisella skannausjärjestelmällä (Hirakawa et al., 2018). PLIM-kuvat saatiin 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 21 prosentissa 02:ssa tai 4 prosentissa 02:ssa. Neljä PLIM-kuvaa näytettä kohden, ylhäältä, alhaalta, vasemmalta ja oikealta alueelta lähellä peitinlasia, otettiin keskimääräisen PL:n määrittämiseksi, ottaen huomioon PL:n vaihtelut peitinlasissa.

2.13.3|HIF-renkaan tunnistus PLIM-kuvassa

Pimonidatsoli oli positiivinen alle 10 mmHg happipaineessa. 10 mmHg:n hapenpaineen PL-ekvivalentti oli kalibrointiviivan mukaan 4034,6 ns, joten PLIM-kuvan pimonidatsoliympyrän ulkoviiva voitiin tunnistaa. Myöhemmin PLIM-kuvan ulompien ja sisempien HIF-renkaiden paikat voitiin löytää käyttämällä kvantitatiivista etäisyysanalyysiä. Mittasimme HIF-rengasta vastaavien keskimääräisten PL-arvojen vaihteluvälin 21 prosentilla O2:lla ja 4 prosentilla O2:lla.

2.13.4|HIF-renkaan happipaineen mittaus

Laskemme HIF-renkaan happipaineiden alueen PL:istä käyttämällä kalibrointiviivaa. PLIM-kuvat analysoitiin käyttämällä SPCImage 5:tä.0 (Becker & Hickl GmbH).

2,14|Tilastollinen analyysi

Dunnettin testiä käytettiin koe- ja kontrolliryhmien vertailuun, ja arvojen < 0,05="" katsottiin="" osoittavan="" tilastollisesti="" merkittäviä="" eroja.="" kolmen="" tai="" useamman="" ryhmän="" vertaamiseen="" käytettiin="" studentin="" t-testejä="" ja="" käytettiin="" bonferroni-korjattua="" p-arvoa.="" kaikki="" tilastolliset="" analyysit="" suoritettiin="" käyttämällä="" jmp="" pro="" ver13.2.1:tä="" (sas).="" arvojen="" oletettiin="" olevan="" johdettu="" normaalisti="" jakautuneesta="" populaatiosta,="" ja="" ne="" esitetään="" keskiarvona="" ±="" keskihajonta="">

mikä on cistanche

3|TULOKSET

3.1|Happigradientin muodostuminen hypoperfuusiomallissa

Vahvistimme happigradientin olemassaolon hypoperfuusiomallissa, jonka peitinlasien sijoittaminen aiheutti, arvioimalla suoraan happijännitystä käyttämällä fosforesenssia. Fosforesenssin intensiteetin mittauksella voidaan ennustaa hapenpaineen likimääräinen trendi (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Havaitsimme BTPDM1:llä käsiteltyjen HK-2-solujen peittolasimallin fosforesenssin intensiteetin. Fosforesenssin intensiteetin kuvat osoittivat hypoksiaa suurimmalla osalla peitinlasin sisällä olevaa aluetta, mutta ei hypoksiaa lähellä reunaa. Tämä havainto viittasi happigradientin olemassaoloon peitinlasin reunan ympärillä HK-2-soluissa, jotka oli peitetty peitinlasi (kuva 1a). Koska fosforesenssin intensiteetti riippuu koettimen pitoisuudesta ja viritysajasta, fosforesenssin elinajan (PL) mittaus on hyödyllinen hapenpaineen kvantitatiivisessa analyysissä (Yoshihara et al., 2015). Siten viljeltyjen solujen happijännityksen kvantitatiivista mittaamista varten peitinlasin reunan ympärillä saimme PLIM-kuvia HK-2-soluista, jotka oli peitetty peitinlasilla 30 minuutin ajan (kuva 1b). PL laajeni, kun etäisyys peitinlasien reunasta kasvoi. Vahvistimme, että kalibrointiviivalla (kuva S3) laskettu happijännitys pieneni, kun etäisyys peitinlasin reunasta kasvoi, mikä osoittaa happigradientin olemassaolon peitinlasin reunan ympärillä (kuva 1c). Fosforesenssin intensiteetin ajallisen profiilin tarkastelu osoitti, että happigradientti alkoi muodostua 10 minuuttia peitinlasin asettamisen jälkeen

(Kuva 1d).

3.2|Ainutlaatuinen HIF-1-jakauma hypoperfuusiomallissa "HIF-rengas"

Tutkimme HIF{0}}-jakaumaa hypoperfuusiomallissa happigradientilla. HIF-1:n ICC HK-2-soluissa osoitti munkin muotoista parannusta pimonidatsolipositiivisen alueen reunalla, jota kutsuimme "HIF-renkaaksi" (kuva 2a). HIF-1-signaalin intensiteetti oli huomattavasti korkeampi HIF-renkaassa kuin sen sisä- tai ulkoalueilla (kuva 2b). Tämä ilmiö varmistettiin käyttämällä ICC:tä toisella HIF-1-vasta-aineella (kuva S4a) tai muilla tubulaarisilla solulinjoilla (kuva S4b, c). Teimme myös HIF{11}} ICC-analyysin muissa viljellyissä soluissa, kuten HeLa-kohdunkaulansyöpäsoluissa. Vaikka näiden solujen heikko adheesio peitinlasiin teki HIF-1-jakauman yksityiskohtaisen arvioinnin vaikeaksi, havaitsimme munkkimaisen HIF-1-arvon vahvistumisen HeLa-soluissa (kuva S4d).

HIF-rengas ja pimonidatsolipositiivinen alue alkoivat muodostua useita tunteja peitinlasin asettamisen jälkeen, ja HIF-rengas näytti staattiselta 3 tunnin kuluttua (kuva 2c). HIF-1 pudotus johti signaalin HIF-1, mukaan lukien HIF-renkaan, katoamiseen (kuva 2d, kuva S4e), mikä osoitti, että HIF-rengas oli riippuvainen HIF-1:sta.

Tutkiaksemme mahdollisuutta, että HIF-renkaan muodostuminen on riippuvaista hapesta, tutkimme HIF-1:n jakautumista peitinlasimallissa inkuboinnin aikana erilaisilla happijännityksillä. Laitoimme maljan hypoksisiin kammioihin, joissa oli eri happijännitykset heti peitinlasimallin tekemisen jälkeen. Hypoksisen inkubaation aikana havaitsimme, että sekä HIF-rengas että pimonidatsolipositiivinen alue näyttivät laajentuvan ulospäin (kuva 3a). Mittasimme kunkin HIF-renkaan ja pimonidatsolipositiivisen alueen etäisyyden peitinlasien reunasta normoksian, 4 prosentin O2:n ja 1 prosentin O2-inkuboinnin alla. Sekä HIF-rengas että pimonidatsolipositiivinen alue laajenivat ulospäin, kun ympäröivä happijännite pieneni (kuva 3b). Nämä tulokset osoittivat, että HIF-rengas oli riippuvainen HIF{10}}- ja happipaineesta.

Vahvistaaksemme, että munkin muotoinen kertyminen on HIF:n erityinen ilmiö, suoritimme ICC:n talonhoitogeeneillä peitinlasimallissa. GAPDH- ja aktiinisignaalit säilyivät koko peitinlasin alueella ja olivat vertailukelpoisia HIF-renkaan alueen ja muiden alueiden välillä (kuva S5a, b).

3.3|HIF-renkaan hapen painealueen mittaus

Vahvistimme HIF-1-kertymän rengasmaisen lisääntymisen peitelasilla peitetyissä viljellyissä soluissa, mikä on happijännityksestä riippuvainen ilmiö. Happijännityksen alueen määrittämiseksi analysoimme HIF-renkaan hapenpainetta käyttämällä fosforesenssi-elinaikatekniikkaa. Saimme PLIM-kuvia peitinlasimallista 30 minuutin inkuboinnin jälkeen 21 prosentissa O2:ssa tai 4 prosentissa O2:ssa (kuva 4a). HIF-rengas muodostui pimonidatsoliympyrän reunaan HIF:n ICC:ssä (kuvio 3b). Tunnistamme PLIM-kuvan kohdan, joka vastasi pimonidatsolipositiivista aluetta HIF:n ICC:ssä, ja tunnistimme sitten HIF-rengasta vastaavan kohdan (kuva 4b) käyttämällä kvantitatiivista analyysiä HIF-renkaasta ja pimonidatsolipositiivinen alue (kuva 3b). Mittasimme myös HIF-renkaan PL:n alueen ja käytimme sitten kalibrointiviivaa (kuva S3) laskeaksemme HIF-renkaan hapenpaineen 21 prosentissa O2:ta (4,20 [3,46–4,97] ~35,9 [28,5–44,9] mmHg). , ja 4 prosenttia O2:ta (2,19 [0,21–4,32] ~20,4 [17,1–24,1] mmHg) (kuva 4c).

3.4|HIF-1:n kerääntyminen homogeenisen happijännityksen alaisena

Vaikka suojalasimallissa HIF-renkaan ulkopuolella olevat heikot HIF-1-signaalit voidaan katsoa johtuvan riittämättömästä hypoksiasta, renkaan sisällä olevien signaalien, joissa HIF-1 olisi pitänyt aktivoitua voimakkaammin alhaisemman happijännityksen takia, täytyy hapesta riippumaton ilmiö. Selvittääksemme ilmiöitä, jotka aiheuttavat vain hypoperfuusiomallissa HIF-1:n maksimaalisen kerääntymisen puutetta hapettomalle alueelle, tutkimme, oliko happipaineen ja HIF-1:n kerääntymisen välillä käänteinen suhde inkuboinnin aikana. tasaisella happipaineella. Solulysaattien Western blot -analyysi erilaisissa homogeenisissa happipaineissa osoitti HIF-1:n kertymisen lisääntymisen hapettoman inkubaation aikana (kuvio 5a). HRE-lusiferaasireportterimääritys osoitti myös, että HIF-1:n kerääntyminen lisääntyi alhaisemmalla happipaineella homogeenisen happijännityksen olosuhteissa (kuva 5b). Nämä tulokset osoittivat, että HIF-1:n kerääntyminen oli happipaineesta riippuvaista, ja suurin kertymä havaittiin happipitoisuudella. HIF{12}}:n ominaisuuksien tulisi vaihdella hypoperfuusiomallin ja homogeenisen happijännityksen mallin välillä. Arvelimme, että ainutlaatuinen HIF-1-kertymäilmiö tässä hypoperfuusiomallissa saattaa johtua muusta tekijästä kuin happipaineesta.

3,5|HIF-renkaan muodostuminen oli riippumaton tohtorin tutkinnosta

Tutkimme, onko HIF{0}}-hajoaminen, mahdollinen HIF-renkaan muodostumismekanismi, säädelty HIF-renkaan sisällä. Tämä ajatus vaikutti kelpaamattomalta, koska Ph.D:n suorittama hydroksylaatio, HIF:n hajoamisen nopeutta rajoittava prosessi, vaatii happea substraattina. Kobolttikloridia käytetään laajalti kemiallisena HIF-stabilisaattorina. Rakensimme peitinlasimallin kobolttikloridilla käsitellyistä HK-2-soluista ja suoritimme HIF:n ICC-analyysin. HIF-1-signaali ei lisääntynyt HIF-renkaan sisällä, mikä tuli epäselväksi, koska HIF-1-signaali kasvoi renkaan ulkopuolella (kuva 6c). HK-2-solujen ICC, joissa PHD2, jonka uskotaan olevan primaarinen HIF-prolyylihydroksylaasi soluviljelykokeissa, tuotti samanlaisia ​​tuloksia (kuva S6). Nämä tulokset osoittivat, että HIF:n hajoamisen PHD-VHL-akseli ei liittynyt HIF-renkaan muodostumiseen.

3,6|pH:n vaikutus HIF-1:n kertymiseen

Edellisessä raportissa kuvattiin peitinlasimallin käyttöä sydänlihassoluista, joiden pH oli laskenut peitinlasin sisällä (Pitts & Toombs, 2004). Tutkimme peitinlasin alla olevaa pH:ta ja sen vaikutusta HIF-renkaan muodostumiseen. Käsittelimme HK-2 soluja solunsisäisellä pH-indikaattorilla, jonka fluoresenssin intensiteetti mahdollistaa solujen pH:n arvioinnin. Elävä kuvantaminen osoitti, että pH laski suurimmalla osalla sisäaluetta, mutta ei lähellä peitinlasien reunaa, mikä viittaa siihen, että peitinlasimallin reunan ympärillä on pH-gradientti (kuva 6a). Kvantitatiivinen analyysi fluoresenssin intensiteetin ja peitinlasin reunasta olevan etäisyyden välisestä korrelaatiosta osoitti, että entinen nousi etäisyyden kasvaessa, mikä havainto tuki pH- ja happigradienttien olemassaoloa peitinlasien reunan ympärillä (kuva 6b). Solulysaattien Western blot -analyysi homogeenisissa happipitoisuuksissa havaitsi, että inkubointi pH 5,0 -väliaineella tukahdutti HIF-1:n kertymistä hypoksisissa olosuhteissa (kuva S7a–d). Vahvistimme myös, että HIF-1:n kertyminen hypoksiassa erilaisissa pH-olosuhteissa laski alle pH-arvon 6,0 (kuva S8a–c).

Yhdessä raportissa korostettiin lievästi happamien olosuhteiden merkitystä pH:ssa noin 6.0. Tämän tutkimuksen mukaan hypoksian jälkeinen uudelleenhapetus happamoi väliainetta, mikä aiheutti VHL:n nukleolaarisen sekvestroinnin. HIF:n hajoaminen puolestaan ​​estettiin C2C12-myotubeissa, PC12-hermosoluissa ja 786-0 munuaissyöpäsoluissa (Mekhail et al., 2004). Tutkimuksessamme ei tapahtunut muutosta VHL-jakaumassa putkimaisissa soluissa alueiden välillä, joissa HIF-1-kertymä oli, ja alueiden, joilla se oli estynyt, peitinlasimallissa, jonka pH-arvot olivat 50 - 7,4. (Kuva S9a–c). Tubulussolut altistetaan laajalle valikoimalle pH-olosuhteita (Burke et ai., 1999; Pavuluri et ai., 2019; Raghunand et ai., 2003), joten tutkimme HIF-renkaan vaihtelua eri pH:n väliaineissa. arvot välillä 5,0 ja 8,5. HIF-rengas havaittiin selvästi väliaineessa, jonka pH oli 8,5 ja 7,4 (kuvio 6c). HIF-rengas oli olemassa myös pH:ssa 6,5, mutta se oli hämärtynyt (kuvio 6c). HIF-1-signaali vaimeni koko peitinlasin alueella pH:ssa 5,0. (Kuva 6c). Suoritimme lisäkvantitatiivisen analyysin HIF-renkaan ja pimonidatsolipositiivisen alueen reunan välisestä sijaintisuhteesta (kuva 7a) ja havaitsimme, että renkaan sijainti vaihteli pH:n mukaan. Sisäympyrällä oli taipumus laajentua ulospäin pH-arvossa 6,5 ​​verrattuna pH-arvoon 7,4, kun taas ulompi ympyrä kutistui merkittävästi sisäänpäin pH-arvossa 8,5, perustuen pimonidatsolipositiivisen alueen reunaan (kuvio 7b, c). Vahvistimme myös, että taloudenhoitogeenien aktiivisuutta ylläpidettiin peitinlasimallissa happamassa inkubaatiossa (kuva S10). Siksi pH:lla näyttää olevan tärkeä rooli HIF-renkaan muodostumisen taustalla olevassa mekanismissa.

4|KESKUSTELU

Tässä tutkimuksessa tunnistimme HIF-1:n ainutlaatuisen jakautumisen munuaistiehyissä käyttämällä peitinlasin asettamisen aiheuttamaa hypoperfuusiomallia. Havaitsimme, että HIF-renkaan muodostumista ja ylläpitoa säätelevät hapen paine ja pH, jotka molemmat esiintyivät gradientissa peitinlasimallin peitinlasien reunassa. Näiden tulosten perusteella ehdotamme mahdollista HIF-renkaan muodostumismekanismia, jossa HIF-1 kerääntyy happijännityksen pienentyessä ja kertymistä estetään alhaisen pH:n takia tietyllä etäisyydellä peitinlasien reunasta (kuva 8). ).

Hypoperfuusion indusoi CKD:n mikroverisuonten vähentyminen (Mimura & Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). Aiemmassa työssämme käytimme in vivo -kuvausta happigradientin läsnäolon osoittamiseksi normaalien hiiren munuaisten munuaistiehyissä (Hirakawa et al., 2018). Happijännityksen odotetaan myös olevan heterogeeninen CKD:n tubulaarisissa soluissa. On kuitenkin epäselvää, vaikuttaako hypoperfuusion olemassaolo happigradientin kanssa puolustusjärjestelmään hypoksiaa, HIF:ää vastaan. Tässä tutkimuksessa tutkimme HIF-jakaumaa viljellyissä proksimaalisissa tubulussoluissa hypoperfuusiomallilla ja havaitsimme, että viljeltyjen munuaistiehyiden solujen happigradientti mallinnettiin onnistuneesti käyttämällä pyöreää lasia. Todisteet kokeista, joissa käytettiin homogeenista happijännitystä, osoittivat, että HIF-1, jonka hydroksylaatio ja myöhempi hajoaminen ovat pääasiassa hapesta riippuvaisia, kertyi. Tämä on HIF-1:n määrä, joka kasvaa happijännityksen pienentyessä. Peitinlasimallissamme HIF-1 oli kuitenkin tukahdutettu hapettomalla alueella, ja sillä oli suurin kerääntyminen tietyllä etäisyydellä peitinlasien reunasta. Tätä munkin muotoista HIF-kertymää ei ole koskaan aiemmin esitetty. Osoitimme, että HIF-renkaan muodostumista voitiin havaita inkubointiilmakehän happijännityksestä riippumatta, mutta sen sijainti oli riippuvainen happijännityksestä. HIF-renkaan happijännitysalue mitattiin noin 4–20 mmHg:llä käyttämällä PLIM:ää BTPDM1:n kanssa. Useimmat aiemmat tutkimukset, jotka keskittyivät viljeltyihin soluihin ilmakehässä, jossa on homogeeninen happijännite, havaitsivat, että HIF-1-proteiinin määrä kasvoi hypoksisella tai anoksisella alueella (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). Näin ollen mallissamme HIF-renkaan muodostumiseen on täytynyt vaikuttaa muu tekijä kuin happijännitys; se oli riippumaton Ph.D:stä, joka on HIF:n hajoamisen nopeutta rajoittava prosessi. Läpimurto HIF-renkaan muodostumismekanismin selvittämisessä oli havaintomme pH-gradientin ja happigradientin roolista cover-huulimallissa, mikä rajoitti väliaineiden sisäänvirtausta samankaltaisesti kuin in vivo -hypoperfuusio. malli. Tässä hypoperfuusiomallissa solunsisäinen pH laski, kun etäisyys peitinlasin reunasta kasvoi, ja pH-gradientti havaittiin peitinlasien reunan ympärillä. Osoitimme, että HIF-1:n kerääntyminen estyi alhaisessa pH:ssa, noin pH 5,0:ssa, verrattuna inkubaatioon noin neutraalissa pH:ssa homogeenisen happijännityksen alaisena. HIF-renkaan ulkoreuna laajeni ulospäin pH:ssa 6,5 ​​ja HIF-renkaan sisäreuna kutistui sisäänpäin pH:ssa 8,5, perustuen pimonidatsolipositiivisen alueen reunaan. HIF-rengas peittyi happamissa olosuhteissa, ja HIF-1-signaali katosi pH:ssa 5,0. Siten selvitimme pH:n tärkeyden HIF-renkaan muodostumiselle peitinlasimallissa. Osoitimme mahdollisuuden, että HIF-rengas muodostui renkaan sisäisen alhaisen pH:n aiheuttaman HIF-1:n kertymisen estymisestä.

Useat aiemmat peitelasimenetelmällä tehdyt tutkimukset ovat käyttäneet syöpäsoluja. Erään raportin mukaan, jossa käytettiin ihmisen hepatoomasolulinjaa Hep3B, joka ilmentää vihreän fluoresoivan proteiinin (AcGFP1) hapesta riippuvaa punasiirtymää, suorakaiteen muotoisella peitinlasilla peitettyjen solujen elävä kuvantaminen osoitti punasiirtymän, kun etäisyys peitinlasin reunasta kasvoi (Takahashi & Sato, 2010). Hepatoomasolujen emissiospektri siirtyi vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) fluoresenssin aallonpituudesta punaiseen, kun happijännitys pieneni. Toisessa tutkimuksessa SCC-7-solujen happijännitys mitattiin pyöreällä 15-mm peittävällä lasilla käyttämällä fosforesenssielinaikatekniikkaa. Happijännitys oli 6,9 mmHg ja 166 mmHg laskettuna PL:stä, joka oli 3,89 µs ja 893 µs, 0–2 mm peitinlasin reunan sisällä ja 0–1 mm ulkopuolella (Yoshihara et al., 2015). Peitelasimenetelmää on käytetty myös sydämen myosyyttien kanssa, mikä järjestelmä on herättänyt huomiota lupaavana in vivo iskemia-reperfuusiomallina. Kelly ym. osoittivat, että peitinlasilla peitetyissä myosyyteissä tapahtui ajan mittaan merkittäviä morfologisia muutoksia, joihin liittyi muutoksia mitokondrioiden kalvopotentiaalissa ja plasmakalvon dynamiikassa, mikä lopulta johti myosyyttien kuolemaan. He osoittivat myös, että peitinlasilla peitettyjen myosyyttien solunsisäinen pH putoaa nopeasti noin pH-arvoon 4 peitinlasin keskellä (Pitts & Toombs, 2004). Peitelasimalli, joka estää hapen tai ravinnon diffuusiota viljeltyihin soluihin peitinlasin alla, voi jäljitellä iskeemisen, normaalin ja marginaalisen vyöhykkeen in vivo -mallia kansilasin keskellä, ulkopuolella ja reunassa. Useat tutkimukset ovat käyttäneet tätä mallia myosyyttien iskemia-reperfuusiomallina in vitro (Chun et al., 2015; Pitts et ai., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Tietojemme mukaan tutkimuksemme on ensimmäinen, joka soveltaa peitinlasimenetelmää putkimaisiin soluihin. Järjestelmässämme etäisyys peitinlasin reunasta 10 mmHg happijännitystä vastaavaan alueeseen, jossa pimonidatsolin pitäisi kääntyä positiiviseksi, oli 1,22 mm ja happijännitys laski niinkin alhaiseksi kuin nolla 2 mm:n etäisyydellä peitinlasien reunasta. . Tämä tulos voi olla yhteensopiva aikaisempien raporttien kanssa, joissa on käytetty noin 15 mm:n peitelasia, mikä osoittaa happigradientin olemassaolon vähintään 2 mm:n sisällä reunasta (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Tutkimme kansilasien alla olevien solujen apoptoosin nopeutta (kuva S11) ja havaitsimme, että GAPDH ja aktiini säilyivät jopa HIF-renkaan sisällä, mikä osoittaa, että HIF-rengasta ei aiheuttanut vain solujen apoptoosi tai kuolema HIF-renkaan sisällä.

Useissa tutkimuksissa on mitattu munuaisten happipainetta eri menetelmillä. Muutamia esimerkkejä normaalien munuaisten happijännityksen mittaamisesta olivat seuraavat: 50 mmHg ja 30 mmHg aivokuoressa ja ytimessä mikroelektrodeja käyttäen; ja 49 mmHg ja 41 mmHg aivokuoren tubulussolujen S1- ja S2-segmenteissä käyttäen PLIM:ää (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et ai., 2014). Sairaiden munuaisten happipaine olisi pienempi. Aiemman happimikroelektrodeja käyttävän raportin mukaan diabeettisilla rotilla munuaisten parenkymaalinen happipaine oli pienempi: 36 mmHg ja 11 mmHg aivokuoressa (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Koska happimikroelektrodit mittaavat keskimääräistä parenkymaalista happijännitystä, sairaiden munuaisten osalta odotetaan laajempaa vaihteluväliä. Solunsisäinen happipaine laski nollaan mmHg:iin iskeemisen munuaisen mallissa, jonka lateraalinen munuaisvaltimo ja -laskimo oli puristettu (Hirakawa et al., 2015). Nämä löydökset huomioon ottaen HIF-renkaan happijännitysalue, noin 4–20 mmHg, vaikutti uskottavalta in vivo.

Lisäksi havaitsimme, että pH vaikutti HIF-renkaan muodostumiseen sekä happijännitykseen. Koska munuaisten putkimaiset epiteelisolut ovat jatkuvasti alttiina virtsanesteelle, virtsan pH:n tulisi vaikuttaa tubulussolujen pH-arvoon. Ottaen huomioon virtsan laajan pH-alueen, päätimme tutkia soluja, joita inkuboitiin pH-alueella 5.0–8,5. Normaalien munuaisten pH-arvoa on tutkittu. Eräässä tutkimuksessa todettiin, että aivokuoren pH oli 7,39 ± 0.{{10}}8 ja ydin 7,20 ± {{2{{39} }}}.09, mitattuna mikroelektrodeilla (Burke et al., 1999). Toinen tutkimus, jossa käytettiin MRI-pohjaista pH-kuvausta, osoitti pH-arvot 7,3 ± 0,13 ja 7.0 ± 0,29 (Raghunand et al., 2003). On raportoitu, että munuaisten pH laski arvosta 6,5 ​​arvoon 6,32 ja vaikeassa tapauksessa jopa 5,83:een asidoosia sairastavan kroonisen munuaisen taudin hiirimallissa (Pavuluri et al., 2019). Nämä havainnot ovat antaneet todisteita pH:n laskusta ja vaihtelusta CKD:ssä. PH:n vaikutusta kroonisen hypoksian aiheuttamaan HIF-1-arvoon kroonisessa kroonisessa munuaissairaudessa ei ole kuitenkaan tutkittu riittävän hyvin. Tässä tutkimuksessa HIF-renkaan siirtymä havaittiin pH-arvon 6,5 ja pH 7,4 välillä, pH-alue, joka on uskottava kroonisessa taudissa. Tämä tulos tuki hypoteesia, jonka mukaan pH:n lievä lasku vaikuttaa HIF-1:n kertymiseen CKD:ssä. Perustuu todisteisiin pH:n laskusta alle 6,0:n vakavissa kroonisessa munuaissairaustapauksissa, on myös tarpeen arvioida HIF{40}}-fysiologinen tila alhaisemmalla pH:lla. Vaikka on raportoitu, että hapan ympäristö jopa normoksiassa stabiloi HIF-1-arvoa, useimmat näistä raporteista tutkivat lievän happamuuden olosuhteita, joiden pH on yli 6,0 (Filatova et al., 2016; Mekhail et al., 2004) . Tässä työssä osoitimme HIF-1:n kertymisen vaimenemisen tubulussoluissa pH:ssa 5,0 ja HIF-1-signaalien vaimenemisen peitinlasimallissa, jota inkuboitiin pH:ssa 5,0. Siksi munuaisten pH:n lasku CKD:ssä in vivo saattaa korreloida riittämättömään HIF-aktivaatioon sekä ureemisiin toksiineihin hypoksisessa munuaisessa, mikä pahentaa CKD:n etenemistä (Tanaka et al., 2013).

Tutkimuksemme sisältää useita rajoituksia. Ensinnäkin hypoperfuusion alueella viljelyalustan tulee olla ravintoainevajaus hapen puutteen ja alentuneen pH:n lisäksi. pH:n, happijännityksen ja muiden hypoperfuusion aiheuttamien tekijöiden vaikutuksia on kuitenkin vaikea rajata. Kehossa esiintyy elimissä ja soluissa iskemiaa, veren patologista hypoperfuusiota, joka johtuu alhaisen hapen ja vähäisten ravintoaineiden yhdistelmästä. On tärkeää ymmärtää erot hypoksian havaitsemisen ja iskemian havaitsemisen välillä. Huolimatta siitä, että kunkin tekijän biologisen vaikutuksen selvittäminen on vaikeaa, hypoperfuusiomallimme on fysiologisesti uskottava, ja se matkii patologista tilaa in vivo. Toiseksi peitinlasimallin tekeminen vaatii taitoa ja harjoittelua, sillä suurin osa soluista irtosi toisinaan peitinlasia poistettaessa, varsinkin perinteisellä menetelmällä (kuva S2a). Tämä ongelma riippui käytetystä solulinjasta. Esimerkiksi peitinlasimallin levittäminen HEK 293 -kennoille oli meille vaikeaa, koska niiden tarttuvuus peittolasiin oli suhteellisen heikko. Kolmanneksi oli toivottavaa minimoida vauriot viljellyille soluille peitinlasin alla. Vaurioituneiden solujen määrä kasvoi, kun ajanjakso, jonka aikana ne peitettiin, pitenee, kuten apoptoosin analyysi osoittaa. Päätimme, että 3 tuntia oli sopiva HIF-renkaan arvioimiseen, kun se näytti olevan staattinen, ja noin vain 10 prosenttia soluista tuli apoptoottiseksi (kuva S11). Neljäs rajoitus oli vaikeus kiinnittää viljeltyjä soluja peitinlasiin tasaisella tavalla jokaisessa näytteessä (kuva S2b, c). Ero kiinnitysten välillä perinteisen ja vaihtoehtoisen cover-huulimallin valmistustavan välillä on myös voinut vaikuttaa tutkimukseen. Mittasimme HIF-rengasta vastaavan happijännityksen vaihteluvälin fosforesenssin elinkaaritekniikalla, jossa loimme peitinlasimallin perinteisellä menetelmällä. Koska HIF-rengas immunosytokemian aikana visualisoitiin käyttämällä vaihtoehtoista menetelmää, todellinen happijännite voi olla erilainen. Minimoimme nämä virheet käyttämällä todisteita siitä, että pimonidatsoli oli positiivinen 10 mmHg tai sitä pienemmällä happipaineella. Viides rajoitus on, että solunsisäinen pH ei välttämättä ole sama kuin viljelyalustan pH. Useat aiemmat raportit ovat osoittaneet, että solunsisäinen pH on tietyssä määrin yhdenmukainen elatusaineen pH:n kanssa viljellyissä soluissa (Michl et al., 2019), voimme arvioida vain solunsisäisen pH:n suuntausta muuttamalla elatusaineen pH:ta. In vivo solunsisäisten ja solunulkoisten alueiden, kuten virtsan tai kehon nesteen, pH:n välinen suhde on monimutkaisempi kuin viljellyissä soluissa. Siten lisätutkimuksia siitä, miten pH:n muutos säätelee HIF-1-proteiinin kertymistä in vivo, tarvitaan tulevaisuudessa.

Cistanche-etu: paranna munuainentoiminto

Toinen rajoitus on se, että pH:lla pitäisi olla vaikutusta hypoksiamarkkeriin, pimonidatsoliin. Vertailimme pimonidatsolipositiivisen alueen reunan etäisyyttä peitinlasin keskustasta erilaisissa pH-olosuhteissa peitinlasimallissamme. Pimonidatsolipositiivisen alueen reuna oli vertailukelpoinen pH-arvojen 6,5, 7,4 ja 8,5 välillä (kuva S12a, b). Edellinen tutkimus osoitti myös pimonidatsolin sitoutumisen säilymisen eri pH-arvoissa (Kleiter et al., 2006). Näiden todisteiden perusteella päätimme, että pimonidatsoli on sopiva hypoksiamarkkeri peitinlasikokeihimme. Lopullinen rajoitus on se, että kun otetaan huomioon HIF-renkaan noin 4 mmHg - 20 mmHg (0,52 % O2 - 2,6 % O2) happijännitysalue, Pt(II)- ja Pd(II)-porfyriinit, joita käytetään laajalti biologisina happikoettimilla on etuja erittäin alhaisten happipitoisuuksien mittaamiseen, koska niillä on huomattavasti pidemmät fosforesenssin elinajat verrattuna niihin, joissa käytetään Ir(III)-komplekseja (Yoshihara et al., 2017). Kuitenkin yleisesti ottaen kvantitatiivisella happimittauksella, joka perustuu fosforesenssiin, joka on laskettu käyttämällä Stern–Volmer-yhtälöä, on parempi suorituskyky alhaisilla O2-alueilla (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Useat aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että Ir(III)-kompleksipohjainen happipainemittaus on niinkin alhainen kuin noin 10 mmHg (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Siksi uskomme, että HIF-renkaan happijännitysalueen tulisi olla tarkka tulos.

5|PÄÄTELMÄT

Yhteenvetona totesimme, että sekä hapen että pH:n roolin ymmärtäminen on olennaista HIF-1 fysiologisen tilan ymmärtämiseksi kroonisessa munuaissairaussairauksissa, ja se voidaan saavuttaa tutkimalla tubulussoluja hypoperfuusiolla. Peitinlasimalli, jossa on väliaineen sisäänvirtauksen rajoituksia, oli hyvä malli hypoperfuusiolle in vivo, erityisesti CKD:n tubuluksissa, koska peritubulaaristen hiussuonten harveneminen on kroonisen taudin tärkein tunnusmerkki (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Tämä hypoperfuusiomalli voi myös jäljitellä happi- ja pH-gradientteja in vivo, kuten kasvaimia ja iskeemisiä vaurioita. Malli tarjoaa lupaavan lähestymistavan näiden biologisten mekanismien selvittämiseen.

ETURISTIRIITA

Kaikilla kirjoittajilla ei ole eturistiriitoja ilmoitettavana.

TEKIJÄT

Kaikki kirjoittajat osallistuivat kokonaiskonseptin muodostumiseen. TH suoritti yleiset kokeet. TH ja YH analysoivat tulokset ja tekivät luvut. TH kirjoitti alkuperäisen käsikirjoituksen. KM, TY ja ST suorittivat kokeen fosforesenssin eliniän tekniikalla ja muokkasivat osan käsikirjoituksesta. YH, TT ja MN editoivat koko käsikirjoituksen. Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet ja hyväksyneet lopullisen käsikirjoituksen.

VIITE

Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T., & Tobita, S. (2018). Ir(iii) elävien solujen ja silmänpohjan kompleksipohjainen happikuvaus aidatulla ICCD-kameralla. Photochemical and Photobiological Sciences, 17(6), 846–853.

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y., & Hirakata, H. (2019). Enarodustaatti, muunnos- ja ylläpitohoito hemodialyysipotilaiden anemian hoitoon: Satunnaistettu, lumekontrolloitu vaiheen 2b tutkimus, jota seuraa pitkäaikainen tutkimus. Nephron, 143(2), 77–85.

Ameri, K., Burke, B., Lewis, CE ja Harris, AL (2002). Rotan VL30-elementin säätely ihmisen rintasyöpäsoluissa hypoksiassa ja anoksiassa: HIF:n rooli-1. British Journal of Cancer, 87(10), 1173–1181.

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S. ja Watanabe- Akanuma, M. (2016). Aryylihiilivetyreseptorin aktivaatio välittää indoksyylisulfaatin aiheuttaman hypoksian aiheuttaman tekijäriippuvaisen erytropoietiinin ilmentymisen suppressiota. American Journal of Physiology. Cell Physiology, 310(2), C142–C150.

Burke, TJ, Malhotra, D., & Shapiro, JI (1999). Tekijät, jotka ylläpitävät pH-gradienttia munuaisissa: verisuonirakenteen rooli. Kidney International, 56(5), 1826–1837.

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ ja Macip, S. (2014). HIF-1alfa-transkriptiotekijän rooli lisääntyneessä solun jakautumisessa fysiologisissa happipaineissa. PLoS One, 9(5), e97938.

Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T., … Yu, KHP (2019) ).

Roxadustat anemiaan potilailla, joilla on munuaissairaus, jotka eivät saa dialyysihoitoa. New England Journal of Medicine, 381(11), 1001–1010.

Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., Hän, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

H. (2017). Vaiheen 2 tutkimukset suun hypoksian aiheuttamasta tekijän prolyylihydroksylaasi-inhibiittorista FG-4592 anemian hoitoon Kiinassa. Nephrology, Dialysis, Transplantation, 32(8), 1373–1386.

Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T., & Nangaku, M. (2011). Indoksyylisulfaatti, edustava ureeminen toksiini, estää erytropoietiinin tuotantoa HIF-riippuvaisella tavalla. Laboratory Investigation, 91(11), 1564–1571.

Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H. ja Moon, IS (2015). Glukoosi-insuliini-kaliumliuos suojaa vastasyntyneiden rottien kammioiden myosyyttejä in vitro peitinlasi-iskemia/reperfuusiomallissa. Korean Circulation Journal, 45(3), 234–241.

Coyne, DW, Goldsmith, D. ja Macdougall, IC (2017). Uusia vaihtoehtoja kroonisen munuaissairauden anemiaan. Kidney International Supplement, 7(3), 157–163. suudelma.2017.09.002

Deng, A., Arndt, MA, Satriano, J., Singh, P., Rieg, T., Thomson, S. et al (2010). Munuaisten suoja kroonisessa munuaissairaudessa: hypoksian aiheuttama tekijäaktivaatio vs. angiotensiini II:n salpaus. American Journal of Physiology. Renal Physiology, 299(6), F1365–F1373.

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK ja Acker, T. (2016). Asidoosi vaikuttaa HSP90:n kautta Ph.D./VHL-riippumattomasti edistäen HIF:n toimintaa ja kantasolujen ylläpitoa glioomassa. Cancer Research, 76(19), 5845–5856. VOI-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S., & Heyman, SN (2006). Akuutti krooninen munuaisten vajaatoiminta rotilla: toiminnallinen kompensaatio ja hypoksiatoleranssi. American Journal of Nephrology, 26(1), 22–33.

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S., & Khamaisi, M. (2013). Miksi diabetes mellitus on kontrastin aiheuttaman nefropatian riskitekijä? BioMed Research International, 2013, 123589.

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P., Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., & Nangaku, M. (2018). Munuaiskuoren intravitaalisen fosforesenssin elinikäinen kuvantaminen mittaa tarkasti munuaisten hypoksian. Kidney International, 93(6), 1483–1489.

Hirakawa, Y., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2017). Munuaisten hypoksia CKD:ssä; Patofysiologia ja havaitsemismenetelmät. Fysiologian rajat, 8, 99.